A háziállatok bélmikrobiómáinak jellemzése az Egyesült Államokban közvetlen fogyasztói megközelítés alkalmazásával

Szerepek konceptualizálás, formális elemzés, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció, szoftver, vizualizáció, írás - eredeti tervezet, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulás-kutatási és fejlesztési részleg, NomNomNow, Inc., Oakland, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Konceptualizálás, források, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulások Kutatási és Fejlesztési Osztálya, NomNomNow, Inc., Oakland, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok, Összehasonlító, diagnosztikai és népegészségügyi osztály, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek vizsgálata, források, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulás-kutatási és fejlesztési részleg, NomNomNow, Inc., Oakland, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Adatmegőrzés, vizsgálat, erőforrások, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulás-kutatási és fejlesztési részleg, NomNomNow, Inc., Oakland, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Adatmegőrzés, vizsgálat, erőforrások, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulás-kutatási és fejlesztési részleg, NomNomNow, Inc., Oakland, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Konceptualizálás, adatkezelés, vizsgálat, erőforrások, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulás-kutatási és fejlesztési részleg, NomNomNow, Inc., Oakland, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Aashish R. Jha,
Justin Shmalberg,
Jirayu Tanprasertsuk,
LeeAnn Perry,
Dan Massey,
Ryan W. Honaker

Ábrák

Absztrakt

A bélmikrobiomák szerepe az emlősök egészségének fontos szabályozójaként egyre inkább felismerhető, bár a macska- és kutyabél-mikrobiómák továbbra is gyengén jellemezhetők. Ebben a koncepciókon alapuló vizsgálatban felmértük a közvetlen fogyasztói megközelítés hasznosságát a kedvtelésből tartott állatok mikrobiómiai vizsgálatainak végrehajtásában. Generálással jellemeztük 238 háziállat (46 macska és 192 kutya) bélmikrobiómáját

Idézet: Jha AR, Shmalberg J, Tanprasertsuk J, Perry L, Massey D, Honaker RW (2020) A háziállatok bélmikrobiomáinak jellemzése az Egyesült Államokban közvetlen fogyasztói megközelítéssel. PLoS ONE 15 (2): e0227289. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227289

Szerkesztő: Simon Russell Clegg, University of Lincoln, EGYESÜLT KIRÁLYSÁG

Fogadott: 2019. augusztus 20 .; Elfogadott: 2019. december 16 .; Közzétett: 2020. február 20

Adatok elérhetősége: A nyers fastq fájlok elérhetők a Qiita adatbázisból (Project 12861) és az ENA-ból (Study Accession number PRJEB36049). A felmérési adatok és az OTU táblázatok phyloseq objektumként érhetők el az S2 fájlban.

Finanszírozás: A NomNomNow, Inc. támogatást nyújtott a szerzők fizetése formájában [ARJ, JS, JT, LP, DM, RWH], de nem volt további szerepe a tanulmány tervezésében, adatgyűjtésében és elemzésében, a közzététel döntésében vagy az előkészítésben a kézirat. Ezeknek a szerzőknek a konkrét szerepei a „szerzői hozzájárulások” részben vannak megfogalmazva.

Versenyző érdeklődési körök: Minden szerző a NomNomNow, Inc. alkalmazottja. A NomNomNow Research csoport tagjai a NomNomNow, Inc. részvény- vagy részvényopciós alkalmazottai, és tartanak náluk részvényeket vagy részvényopciókat. Nincsenek szabadalmak, fejlesztés alatt álló termékek vagy forgalmazott termékek. Ez nem változtatja meg az adatok és anyagok megosztására vonatkozó PLOS ONE irányelvek betartását.

Bevezetés

Az emlős bél számtalan mikroorganizmust tartalmaz, amelyeket együttesen mikrobiotának hívnak. A mikrobák és teljes genomiális tartalmuk katalógusa egy adott környezetben mikrobiom néven ismert. A legújabb, emberekkel végzett vizsgálatok kimutatták, hogy a bél mikrobiomját az életmód befolyásolja, valószínűleg az étrend és a környezet különbségei miatt, amelyek az emberi létfenntartáshoz kapcsolódnak [1–4], és hogy fontos szerepet játszik az egészségben és a betegségekben [5–7]. Az emberi és a háziállat mikrobiómái között sok hasonlóság van [8], és az újabb bizonyítékok azt sugallják, hogy a bél mikrobiota a háziállatok egészségének és betegségeinek fontos szabályozójaként is működhet [9–12]. Például az antibiotikumok, valamint a kereskedelmi élelmiszerek között változó étrendi összetevők kimutatták, hogy befolyásolják a háziállatok bélmikrobiómáit [10,13]. Ezenkívül a háziállatok bélmikrobiális egyensúlyhiánya (dysbiosis) a rövid láncú zsírsavak termelésének csökkenését eredményezheti, ami hozzájárulhat a krónikus gyulladásos állapotok kialakulásához [14].

