A lymphagenában a kollagén és az elasztin állapotának értékelése multifoton mikroszkóppal

Ön a kiválasztott tartalom gépi fordítását kérte adatbázisunkból. Ez a funkció kizárólag az Ön kényelmét szolgálja, és semmiképpen sem az emberi fordítás helyettesítésére szolgál. Sem a SPIE, sem a tartalom tulajdonosai és kiadói semmilyen kifejezett vagy hallgatólagos kijelentést vagy szavatosságot nem vállalnak, és kifejezetten kizárnak, ideértve korlátozás nélkül a fordítási szolgáltatás funkcionalitására vagy a fordítás pontosságára vagy teljességére vonatkozó kijelentéseket és garanciákat. a fordításokat.

A fordításokat a rendszer nem őrzi meg. Ennek a szolgáltatásnak a használatára és a fordításokra a SPIE webhely használati feltételeiben foglalt minden felhasználási korlátozás vonatkozik.

2019. december 18

Viktor V. Nyikolajev, 1,2 Ekaterina A. Sandykova, 2,3 Oksana S. Kurochkina, 4 Denis A. Vrazhnov, 1,2 Natalia A. Krivova, 2 Yury V. Kistenev, 2,4 Elena S. Sim 2, 3

1 Erőfizikai és Anyagtudományi Intézet (Orosz Föderáció)
2 Nemzeti kutatás Tomszki Állami Univ. (Orosz Föderáció)
3 Szibériai Állami Orvosi Univ. (Orosz Föderáció)
4 Mikrosebészeti Intézet (Orosz Föderáció)

Mentse el a könyvtáramba

VÁSÁRLJA MEG EZT A TARTALmat

FELIRATKOZZON A DIGITÁLIS KÖNYVTÁRRA

50 letöltés 1 éves előfizetésenként

25 letöltés 1 éves előfizetésenként

EGYES CIKK VÁSÁRLÁSA

Tartalmazza a PDF-et, a HTML-t és a videót, ha elérhető

A kétfotonos mikroszkópia módszereit széles körben alkalmazzák a biológiai tárgyak, különösen a bőr vizsgálatakor, mivel a tárgyak mind a felszínen, mind a mélységben vizsgálhatók anélkül, hogy további fluoroforokat vonzanának az endogén autofluoreszcencia miatt. Ebben a cikkben az AF jel és az SHG jel képelemzésének módszereit alkalmazzák a bőr állapotának felmérésére a lymphedema kialakulása során. Kimutatták, hogy az egészséges szövetek és a lymphedematous csoportjai esetében a SAAID eloszlás hisztogrammjai segítségével a szövetekben bekövetkező változások kimutathatók.

BEVEZETÉS

A limfödéma a nyirokrendszer krónikus, progresszív betegsége, amely az elégtelen nyirokkeringéssel és az azt követő magas fehérjetartalmú intersticiális folyadék felhalmozódásával jár, ami gyulladáshoz, a zsírszövet hipertrófiájához és visszafordíthatatlan szerkezeti károsodású fibrózis terjedéséhez vezet. 1 A gyakorlatban úgy néz ki, mint az érintett szövetek duzzanata. A lymphedema a nyirokcsomókat, a dermist és a bőr alatti szöveteket érinti.

A lymphedema diagnózisának számos módszere létezik, amelyek többnyire az ödéma vagy a víz bekövetkezésének megbecsülésére összpontosulnak. Az optikai mikroszkópia lehetővé teszi a finom szöveti szerkezet variációinak detektálását, ami nagyon hasznos a lymphedema diagnosztizálásához.

Az egyfoton kölcsönhatással történő szöveti megjelenítés folyamata általában a fókuszon kívüli fellángolásra korlátozódik; ezt a korlátot nagyrészt túllépi a konfokális mikroszkópia, a fókusz fotonok kiszűrésére szolgáló pontnyílás alkalmazásával.

Kétfoton gerjesztés alkalmazásával háromdimenziós optikai szakaszok készíthetők membrán nélkül a fókuszsík felett és alatt lévő területeken, kétszer akkora hullámhossz miatt, mint a konfokális mikroszkóppal.

