A krónikus, magas zsírtartalmú étrend szív hipertrófiát és fibrózist vált ki egerekben

Zhi Wang

1 Aneszteziológiai Tanszék, Virginia Egyetem, Charlottesville, Virginia

2 Aneszteziológiai Osztály, Sun Yat-Sen Emlékkórház, Sun Yat-Sen Egyetem, Guangzhou, Guangdong, Kína

Liaoliao Li

1 Aneszteziológiai Tanszék, Virginia Egyetem, Charlottesville, Virginia

Huijuan Zhao

1 Aneszteziológiai Tanszék, Virginia Egyetem, Charlottesville, Virginia

Shenging Peng

2 Aneszteziológiai Osztály, Sun Yat-Sen Emlékkórház, Sun Yat-Sen Egyetem, Guangzhou, Guangdong, Kína

Zhiyi Zuo

1 Aneszteziológiai Tanszék, Virginia Egyetem, Charlottesville, Virginia

Absztrakt

Háttér

Az elhízás kóros elváltozásokat okozhat a szervekben. Meghatároztuk a krónikus, magas zsírtartalmú étrend (HFD) és az időszakos éhgyomor, a szervek védelmét biztosító paradigma hatását az egér szívére.

Mód

Hét hetes CD1 hím egereket véletlenszerűen osztottak be kontroll, HFD és intermittáló éhomi csoportokba. A kontroll egerek szabadon hozzáférhettek a rendszeres étrendhez (RD). Az intermittáló éhomi csoportba tartozó egereknek minden második nap RD-t biztosítottak. A HFD csoportba tartozó egerek szabadon hozzáférhettek a HFD-hez. Bal kamrájukat 11 hónappal azután követték el, hogy ezen étrendben részesültek.

Eredmények

A HFD növelte a kardiomiocita keresztmetszeti területét és a fibrózist. A HFD csökkentette az aktív kaszpáz 3-at, az apoptózis markert és az autofágia marker mikrotubulusokkal társult 1A/1B-könnyűlánc 3 (LC3) II/LC3 I arányát. A HFD növelte a foszfo-glikogén szintáz kináz-3β (GSK-3β) szintet a Ser9-nél, ami a GSK-3β gátlás jele. A HFD-vel táplált egerekben megnövekedett a 4-es nukleáris GATA-kötő fehérje és az igen asszociált fehérje, két olyan GSK-3β-t célzó transzkripciós faktor, amely hipertrófiával kapcsolatos génexpressziót indukálhat. Az intermittáló éhgyomorra eső egereknél ezek a változások nem voltak, kivéve a megnövekedett aktív kaszpáz 3-t és az LC3II/LC3I csökkent arányát.

Következtetések

Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a krónikus HFD szívizom hipertrófiát és fibrózist indukál, amelyeket a GSK-3β gátlás közvetíthet.

1. Bemutatkozás

Az elhízás egyre nagyobb egészségügyi veszélyt jelent a világon. Az USA-ban a felnőttek körülbelül egyharmada és 20% -a tizenéves elhízott [1,2]. A magas zsírtartalmú étrend (HFD) bevitele hozzájárul az elhízás emeléséhez az amerikaiaknál [3]. Az elhízás jelentős anyagcserezavarral, beleértve a hiperlipidémiát is társul, és patológiát válthat ki a különféle szervekben [4–6]. Például a HFD 6 hónapos táplálása myocardialis hypertrophiát indukál egerekben [7]. Ennek a hipertrófiának a mechanizmusai azonban még nem teljesen ismertek.

Javasolták a glikogénszintáz kináz-3β (GSK-3β) szerepét az öregedés és a nyomás túlterhelés okozta szívizom hipertrófiában [8,9]. A GSK-3β képes foszforilezni a β-katenint, amely a β-katenint indukálja ubiquitációra és lebontásra. Mivel a β-catenin indukálhatja a miokardiális hipertrófia génjeinek expresszióját, a β-catenin GSK-3β általi fokozott lebomlása csökkenti ezen hipertrófiát indukáló gének, például az igen asszociált fehérje (YAP) expresszióját [10,11]. Ezenkívül a GSK-3β negatívan szabályozhatja a GATA-kötő 4-es fehérjét (GATA4), egy hipertrófiás markert és transzkripciós faktort [12]. Így a GSK-3β fontos szerepet játszhat a HFD által kiváltott miokardiális hipertrófiában.

