A krónikus ER stressz enyhítése a p38-Ire1-Xbp1 útvonalon és az inzulinhoz társuló autofágia révén C. elegans neuronokban

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
ORCID rekord Mei Ding számára
Levelezés céljából: lyguan @ genetics.ac.cnmding @ genetics.ac.cn

Absztrakt

Az ER stressz számos fiziológiai és kóros állapotban fordul elő. Kiemelkedő kérdés azonban, hogy az intakt organizmus specifikus sejtjeiben hogyan enyhíti a krónikus ER stresszt. Itt az UNC-9 (koordinálatlan) réspontú fehérje túlexpresszálása a C. elegans neuronokban életkorfüggő és sejt-autonóm módon váltja ki az Ire1-Xbp1 által közvetített stresszválaszt. A p38 MAPK PMK-3 az IRE-1 foszforilezésére hat a krónikus stressz szabályozására. A rés junction fehérje túlexpresszálása szintén aktiválja az autofágia működését, és az inzulin útja autofágia révén működik, az ER chaperonokat kódoló gének transzkripciója révén azonban nem, hogy ellensúlyozza a p38-Ire1-Xbp1 által közvetített stressz választ. Ezek az eredmények együttesen egy bonyolult sejtes szabályozó hálózatot tárnak fel a krónikus stresszre adott válaszként a többsejtű szervezet sejtjeinek egy részében.

Szerző összefoglalása A kibontakozott fehérjék felhalmozódása kiváltja az ER stressz választ (UPR), amely lehetővé teszi a sejtek számára, hogy mind fiziológiai, mind kóros körülmények között harcolhassanak a fehérje expressziójának ingadozásai ellen. Súlyos akut ER stresszválaszok kiválthatók gyógyszeres kezeléssel. Ilyen intenzív ER stressz azonban ritkán fordul elő minden sejttípusban in vivo. Itt egy genetikai rendszert terveztünk a C. elegans fonálféregben, amely lehetővé teszi számunkra, hogy specifikus sejtekben ER stresszt indukáljunk, gyógyszeres kezelés vagy bármilyen más külső inger nélkül, majd figyelemmel kísérjük a stressz reakciót. Ezt a rendszert használva genetikai szűrők azonosították, hogy a p38 MAPK közvetlenül az UPR IRE-1-XBP-1 ágán keresztül hat a stresszreakció elősegítésére. Eközben az inzulinreceptor autofágia-aktivációval működik, hogy ellensúlyozza a p38-IRE-1-XBP-1 útvonalat. Ezek az eredmények együttesen egy bonyolult sejtes szabályozó hálózatot tárnak fel a multicelluláris organizmus krónikus stresszére adott válaszként.

Bevezetés

A szekrécióra vagy a membránokba való beillesztésre szánt fehérjék kibontott formában kerülnek az endoplazmatikus retikulumba (ER), és általában csak azután távoznak, miután elérték natív állapotukat. A normál működés során egy szekréciós sejt drámai eltéréseket tapasztalhat az új fehérjék áramlásában az ER-jén keresztül, reagálva a kereslet változásaira. A szekréciós fehérjeszintézis és az ER hajtogatási képessége közötti egyensúly megbomlása aktiválja a szétnyílt fehérjeválasz (UPR) nevű jelzőhálózatot a homeosztázis fenntartása érdekében [1]. Az UPR csökkenti a fehérje transzlációját, növeli az ER kaperonok és enzimek expresszióját a fehérje hajtogatásának megkönnyítése érdekében, és megtisztítja a rosszul összehajtott fehérjéket a lebomlás érdekében [1]. A kiterjedt vagy elhúzódó UPR aktivitás azt jelzi, hogy a rosszul összehajtott fehérjék felhalmozódása felülmúlta az UPR kompenzációs mechanizmusait, és apoptotikus válasz váltható ki [2]. Ezzel szemben a rák bizonyos típusai az UPR protektív szerepét használják gyors növekedésük fenntartása érdekében [3, 4]. Ezért az UPR a sejtkörnyezettől függően akár apoptotikus végrehajtóként, akár citoprotektorként is szolgálhat.

