A kórokozó-specifikus útvonalak keresztmodulációja fokozza az alultápláltságot az enterális bélfertőzés során Giardia lamblia és enteroaggregatív Escherichia coli

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, formális elemzés, finanszírozás megszerzése, módszertan, projekt adminisztráció, erőforrások, felügyelet, validálás, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

kórokozó-specifikus

Az Észak-Karolinai Egyetem Orvostudományi Tanszékének Fertőző Betegségek Osztálya, Chapel Hill, Chapel Hill, Észak-Karolina, Amerikai Egyesült Államok, Gyomor-bélrendszeri Biológiai és Betegségközpont, Orvosi Tanszék, Észak-Karolinai Egyetem, Chapel Hill, Chapel Hill, Észak-Karolina, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, formális elemzés, módszertan, projekt adminisztráció, erőforrások, hitelesítés, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - ellenőrzés és szerkesztés

A fertőző betegségek és a nemzetközi egészség tagságának osztálya, Orvostudományi Tanszék, Virginia Egyetem, Charlottesville, Virginia, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, hivatalos elemzés, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Számítógépes és Rendszergyógyászat tagsági osztálya, Sebészeti és Rák Tanszék, Imperial College London, Egyesült Királyság

Szerepek Konceptualizálás, források, írás - áttekintés és szerkesztés

A fertőző betegségek és a nemzetközi egészség tagságának osztálya, Orvostudományi Tanszék, Virginia Egyetem, Charlottesville, Virginia, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, források, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

A Virginia Egyetem Orvosbiológiai Mérnöki Tanszéke, Charlottesville, Virginia, Amerikai Egyesült Államok

A fertőző betegségek és a nemzetközi egészség tagságának osztálya, Orvostudományi Tanszék, Virginia Egyetem, Charlottesville, Virginia, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek írása - áttekintés és szerkesztés

Gyermekkori fertőző betegségek tagsági osztálya, Richmond Gyermekkórház, Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Adatmegőrzés, vizualizáció

Fertőző betegségek tagsági osztálya, Orvostudományi Kar, Észak-Karolinai Egyetem, Chapel Hill, Chapel Hill, Észak-Karolina, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek ellenőrzése, megjelenítés

Gasztrointesztinális biológiai és betegségügyi központ, Észak-Karolinai Egyetem Orvostudományi Tanszék, Chapel Hill, Chapel Hill, Észak-Karolina, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Konceptualizálás, írás - áttekintés és szerkesztés

Gasztrointesztinális biológiai és betegségügyi központ, Észak-Karolinai Egyetem Orvostudományi Tanszék, Chapel Hill, Chapel Hill, Észak-Karolina, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Konceptualizálás, írás - áttekintés és szerkesztés

Georgetown Egyetem, Biológiai Tanszék, Washington, DC, Amerikai Egyesült Államok

Szerepkörök, írás - áttekintés és szerkesztés

A Virginia Egyetem Orvostudományi Mérnöki Tanszéke, Charlottesville, Virginia, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Konceptualizálás, források, írás - áttekintés és szerkesztés

Számítógépes és Rendszergyógyászat tagsági osztálya, Sebészeti és Rák Tanszék, Imperial College London, Egyesült Királyság

Szerepek konceptualizálás, finanszírozás megszerzése, módszertan, projekt adminisztráció, források, felügyelet, írás - eredeti tervezet, írás - áttekintés és szerkesztés

A fertőző betegségek és a nemzetközi egészség tagságának osztálya, Orvostudományi Tanszék, Virginia Egyetem, Charlottesville, Virginia, Amerikai Egyesült Államok

  • Luther A. Bartelt,
  • David T. Bolick,
  • Jordi Mayneris-Perxachs,
  • Glynis L. Kolling,
  • Gregory L. Medlock,
  • Edna I. Zaenker,
  • Jeffery Donowitz,
  • Rose Viguna Thomas-Beckett,
  • Allison Rogala,
  • Ian M. Carroll