Az apoptózis és az autofágia fiziológiai körülmények között fordul elő. Az apoptózis a túlzott sejtek eltávolításának egyik módja. Az autofágia a károsodott fehérjék és organellák megtisztításának folyamata. Az apoptózis és az autofágia kritikus szerepet játszanak a fiziológiás sejtkörnyezet fenntartásában [13,14]. Nem ismert, hogy a HFD befolyásolja-e ezt a két folyamatot a szívben. Megjegyzendő, hogy a GSK-3β képes szabályozni az apoptózist és az autofágiát [15,16].

Ebben a tanulmányban kezdtük el 7 hónapos egerek HFD-vel való táplálását 11 hónapig, a kamaszkori elhízás szimulálása céljából. A vizsgálatba szakaszos éhgyomri egerek csoportját vonták be. Ez az oka annak, hogy korábbi tanulmányunk kimutatta, hogy az intermittáló böjt javította a tanulást, a memóriát és az agy szerkezetét [6]. Az időszakos böjt szintén sejtvédelmet nyújt és javítja a testtűrést [6,17]. Egyelőre nem tudni, hogy ez az etetés hatással van-e a szívizom hipertrófiájára vagy a fibrózisra. Így tanulmányunkat úgy terveztük meg, hogy meghatározzuk a HFD és az intermittáló koplalás hatásait a szívizom hipertrófiájára és fibrózisára, valamint a GSK-3β lehetséges szerepét ezekben a hatásokban.

2. Anyagok és módszerek

Az összes kísérleti protokollt a Virginia Egyetem (Charlottesville, VA) intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyta jóvá. Valamennyi állat- és kísérleti eljárást a Laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó Országos Egészségügyi Intézet útmutatójának (NIH 80–23. Kiadványok) szerint hajtották végre, amelyet 1996-ban módosítottak.

2.1. Állatcsoportok

Amint azt korábban leírtuk [6], hét hetes hím CD-1 vad típusú egereket véletlenszerűen soroltunk be kontroll, intermittáló éhomi és HFD csoportba. A kontroll egerek szabadon hozzáférhettek a rendszeres chow-hoz (4,5% kalória a zsír által biztosított; teljes energia biztosított: 4,14 kcal/g) (rágcsáló-étrend # 5010, Ralston-Purina Co., St. Louis, MO). Az időszakos böjt csoportba tartozó egerek minden második nap ingyenesen hozzáférhettek a rendszeres rágcsálnivalóhoz, a másik napon pedig nem ettek ételt. A HFD csoportba tartozó egerek szabadon hozzáférhettek a magas zsírtartalmú táplálékhoz (a kalória 45% -a a zsír által biztosított; teljes energia biztosított: 4,73 kcal/g) (D12451, Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ). Valamennyi állat folyamatosan szabadon hozzáférhetett a vízhez. Úgy döntünk, hogy 45% zsírtartalmú étrendet alkalmazunk, mert ez az összetétel tipikus nyugati étrendet képvisel [18].

2.2. Szív betakarítása

Az egereket mély érzéstelenítésben, izofluránnal (Sigma-Aldrich, St Louis, MI, USA) feláldoztuk. A szíveket középső thoracotomiával gyorsan kivágták és normál sóoldattal öblítették. A szíveket rövid ideig szűrőpapírral tisztítottuk, hogy felszívja a felszíni vizet, majd lemérjük. A pitvari szívizomot és a jobb kamrai szívizomot eltávolítottuk. A bal kamrák egy részét 4% -os foszfáttal pufferolt paraformaldehidbe helyeztük, a bal kamra többi részét fagyasztottuk száraz jéggel hűtött izopantánban, és -80 ° C-on tároltuk, amíg nyugati elemzésre nem használták őket.