A makroautofágia (a továbbiakban autofágia) egy sejtbontási folyamat, amelyet a stressz hatására indítottak el. Megpróbálja helyreállítani a metabolikus homeosztázist a citoplazmatikus organellumok vagy citoszolos komponensek lizoszomális lebontásával [14]. Az autofágia megköveteli az autofágia-rokon (Atg) fehérjékként ismert konzervált fehérjék magkészletét, amelyet az autofagoszóma nevű organella közvetít [15]. Az autofagosomális membránok az ER-ből, a Golgi-komplexből, a mitokondriumból, az endoszómákból és a plazmamembránból származnak [16, 17]. A fagofórnak nevezett autofagoszóma prekurzor szerkezet kialakulása és tágulása során a citoszolos anyagot és a sérült szubcelluláris organellákat befogják és bezárják. Ezután a teljes zárt autofagoszóma a lizoszómákkal összeolvadva autolizoszómává válik, amelyen belül a tartalma lebomlik és újrafeldolgozódik. Az autofágia ER stressz körülmények között aktiválódik, és az autofágia közvetítő komponenseinek sokaságát UPR célgénekként azonosították, és fontosak a sejtek számára a súlyos ER stressz túlélése szempontjából [18, 19].

Eredmények

A DD/VD idegsejtekben található UNC-9 felesleges: GFP váltja ki az ER stressz választ

A C. elegans-ban a D-típusú motoros idegsejtek, köztük 6 DD és 13 VD, a GABAerg neuronok összessége, amelyeknek a ventrális idegzsinór mentén eloszlottak a sejttestei, valamint a ventrális zsinór mentén és a hátsó zsinórra egyaránt vetülõ neuronfolyamatok [25 ]. az unc-25 a GABA bioszintetikus glutaminsav-dekarboxiláz enzimet kódolja [26]. A Punc-25 promótert használtuk a GFP (zöld fluoreszcens fehérje) -fuzionált rés junction fehérje UNC-9 specifikus túlexpresszálására DD/VD idegsejtekben. Az ektopikusan expresszált UNC-9: GFP pontszerűen oszlik el a DD/VD idegsejtek neuronfolyamatai mentén és a sejttest régiójában (1A. És 1B. Ábra). Ezzel szemben a CRISPR-Cas9 technikával létrehozott UNC-9: GFP knock-in (KI) vonal pontszerű mintázatot mutat az idegsejt folyamatokon és a sejtfelületen, de nem a DD/VD sejttest régiójában (1C ábra ). A különféle szubcelluláris rekeszeket jelölő markerekkel végzett kettős festés nagyon kevés átfedést mutatott ki az ektopikus UNC-9: GFP puncta és az ER marker CYTB-5.1: mCherry vagy a Golgi mCherry: MANS marker között (1B ábra). Ehelyett az UNC-9: GFP szignál nagy része eloszlott a plazmamembránon (együtt lokalizálva a Myr: mCherry-vel), a korai endoszómákon (együtt lokalizálva az mCherry: RAB-5-szel) és a késői endoszómákon vagy lizoszómákon. (együtt lokalizálva az mCherry: RAB-7-szel) (1B ábra).