Ábrák

Absztrakt

Szerző összefoglalása

Az alultáplált gyermekek több szekvenciális és gyakran perzisztens enteropatogéneknek vannak kitéve. A bél mikrobiális rendellenességei és gyulladásai közismerten hozzájárulnak az alultápláltság patogeneziséhez, de nem ismert, hogy a kórokozók hogyan lépnek kölcsönhatásba egymással, a rezidens mikrobiotával vagy a gazdával. A Giardia lamblia és az enteroaggregatív Escherichia coli enterális koinfekciójának új modelljének felhasználásával fehérjehiányos táplálékkal etetett egerekben azonosítjuk a gazda növekedését és a bél immunválaszait, amelyeket differenciálisan közvetítenek a kórokozó-mikroba interakciók, ideértve a parazita által közvetített változásokat a bél mikrobájában. a gazdaszervezet metabolizmusa és az együttfertőzés során megváltozott immunválasz. Adatmodellünk, hogy a korai élet kumulatív enteropatogén expozíciója hogyan befolyásolja fokozatosan a bél immunitását és a gazdaszervezet anyagcseréjét a kritikus fejlődési időszakokban. Ezen túlmenően a koinfekciós modellben végzett vizsgálatok új betekintést tárnak fel a patogenitás környezeti és mikrobiális determinánsaiba a jelenleg elterjedt, de rosszul ismert enteropatogének, például a Giardia lamblia esetében, amelyek esetleg nem felelnek meg az egyetlen kórokozó által tervezett modelleken alapuló mikrobiális patogenezis meglévő paradigmáinak.

Idézet: Bartelt LA, Bolick DT, Mayneris-Perxachs J, Kolling GL, Medlock GL, Zaenker EI és mtsai. (2017) A kórokozó-specifikus utak keresztmodulációja fokozza az alultápláltságot a Giardia lamblia és az enteroaggregatív Escherichia coli enterális koinfekciója során. PLoS Pathog 13 (7): e1006471. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006471

Szerkesztő: P'ng Loke, New York University, AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Fogadott: 2017. január 13 .; Elfogadott: 2017. június 14 .; Közzétett: 2017. július 27

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: Ezt a tanulmányt részben a Nemzeti Egészségügyi Intézetek támogatták, az Országos Allergia- és Fertőző Betegségek Intézete, K08-AI108730 (LAB), U19-AI109776 (RLG) és AI-109591 (SMS) támogatás [https: //www.niaid.nih .gov], Nemzeti Diabétesz, Emésztési és Vesebetegségek Intézete P30-DK034987 támogatás (Az Észak-Karolinai Egyetem Gasztrointesztinális Biológiai és Betegségközpontja, Chapel Hill (Microbiome Core and Histology Core)), [https: // www .niddk.nih.gov] és az Országos Általános Orvostudományi Intézet # 108501 (GLK, GLM és JP) [https://www.nigms.nih.gov/Pages/default.aspx]. Ezt a tanulmányt részben a Bill és Melinda Gates Alapítvány OPP-1066140 és OPP 1137923 (RLG) támogatása is támogatta [http://www.gatesfoundation.org]. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: Elolvastam a folyóirat politikáját, és a kézirat szerzőinek az alábbi érdekei vannak: a LAB ideiglenes tanácsadója volt a Lupine Pharmaceuticals-nak, 2015. június - december.

Bevezetés

Annak megválaszolására, hogy az alultápláltság bélben történő mikrobiális adaptációja miként alakul ki a kumulatív enteropatogén terhekkel a gazdaszervezet növekedésének, a nyálkahártya immunválaszainak és az anyagcserének a befolyásolására, kifejlesztettünk egy új integrált modellt a fehérje-alultápláltság által kiváltott mikrobiális rendellenességekről és multi-patogén enteropátiáról. Az alultáplált gyermekeknél gyakran kimutatott kórokozókat, a G. lambliát és az EAEC-t kiválasztottuk érdeklődésre számot tartó kórokozóként. Az alultápláltsághoz hozzájáruló új kórokozó-specifikus utak azonosítása mellett bemutatjuk a nyálkahártya immun- és anyagcsere-válaszainak együttes modulációját, amelyek konvergálva rontják a gazda növekedését. Ezenkívül a bél mikrobiális közvetítésű proteolízise felerősödött az egyre pazarlóbb gazdaszervezetben, valamint az energiaszabályozó és a kompenzációs anyagcsere útvonalaiban bekövetkező ko-metabolikus adaptációk kimerülése.