2.3. Szövettan és morfometrikus elemzés

A kamra közepén lévő 2 mm-es szeletet összegyűjtöttük és paraffinba ágyazottuk. Az 5 µm-es sorozatot metszettük és hematoxilinnal és eozinnal vagy Masson-féle trichrommal festettük (Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA). A myocyták keresztmetszeti területét és a fibrózis területének arányát a teljes látómezőben 5 véletlenszerűen kiválasztott mezőben értékeltük minden szakaszban. Az egyes szívszeletekből húsz meghatározást (5 megtekintési mező × 4 szakasz) átlagoltunk az egyes egerek értékeinek ábrázolására. Valamennyi eredményt kvantitatív morfometriával kaptuk a National Institutes of Health Image 1.60 (NIH, Bethesda, MD, USA) felhasználásával, ahogy azt korábban leírtuk [19].

2.4. Immunfluoreszcencia

Deparaffinizálás és antigén visszaszerzés után 5 µm vastag szakaszokat inkubáltunk a nyúl monoklonális anti-β-catenin antitesttel (1: 200 hígítás; katalógusszám: 8480; Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA), a nyúl poliklonális anti- mikrotubulusokhoz kapcsolódó fehérje 1A/1B-könnyűlánc 3 (LC3) A/B antitest (1: 200 hígítás; katalógusszám: 4108; Cell Signaling Technology Inc.) és a nyúl monoklonális hasított anti-hasított kaszpáz-3 (Asp175) antitest (1: 200 hígítás; katalógusszám: 9664; Cell Signaling Technology Inc.) egy éjszakán át 4 ° C-on. Miután foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) alaposan átmostuk, a metszeteket fluorokrómmal konjugált szamár nyúlellenes IgG Northern Lights 557 másodlagos antitestekben inkubáltuk (1: 200 hígítás; katalógusszám: NL004; R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) ) 1 órán át szobahőmérsékleten. Ezután a metszeteket Hoechst 33342-vel festettük (1: 5000 hígítás; katalógusszám: 62249; Thermo Scientific, Brookfield, WI). Desztillált vízben mostuk, mielőtt a Vectorshield rögzítő közeggel (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia) fedéllel csúsztattuk volna őket. Higanyégővel és szűrőkészlettel ellátott Olympus BX51 epifluoreszcens mikroszkóp (modell: U-LH100-3, Olympus Optical Co., LTD, Tokió, Japán) az északi fény 557 (piros) és a Hoechst 33342 (kék) fluoreszcencia detektálására, a metszetek immunfestésének vizsgálatára használtuk.

2.5. Western blot elemzés

2.6. Teljes RNS extrakció és valós idejű PCR

Amint azt korábban leírtuk [20], az összes RNS-t extraháltuk a bal kamrákból egy RNeasy mikrokészlet (Qiagen, Valencia, CA) alkalmazásával, majd DNáz-emésztéssel a genomi DNS-szennyeződés kiküszöbölésére. A valós idejű PCR-hez szükséges primereket a Primer Express 3.0 szoftver (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) felhasználásával tervezték. Az alapozók a következők voltak: YAP: előre, 5'-GAAGGAGAGACTGCGGTTGAA-3 'és hátramenet, 5'-TGGCTGCGCAGAGCTAATTC-3'; β-katenin: előre, 5′-AACTTGCTCAGGACAAGGAGG-3 ′ és hátramenet, 5′-CGTATGTTGCCACGCCTTCA-3 ′.

A valós idejű PCR-t az ABI Prism 7900HT szekvencia detektáló rendszer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) alkalmazásával hajtottuk végre. Egyetlen PCR-terméket határozunk meg minden transzkriptum amplifikálásával és a disszociációs görbe elemzésével a 7900HT szekvencia detektáló szoftveren keresztül. A GAPDH és az aktin háztartási gének PCR-jét is lefuttattuk minden cDNS-mintához. Az egyes mintákban az mRNS relatív mennyiségét az összehasonlító küszöbciklusos módszerrel ellenőriztük, majd a háztartási gének mennyiségére normalizáltuk.