A háziállatok egészsége fontos és feltörekvő kutatási terület. A kutyák és macskák együttesen 135 milliót tesznek ki, és az összes éves állat-egészségügyi kiadás meghaladja az 17 milliárd dollárt az Egyesült Államokban [15]. A kedvtelésből tartott állatok mikrobiómáinak fokozott megértése megvilágíthatja a gazdaszervezet fiziológiájának és a betegség etiológiájának olyan új szempontjait, amelyek terápiás gyógyszerek, többek között étrend-kiegészítők, probiotikumok és posztbiotikumok kifejlesztéséhez vezethetnek [16–19]. A kedvtelésből tartott állatok mikrobiómáinak jelenlegi vizsgálata számos korlátozást tartalmaz. Először is, sok tanulmány általában korlátozott mintamérettel rendelkezik (trimLeft = c (10, 10), maxN = 0, maxEE = 2, truncQ = 2), és a szekvenciaváltozatokra az összes minta olvasmányainak összesítésével (pool = TRUE) következtettünk. Ezután az Amplicon Sequence Variant (ASV) táblákat a páros végű olvasatok egyesítésével hozták létre, és a taxonómiát az RDP v14 képzési készlet segítségével osztották ki [81].

Körülbelül 11,5 millió egyesített olvasást generáltak, és 27 104 ASV-t azonosítottak eredetileg. Minőségellenőrzés és kiméra eltávolítás után a leolvasások 95% -a (mélység = 10 902 218) és 5052 taxon maradt. Ezek közül a taxonok kis része (31 ASV) ismeretlen baktériumfilához tartozott, és a minták kevesebb mint 5% -ában több további phyla volt jelen, nevezetesen: Aquificae, Chlamydiae, Crenarchaeota, Deferribacteres, Euryarchaeota, Nitrospirae, Planctomycetes, Spirochaetes, SR1 és TM6. Ezeknek a taxonoknak a eltávolítása 10 901 731 olvasást és 5007 taxont eredményezett. Ezeket a minőség-ellenőrzési intézkedéseket követően az átlagos mintavételi mélység mintánként 45 806 (SD ± 22 325). Minden minta legalább 13 679 olvasást tartalmazott, a maximális lefedettség 94 183 olvasás volt. Ezért a végső adatkészlet 10 901 731 leolvasást tartalmaz, amelyek 5007 baktérium taxonhoz tartoznak 238 mintában.

statisztikai elemzések

Az alfa diverzitás két mutatóját, nevezetesen a fajgazdagságot és a Shannon-változatosság indexét úgy számoltuk ki, hogy a mintákat különféle mélységekig ritkítottuk mintánként 1000–13 500 szekvenciától kezdve, a szekvenálási mélység 500 olvasattal történő növelésével. Száz ismétlést hajtottak végre minden mélységben, és az átlagértékeket használták ezeknek az intézkedéseknek a becsléséhez az egyes mintákban. Kruskal – Wallis teszteket alkalmaztunk az alfa diverzitás mérőszámai közötti különbségek jelentőségének felmérésére a kisállattípusok között az egyes ritkasági mélységekben.

A kisállattípusok közötti különbségek a finomabb rendszertani szinteken kifejezettebbek

Az ilyen leolvasások alapján generált retefrakciós görbék azt mutatták, hogy a szekvenálási mélység elegendő mértékben telített baktériumok sokféleségét érte el macskákban és kutyákban is (1A. Ábra). Ezután két általánosan használt intézkedést használtunk a fajok sokféleségének - a fajgazdagság és a Shannon-változatosság indexének - jellemzésére a kutya- és macskabélben. Kiszámítottuk a kutya és a macska bél baktériumok sokféleségét különböző ritkítási mélységekben, 1000–13 500 leolvasás között. A bélbaktériumok sokféleségének mindkét mértéke magasabb volt a macskákban, függetlenül a ritkaság mélységétől (P 1. ábra. A kutyák és macskák béljének bakteriális sokféleségének összehasonlítása.

(A) A retardációs görbe a macskák és a kutyák közötti alfa változatosságbeli különbségeket mutatja. A hibasávok a szórásokat jelentik. (B) Bray-Curtis távolság a macskák és a kutyák között (piros), a macskákon belül (akvamarin) és a kutyákon belül (arany). A sávok az átlag standard hibáit jelentik. A legnagyobb fajok közötti különbséget az ASV szinten figyelték meg, és lényegesen nagyobb volt, mint a két fajon belüli távolság.