Eredmények

A Giardia legyőzi a mikrobiota által közvetített kórokozó-kiürülést a fehérje alultápláltsága alatt, és a fehérje alultápláltsággal kombinálva elősegíti a növekedés károsodását, a vékonybél 16S bőségét és a megváltozott nyálkahártya immunitást

Az egér bélmikrobiota differenciálisan megakadályozhatja a tartós Giardia lamblia kolonizációt még T és B-sejt hiányos gazdákban is. Így mi és más kutatók folyamatos antibiotikumokat (ampicillint, vankomicint, neomicint) (Abx) alkalmaztunk ivóvízben a G. lamblia fertőzés fokozására [18–21]. Ennek az Abx koktélnak a felhasználásával korábban azt publikáltuk, hogy a G. lamblia (Assemblage B, H3 törzs ciszták) a 18S kicsi riboszomális alegység qPCR-jével kimutatható leválasztást eredményez 10 4 -10 5/gramm székletben az első 5–7 napon belül. kihívás (korai fertőzés). De ellentétben a G. lamblia (Assemblage A, WB trophozoites törzs) fertőzés utáni kiürüléssel, a G. lamblia H3 leadása

30-szorosára) és erőteljesen megnőtt a társfertőzés (

80-szoros). Az IL-9 szignifikánsan megemelkedett Giardia mono-fertőzöttekben és

20-szoros mértékben együttfertőzött egerekben, a hajlam nagyobb IL-4 és IL-13 felé. Mindegyik csoport kimutatta az IFNγ csökkenését, amely szignifikáns volt az EAEC mono-fertőzött egerekben. A CCL5 emelkedett (

Kétszer) EAEC-fertőzött és társfertőzött egerekben. Az EAEC-fertőzött egerek myeloid sejtjeinek korai terjeszkedésével összhangban a CXCL8 (IL-8/KC) szintén emelkedett az EAEC és az együttfertőzött egerekben (

1,6-szoros). A CCL11 (eotaxin) egyedülállóan emelkedett (

A proteolízis bél mikrobiális gazdasejt-metabolitjainak Giardia-indukálta változásai fennmaradtak (4-HPA-szulfát, IAG), vagy átfedésben voltak (PAG, 4-CG, 4-CS) az önmagában az EAEC-fertőzés során tapasztaltakkal, és ezek a metabolitok még tovább nagyítva együttfertőzött egerekben (4E. ábra). Azonban az EAEC által közvetített TMA és TMAO növekedés (4E. Ábra), amely mikrobiális függő kolin lebontásra utal, megfordult Giardia együttfertőzött egerekben (4E. Ábra), és csak a Giardia fertőzés kolin metabolizmusának metabolikus zavarára emlékeztetett (4. ábra). 4E). Hasonlóképpen, a fokozott taurin kiválasztás Giardia-fertőzött egerekben együttfertőzés révén is fennmaradt (4E. Ábra). Bár bármelyik fertőzés fokozta a lipid-oxidációt, ami nyilvánvaló a megnövekedett β-oxidációs bomlástermékekben (hexanoilglicin, butirilglicin és izovalaril-glicin), valamint a β-oxidációs útvonal prekurzor acetil-karnitin, az együttfertőzés során az anyagcsere elmozdult a β-oxidációtól, amit a csökkenés jelez. acetil-karnitinben és a downstream β-oxidációs metabolitokban. Ezzel párhuzamosan az együttfertőzés a kreatin: kreatinin arány inverziójához vezetett, ami az izom anyagcseréjének megváltozására utal, önmagában bármelyik fertőzéshez képest (4E. Ábra). Végül a gazda energiakiadás-adaptációit a nikotinamid útvonalon keresztül (NMND és NAO) önmagában a Giardia fertőzés során (4E. Ábra) az EAEC együttfertőzés után (4E. Ábra) leállítottuk.