(A) A Punc-25 promoter által hajtott UNC-9: GFP (zöld) DD/VD neuronokban expresszálódik. Az egyes DD/VD sejttesteket * jelöli, és szaggatott vonalak veszik körül. A méretarány 10 µm-t jelent. (B) Az UNC-9: GFP (zöld) szubcelluláris lokalizációja a DD/VD sejttest régióiban. Az ER-t, a Golgi-t, a plazmamembránt, a korai endoszómákat és a késői endoszómákat/lizoszómákat a CYTB-5 jelöli: mCherry (piros), mCherry: MANS (piros), Myr: mCherry (piros), mCherry: RAB-5 (piros) és mCherry: RAB-7 (piros). Az egyes DD/VD sejttesteket * jelöli, és szaggatott vonalak veszik körül. (C) Az endogén szinten kopogtatással (KI) expresszált UNC-9: GFP eloszlik a DD/VD neuronok (csillagok) neuronfolyamatain és sejtfelszínén. A (B) és (C) skála 5 um-ot jelent. (D) A Phsp-4: mCherry (piros) expressziós szintje megemelkedik DD/VD-kben. A fehér nyilak a DD/VD kompressziókat jelzik. A csillagok a DD/VD sejttesteket jelzik. A „-” jelöli azokat a sejteket (koelomocitákat), amelyeket a Phsp-4: mCherry következetlenül kiemel. A méretarány 25 µm-t jelent. (E) Phsp-4: mCherry (piros) jelet a Punc-25: UNC-9: GFP (zöld) expresszáló sejtekben indukálunk. A méretarány 5 µm-t jelent.

Annak tesztelésére, hogy az UNC-9 túlzott expressziója DD/VD-ben kiváltja-e az ER stresszválaszát, megvizsgáltuk egy riporter expresszióját, amely mCherry-t tartalmaz a hsp-4 gén promoteréhez fuzionálva. A hsp-4 az ER chaperone protein Bip féreghomológját kódolja, és transzkripcióját erősen indukálja a stresszválasz [9]. Méhen kívüli UNC-9: GFP hiányában a Phsp-4: mCherry széles, de gyengén oszlik el több szövetben (S1A ábra). Amikor az UNC-9: GFP-t túlzott mértékben expresszálták DD/VD idegsejtekben, azt tapasztaltuk, hogy az mCherry szignál semmilyen más idegsejtben vagy más szövetben nem növekedett (S1A és S1B ábra). Ehelyett a Phsp-4: mCherry-t specifikusan indukálták a DD/VD idegsejtekben (1D. És 1E. Ábra). Több mint 60 idegsejt van, sejttestük a ventrális zsinór mentén oszlik el [25]. Amint az 1D. Ábrán látható, a Phsp-4 csak a 19 DD/VD neuron (18 ± 0,7, N = 22) (S1B ábra) kompresszióit (fehér nyilak) és sejttesteit (csillagokat) tudta egyértelműen megjeleníteni: mCherry jel. A kettős jelöléses elemzés azt is megerősítette, hogy az mCherry jelet specifikusan együtt osztották el a Punc-25 promoter által vezérelt UNC-9: GFP-expresszáló sejtekkel (S1B ábra és 1E ábra).

Az IRE1-XBP1 UPR ág szabályozza a túlzottan expresszált UNC-9: GFP szubcelluláris lokalizációját az idegsejtekben

(A) A Punc-25 promóter által vezérelt UNC-9: GFP (zöld) eloszlása különböző UPR mutánsokban. (B) Az UNC-9: GFP lokalizációs hibájának számszerűsítése különböző UPR mutáns állatokban. N = 20 minden genotípusnál; *** P Az IRE-1-XBP-1 UPR elágazat sejtvédő szerepe stressz körülmények között. (A) Az ire-1 (v33) állatok progresszív UNC-9: GFP (zöld) lokalizációs hibája vad típushoz képest. A skálasávok 5 µm-t képviselnek. Szaggatott vonalak veszik körül a DD/VD sejttesteket. Az egyes DD/VD sejteket szaggatott vonalak veszik körül. A csillagok normál sejteket jeleznek. A fehér nyilak a hibás sejtekre mutatnak. (B) A DD/VD sejtek számszerűsítése különböző genotípusokban. Az egyes genotípusoknál N-t jelölünk.

(A) Az ire-1 (v33) állatok progresszív UNC-9: GFP (zöld) lokalizációs hibája vad típushoz képest. A skálasávok 5 µm-t képviselnek. Szaggatott vonalak veszik körül a DD/VD sejttesteket. Az egyes DD/VD sejteket szaggatott vonalak veszik körül. A csillagok normál sejteket jeleznek. A fehér nyilak a hibás sejtekre mutatnak. (B) A DD/VD sejtek számszerűsítése különböző genotípusokban. Az egyes genotípusoknál N-t jelölünk.