A kétfoton gerjesztés jelensége elméletileg körülbelül egy évszázaddal ezelőtt alakult ki, de kísérletileg csak a lézerek megjelenése után igazolta. A kétfoton gerjesztés akkor következik be, amikor két foton egyidejűleg elnyelődik egyetlen kvantum eseményben. Ebben az esetben az egyidejűség olyan eseményekre utal, amelyek közötti intervallum nagyon kicsi, körülbelül 10-18 másodperc. Annak biztosítása érdekében, hogy elegendő számú foton egyidejűleg abszorbeáljon, a fotonok sűrűségének milliószor nagyobbnak kell lennie, mint az egyfoton abszorpció esetén. Tehát nagy teljesítményű lézerekre van szükség ahhoz, hogy elegendő kétfoton fluoreszcenciát hozzanak létre. Ezenkívül a kétfoton folyamatok több harmonikus előállításának tulajdonságával bírnak, különös tekintettel a második harmonikus keletkezés (SHG) hatására, amely lehetővé teszi az adott objektumok további vizsgálatát.

A betegségek diagnosztizálására szolgáló módszerek, amelyek többfoton mikroszkópián alapulnak, nem befolyásolják a sugárzás tárgyát, és lehetővé teszik a képek valós idejű, mikronos felbontású megszerzését is. 2,3,4

A kétfoton mikroszkópos módszereket széles körben alkalmazzák a biológiai tárgyak, különösen a bőr vizsgálatakor, mert az ilyen tárgyakat nemcsak a felszínen, hanem a mélységben is tanulmányozni lehet anélkül, hogy csak az endogén autofluoreszcencián keresztül vonzanak további fluoroforokat. Tehát a bőr és a derma papilláris rétegének tanulmányozása során lehetőség van az endogén elasztin-fluoroforok vizualizálására autofluoreszcencia (AF) és kollagén felhasználásával második harmonikus generációval, azaz a dermis fő komponenseivel, amelyek aránya felelős a bőr állapota. 5,6 A kapott adatok elemzésének másik módja a kollagén dezorganizáció mértékének tanulmányozása. Mivel a második harmonikus lehetővé teszi a kollagén vizualizálását, lehetővé válik a kollagén dezorganizációjának értékelése. Amint azt fentebb megjegyeztük, a szövetekben a kollagén térszerkezetének rendezetlensége számos betegség, köztük a lymphedema biomarkere. Különféle megközelítéseket tárgyaltak a kollagén dezorganizációjának értékelésére. 7,8

A szövetszerkezet értékelésének másik módja a fluoreszcencia-életkori képalkotó mikroszkópia (FLIM) használata. Ez a megközelítés lehetővé teszi több fluorofor molekula térbeli eloszlásának szimultán értékelését. 9,10 Például a FLIM biztosítja a NADH és FAD tartalom mérését. 11.

Ez a cikk az AF és az SHG jelképalkotás képességét tárgyalja a bőr állapotának felmérésére a lymphedema kialakulása során.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Az első lépés a lymphedema modell kidolgozásához kapcsolódott. 30 fejet használtunk 8-10 hetes Wistar patkányoktól (súlya 200-250 g). A patkányokat a Tomszki Állami Egyetem Biológiai és Biofizikai Intézetének elszigetelt, szellőztetett viváriumi helyiségében tartottuk. A szobahőmérsékletet 20 ± 2,0 ° C-on tartottuk, a levegő páratartalma 60% volt (és 12 órás fény/12 órás sötétség körülményei). Valamennyi állatot megjelöltük, és 7 napig karanténban tartottuk 5 patkány számára, ugyanabban a ketrecben, szabad hozzáféréssel a vízhez és az élelemhez (standard táplálék patkányoknak). Valamennyi kísérleti eljárást a Bizottság jóváhagyta a Tomszki Állami Egyetem etikai szabályairól. A lymphedema kialakulásának modelljeként a 12. hivatkozásban leírt technikát alkalmazták. Ez a technika a poplitealis csomópont reszekcióján alapszik az állat egyik mancsán, a második mancsot a kontrollhoz használták.