Vita

Mód

Etikai nyilatkozat

Ez a tanulmány magában foglalta az egerek használatát. Ezt a vizsgálatot szigorúan az Országos Egészségügyi Intézet laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatójában foglalt ajánlásoknak megfelelően végezték el. A protokollt a Virginia Egyetem Nemzetközi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá (Állattenyésztési és Használati Bizottság Protokoll száma: 3315). A szövetbeszerzést altatás (ketamin-hidroklorid és xilazin) és a méhnyak elmozdulását követően végeztük el, és minden erőfeszítést megtettünk a szenvedés minimalizálására.

Állatok és alultápláltság

Valamennyi kísérletet elválasztott hím C57Bl/6 egerekkel végeztük, amelyeket a Jackson Laboratories-tól kaptunk 3 hetes korban. Az egereket vagy fehérjehiányos étrenden (PD; 2% fehérje, Harlan Laboratories vagy Research Diets) vagy izokalorikus kontroll étrenden (CD; 20% fehérje, Harlan Laboratories vagy Research Diet) kezdték az érkezés napjától számított három napon belül (az élet 24 napja). ). Az összes kísérlethez az egereket véletlenszerűen súlycsoportokba soroltuk, és a kísérlet időtartama alatt kísérleti étrenden folytattuk. A folyamatos antimikrobiális szereket kapó egerek ampicillint (1 mg/ml, Fischer), vankomicint (1 mg/ml, Novaplus) és neomicint (1,4 mg/ml, Durvet) kaptak ivóvízben ad libitum vagy ötnaponta megváltoztatva. A sorozat tömegét 1–7 naponként kaptuk az érkezésektől a kísérlet befejezéséig. A fertőzést követően minden másnap székletet gyűjtöttek [18].

Giardia lamblia és enteroaggregatív Escherichia coli készítmények

Gerbillel passzált, tisztított G. lamblia H3 (Assemblage B) cisztákat a Waterborne, Inc.-től (New Orleans, LA) szereztünk be. A cisztákat mostuk és PBS-ben hígítottuk, és az érkezéstől számított 48 órán belül felhasználtuk. Minden fertőzött egér 10 4 -10 6 ciszta oltóanyagot kapott. A G. lamblia H3 trophozoitákat szintén a Waterborne, Inc. cégtől szereztük be, és módosított TYI-S-33 táptalajban tartottuk az inokulum előkészítése előtt (107/egér), a korábban leírtak szerint [18]. Az EAEC 042 törzset eredetileg a virginiai egyetemen, James Natarótól szerezték be. Minden kísérlethez külön-külön 10 9/egér oltóanyagot növesztettünk a glicerinből, amelyet -80 ° C-on tartottunk, és előállítottunk magas glükózszintű DMEM-tápközegben, az előzőekben leírtak szerint [17]. Az összes kórokozó készítményt jégen tartottuk, amíg szájon át történő adagolással 22 ul-os etetőtűvel 100 μl térfogatban adagoltuk. A nem fertőzött kontrollokat hasonló módon 100 μl PBS-sel (Giardia esetében) vagy DMEM magas glükózszintű (EAEC esetében) kontrollal kezeltük.

A Giardia trophozoiták ex vivo felsorolása

Az eutanázia idején a vékonybél 4 cm-es szegmenseit a pylorus záróizomtól kezdve 0,5 cm-re eltávolítottuk, és jégen 30 percig 4 ml hűtött PBS-be helyeztük. A trofozoitákat invertált mikroszkóppal azonosítottuk, és hemacitomerre számoltuk, amelynek kimutatási határa 10 4 trophozoit/ml volt.