Ezután megvizsgáltuk, hogy az UPR tartós kudarca a DD/VD idegsejtekben vezet-e sejthalálhoz. A Punc-25: mCherry markerrel körülbelül 17 DD/VD idegsejtet lehetett egyértelműen azonosítani vad típusú állatokban (3B. Ábra). Hasonló számú DD/VD-t figyeltünk meg, amikor az UNC-9: GFP felesleg volt jelen (3B. Ábra), ami arra utal, hogy a funkcionális UPR rendszer képes életben tartani a sejteket ER stressz körülmények között. Ezzel szemben az ire-1 vagy az xbp-1 eltávolításakor a DD/VD teljes száma jelentősen csökkent (3B. Ábra). Nevezetesen, a csökkent sejtszám csak stressz körülmények között fordul elő. Sem az ire-1, sem az xbp-1 mutáció nem okozott neuronvesztést az UNC-9: GFP feleslegének hiányában (3B. Ábra). Az ire-1 vagy xbp-1 gén vad típusú kópiájának bevezetése a DD/VD-kbe jelentősen megmentette az ire-1 vagy xbp-1 mutáns állatok neuronvesztését (3B. Ábra). Ezért az IRE1-XBP1 által közvetített stresszválasz jótékony hatással van az elhúzódó krónikus stressz során in vivo.

pmk-3 szükséges az ER stresszválaszhoz

(A) A Phsp-4: mCherry expresszió (vörös) redukcióját az ire-1 vagy az xbp-1 mutánsokban a daf-2 nem menti fel. (B) A phsp-4: mCherry (vörös) részleges redukcióját pmk-3 mutánsokban a daf-2 nem gátolja. A csillagok a DD/VD sejttesteket jelzik. Az (A) és (B) skála 25 µm-t jelent. (C) Az mCherry: LGG-1 (piros) eloszlása UNC-9: GFP hiányában vagy jelenlétében DD/VD idegsejtekben. A méretarány 5 µm-t jelent. (D) Az mCherry: LGG-1 puncta számának meghatározása a DD/VD sejttest régióiban. Az egyes genotípusoknál N-t jelölünk. (E) Az UNC-9: GFP (zöld) puncta részlegesen lokalizálódik az mCherry: LGG-1-vel (piros). A méretarány 5 µm-t jelent. A csillagok a DD/VD sejttesteket jelzik. (F) Az mCherry: LGG-1 puncta számának meghatározása DD/VD sejt testrégiókban, különböző genotípusokban. Az egyes genotípusoknál N-t jelölünk. (G) Az éhezéses kezelés részben elnyomja az ire-1 mutáns fenotípust. A különböző UNC-9: GFP (zöld) eloszlási mintákat a DD/VD sejttest régióban színes dobozok jelzik. Az egyes genotípusoknál N-t jelölünk. (H) UNC-9: GFP eloszlás vad típusú és lgg-1 mutáns állatokban. A méretarány 25 µm-t jelent.

Az autofágia egy katabolikus mechanizmus, amely rosszul összehajtott fehérjéket és sérült organellákat juttat le lebontás céljából. Ezután azt kérdeztük, hogy az autofágia részt vesz-e a daf-2 szuppresszióban. Először megvizsgáltuk, hogy az UNC-9: GFP túlzott expressziója indukálta-e az autofágiát a DD/VD-kben. Az unc-25 promoter által vezetett mCherry-jelölt LGG-1 (C. elegans ortholog of the yeast autophagy protein Atg8) segítségével megvizsgáltuk az autofágia aktivitását DD/VD neuronokban. UNC-9: GFP hiányában az mCherry: LGG-1 diffúzan oszlik meg az idegsejtek folyamata mentén, és a sejttest régiójában jellemzően kevesebb, mint 4 mCherry: LGG-1 puncta található (7C. És 7D. Ábra). Amikor az UNC-9: GFP túlexpresszálódott, az mCherry: LGG-1 puncta száma drámai módon megnőtt mind a sejttest régiójában (több mint 10 puncta), mind a DD/VD idegsejtjeinek idegsejtjeiben (7C. És 7D. Ábra), ami arra utal, hogy autofágia indukálódott. Ezenkívül az UNC-9: GFP puncta felesleg szorosan szomszédos vagy részben átfedi az mCherry: LGG-1 jelet (7E. Ábra). Ez azt jelzi, hogy az UNC-9 fehérje feleslege autofágia által közvetített lebomláson megy keresztül. Pmk-3, ire-1 vagy xbp-1 hiányában a DD/VD-kben bekövetkezett autofágia-indukció drámai módon csökkent (7D. Ábra), ami arra utal, hogy a p38-IRE1-XBP1 útvonalra van szükség a felesleges UNC által kiváltott autofágia indukcióhoz. -9: GFP.