A méréseket MPTflex többfoton mikroszkópon (1. ábra) kétfoton mikroszkópon (Jenlab, Németország) végeztük. A készülék térbeli felbontása körülbelül 1 μm az XY sík mentén és ∼ 2 μm a Z tengely mentén. A lézer hullámhossza 760 nm volt, a letapogatási mélységet 0 és 110 μm között választották. Az AF és SHG jelek adatait 512x512 pixeles tömbön rögzítettük, a szkennelési terület mérete 70x70 μm.

1.ábra.

MPTflex mikroszkóp, készítette: JenLab (Németország).

A zajkomponens hatásának csökkentése és az adatok kiértékelésének pontosságának növelése érdekében a kapott képek blokkokra osztását használtuk. A kép blokkokra osztási sémáját a 2. ábra mutatja, ahol l a kép képpontjainak száma, h a blokkban lévő pixelek száma. A partíciót nem metsző blokkokba használtuk, így ugyanazt a területet kétszer nem vettük figyelembe. Az alacsony intenzitású blokkokat leszűrtük.

2. ábra.

Példa az AF és az SHG térbeli eloszlására az egészséges szöveteknél (a), példa a kép blokkokra bontására (b).

Az SHG intenzitása és a dermis SHG-AF öregedési indexe (SAAID) egy nem invazív objektumparaméter a kollagén állapotának meghatározására a dermisben, amely felhasználható az öregedés leírására a bőr különböző területein - vivo, 13, és lehetővé teszi a sérült vagy patológiás bőr felderítését is. 14 A SAAID indexet a képlet határozza meg

Tehát a csúszó ablak módszerrel megbecsültük az egyes blokkok SAAID indexét és elkészítettük az index eloszlás hisztogramját. A blokk szélességét a keresési módszerrel választottuk ki, és egyenlő 32 pixellel.

Eredmények és vita

A blokkok SAAID és AF/SHG arányeloszlásait relatív egységekben, a teljes blokkszám normalizálásával hoztuk létre. Azok a blokkok száma, amelyekből tissue 10 ezer egészséges szövetet elemeztek, és ugyanez az érték volt a lymphedemás szövetekben is. A kiszámított eloszlások eredményeit a 3. ábra mutatja.

3. ábra.

A SAAID index hisztogramjai az egészséges és lymphedemás szövetek képeihez (c)

A 3. (a) ábra szerint a lymphedema szövetek átlagos SAAID indexe valamivel magasabb. Az egészséges szövet és a limfödémás szövet közötti kismértékű eltérés oka lehet, hogy a lymphedema szövetnek egészséges és ödémás területei is vannak. Az AF/SHG mesék arányának szórásának növekedése (3. ábra (b)).

Így bebizonyosodott, hogy az öregedési index és az AF/SHG arány eloszlásában különbség mutatkozik még a lymphedema korai szakaszában is.

KÖVETKEZTETÉS

Ezek az eredmények az eloszlás AF/SHG arányának szélességének növekedését és általában az SAAID arány maximumának növekedését mutatják. Így arra lehet következtetni, hogy az eloszlás változását a szövet szerkezetének változásai okozzák. Egészséges szövetek esetében nincs olyan régió, amelynek SAAID értéke nagyobb, mint 1,1, míg a sérült szövet esetében ezek a változások szisztematikusak. Ez a megközelítés egyszerűen megvalósítható, és nem igényel komplex számítási megoldásokat.

A további kutatások ezen a területen az autofluoreszcencia élettartamának megoszlásának és a kollagénszerkezet orientációjának tanulmányozására összpontosulnak a kapott képek részletesebb elemzése érdekében.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

A munkát az Állami Tudományos Akadémiák 2013–2020 közötti tudományos alapkutatási programjának III.23. Sora keretében hajtották végre. A tanulmány az Orosz Alapkutatásért Alapítvány és a Tomszki Régió Igazgatóságának pénzügyi támogatásával készült a 18-42-703012 számú kutatási projekt keretében.