DNS kivonás kórokozó és mikrobiota kimutatására

A székletből és/vagy a bélszövetből származó DNS-t kiolvasztott mintákból extraháltuk a QIAmp DNS székletkészlet (Qiagen) segítségével, a korábban leírtak szerint [18]. A 16S rRNS gének kimutatásához a kimutatás gazdagítására szolgáló módosítások, beleértve a homogenizálás további lépéseit a gyöngycsövekben (UltraClean fekáliás DNS gyöngycsövek, Mo Bio Laboratories) 400/360μL ASL/ATL pufferben, Mini-Beadbeater segítségével 1 percig, 30/40 μl proteináz K széklet/szövet homogenizátumokhoz és a szövetek 56 ° C-on történő inkubálása két órán át [70].

Valós idejű polimeráz láncreakció Giardia lamblia és az EAEC mennyiségi meghatározásához és a baktériumcsoport célpontjaihoz

Az ebben a vizsgálatban használt géncélok listáját az S1 táblázat tartalmazza. Valamennyi qPCR-vizsgálat esetében az adott célra vonatkozó standard görbe soros hígítást hajtottunk végre minden lemezen, validálás céljából. Egy futtatás csak akkor tekinthető érvényesnek, ha a BioRad CFX Detection System 90–110% -os hatékonyságot és r 2> 0,98 korrelációt észlelt. A lemezen kísérleti (azaz fertőzött állati ürülék DNS) és kontrollokat (azaz nem fertőzött állati ürülék DNS-t) futtattunk. A nem specifikus amplifikációk ellenőrzéséhez minden lemezen egyetemesen alkalmaztak egy sablon nélküli kontrollt.

Giardia lamblia és az EAK

Az összes baktérium, a firmicutes, a bakteroidetes és az Enterobacteriacea 16S mennyiségi meghatározása

Teljes 16S V3-V4 könyvtár kvantifikáció, Illumina szekvenálás és adatelemzés

20 000) azonos szélességű (0,00055 ppm). A 4,50–5,00 közötti régiókat eltávolítottuk annak érdekében, hogy minimalizáljuk a tökéletlen vízelnyomás okozta kiindulási hatások hatását. Ezután minden spektrumot egységnyi területre normalizáltunk. A többváltozós modellezést a Matlab-ban házon belüli szkriptek segítségével hajtották végre. Ez magában foglalta a főkomponens-elemzést (PCA), pareto skálázást és ortogonális vetítést látens struktúrák-diszkrimináns elemzéshez (OPLS-DA) felhasználva, amelyet egységvariancskálázás alkalmazásával állítottak össze. Az OPLS-DA modelleket a modell értelmezésének elősegítése céljából hoztuk létre. Itt 1H NMR spektroszkópiai profilokat használtunk leíró mátrixként, és osztályváltozatot (pl. Giardia, EAEC, nem fertőzött) válaszváltozóként. A modell prediktív teljesítményét (Q 2 Y) 7-szeres keresztellenőrzési módszerrel számolták ki, és a modell érvényességét permutációs teszteléssel (1000 permutáció) állapították meg [16]. A páros OPLS-DA modellek sorozatához tartozó metabolitokat a korrelációs együttható (R) és az osztály tagsága alapján azonosítottuk, és hőtérképben foglaltuk össze.

Áramlási citometria lamina propria sejtekhez és luminex citokin és kemokin profilokhoz

A nyálkahártya citokin- és kemokinválaszaihoz 0,5–1,0 cm ileumot az eutanázia idején azonnal folyékony nitrogénbe helyeztünk, és felhasználásig -80 ° C-on tároltunk. A fehérjét ileum-lizátumokból gyűjtöttük, amelyeket 50 mM HEPES-t, 1% Triton X-100 és Halt proteáz gátlót tartalmazó lízispufferrel készítettünk jégen, és cirkónium-gyöngyökben (Biospec) homogenizáltunk egy Mini-Beadbeater (Biospec) alkalmazásával 60 másodpercig. A tisztított felülúszókat -80 ° C-on tároltuk. A multiplex fehérje mennyiségi meghatározását a Virginia Egyetem Biomolecular Core létesítményének Luminex 100 IS rendszerével végeztük.

Vakbél/széklet gyulladásos marker mérése

Statisztikai analízis