Vita

Az exogén vagy rendellenesen rosszul összehajtott fehérjék neuronokban történő felhalmozódása hozzájárul a neurodegenerációval járó patológiához. Az ER stresszt a neurodegenerációval összekapcsoló molekuláris események megértéséhez mélyebb ismeretekre van szükség az ER homeosztázis alapjául szolgáló mechanizmusokról, beleértve azt is, hogy a specifikus idegsejtekben in vivo hogyan aktiválódik a gén transzkripció és hogyan szabályozódik az autofágia.

Az ER stresszre reagálva az ER chaperone gén transzkripcióját az IRE-1/XBP-1 útvonal aktiválja [37]. Valóban, ha a férgeket tunicamicinnek vagy ditiotreitolnak (DTT) vagy hősokk okozta globális fehérje-hibásodásnak teszik ki, a hsp-4 promoter által vezérelt GFP riporter erősen indukálódik a szövetek és sejtek széles körében [9, 38]. . A pánneuronális ER stressz a hsp-4 expressziót sejttől függetlenül is kiváltja a bélben és a hypodermisben [39]. A korábbi megfigyelésekkel ellentétben az UNC-9: GFP túlzott expressziója DD/VD motoros neuronokban csak DD/VD sejtekben indukál ER stresszt. A C. elegans 302 neuront tartalmaz, és a Punc-25 promoter az UNC-9: GFP túlzott expresszióját kevesebb, mint 30 neuronra korlátozza (főleg DD és VD neuronokra). Noha a korlátozott hatás mögött álló részletes mechanizmusok továbbra is megfoghatatlanok, lehetséges, hogy az idegrendszeri ER stressz szélessége vagy súlyossága határozza meg, hogy a stresszválasz átterjedhet-e a szomszédos szövetekre.

Anyagok és metódusok

C. elegans genetika

DNS-konstrukciók és transzgén állatok

Az unc-25 promotert inszertáltuk a pSM-GFP vektor BamHI és SphI helyei közé (Dr. Kang Shen nagylelkű ajándéka), az UNC-9 cDNS-t pedig a BamHI helyre. Az xbp-1, az ire-1 és a pmk-3 cDNS-eket reverz transzkripcióval amplifikáltuk. Az ER stressz riporter Punc-25: XBP-1us: mCherry plazmidot XB3 plazmidból módosítottuk (nagyvonalú ajándék Dr. Christopher Rongo-tól). A Punc-25: cytb-5.1: mCherry-t Dr. Yingchuan Qi szívesen szolgáltatta. Punc-25: mCherry: MANS, Punc-25: mCherry: RAB-7, Punc-25: mCherry: RAB-5 és Punc-25: mCherry: LGG-1 a rekombinációs módszer. Transzgénikus állatokat állítottunk elő a korábban leírtak szerint [59]. Integrált törzseket UV-besugárzással kaptunk. A Phsp-4: mCherry kifejező BCN1071 törzset Ben Lehner kérte. Valamennyi integrált transzgénikus állatot legalább háromszor kereszteztük. A megfelelő transzgéneket az S2 táblázat tartalmazza.