Ezután értékeltük a bélbaktériumok összetételének különbségeit a macskák és a kutyák között, Bray-Curtis távolságot alkalmazva az egyes taxonómiai szinteken. A fajok közötti távolság vizuálisan nem különbözött a fajonkénti távolságoktól a magasabb rendszertani szinteken (azaz törzs, osztály és rend; 1B. Ábra). Finomabb taxonómiai szinteken (azaz a család, a nemzetség és az ASV) azonban a fajok közötti távolság jelentősen nagyobbnak tűnt, mint a fajon belüli távolság. A fajok közötti és a fajon belüli távolságok közötti különbség az ASV szintjén volt a legnagyobb, és nem egyenlített ki, jelezve, hogy a finomabb taxonómiai részleteknél (törzs vagy részvezeték szintjén) további eltérések lehetnek. Mindazonáltal ASV szinten a fajok közötti távolság szignifikánsan nagyobb volt, mint mindkét fajon belüli távolság (FDR-korrigált P 2. ábra. A bél mikrobiómájának variációi macskák és kutyák között.

(A) A Bray-Curtis távolság PCoA-ja rávilágít a macskák és kutyák bélmikrobiómáinak elválasztására ASV szinten. A dobozdiagramok kiemelik a fajok közötti különbségeket a PCoA1 mentén. A pontok egyedeket, a színek pedig fajokat jelölnek. (B) Hőtérkép 83 olyan taxont jelenít meg, amelyek jelentősen eltérnek a kutyák és macskák populációi között, oszlopokban egyedek, sorokban pedig taxonok. A színek relatív bőséget jelentenek. A hőterületen szereplő 83 taxont az S5 táblázat tartalmazza.

A gépi tanulást (random forest) szintén alternatív megközelítésként alkalmaztuk a kutya és a macska bél bakteriális összetétele közötti különbségek értékelésére. A Random Forest osztályozó nagy pontossággal tudta kategorizálni az egyedeket a fajaikhoz (pontosság = 96%; 95% CI = 88%, 99%; AUC = 0,99, S3B ábra és S4 táblázat). A kutyák több mint 96% -a (N = 132 a 134-ből a kiképzési adatokban és 57 az 59-ből az validációs készletben) helyesen minősült kutyának, és a macskák több mint 81% -a (N = 26 a 32-ből az edzési adatokban és 12 az érvényesítési készlet 13-ból) szintén macskaként azonosították (S4 táblázat). Ezért ezek a megállapítások együttesen azt mutatják, hogy a kutya és a macska bél bakteriális összetétele jelentősen eltér egymástól.

A bélbaktériumok taxonjainak különbségei a kutya- és macskaminták között

Bélbaktériumok variációi a kutya- és macskamintákon belül

Az előző elemzések, amelyek a bélbaktériumok összetételében és a taxonok bőségében megfigyelt fajok közötti különbségeket vizsgálják (2. ábra), arra is rámutattak, hogy a kutyákon belül érzékelhető mikrobiális eltérések lehetnek. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez először kizárólag az adatkészletünk 192 kutyáján végeztünk PCoA-t, amely egyértelmű struktúrát tárt fel (3A. Ábra). A kutyacsoportok optimális számának meghatározásához a legfrissebb három PCoA tengely felhasználásával végzett klasztert végeztünk ordinációs elemzéssel (S5A ábra) [80]. A „rés” statisztikával értékelt klaszterezés jósága három kutyaklasztert tárt fel (I., II. És III. Klaszter; S5B ábra). A tételes hatások figyelembevétele után a bélbaktériumok összetétele szignifikánsan különbözött a három klaszter között (P 3. ábra. Bél mikrobiómaváltozások a kutyákon belül.

(A) A Bray-Curtis távolságokat alkalmazó PCoA-elemzés az ASV szintjén jelentős eltéréseket tárt fel a kutya bél mikrobiomjában. Mindhárom klaszter szignifikánsan különbözött a PCoA1 mentén, de csak a 3. klaszter különbözött szignifikánsan a PCoA2 mentén. *** a P 1.5, GLM és a változó fontosságú felső 10% -os farokot jelzi a véletlenszerű erdőanalízis során, 3C. A kutyaklasztereket megkülönböztető baktériumok döntő többsége a Bacteroides nemzetséghez tartozott (80%, N = 55 a 68-ból, S6 táblázat).

A kutya bél bakteriális variációival kapcsolatos tényezők

(A) Alfa sokféleségbeli különbségek az Egyesült Államok különböző földrajzi régióiban élő kutyák között (balra), valamint a nagy és kicsi kutyák között (jobbra). (B) A kutyák béta változatosságának különbségei az Egyesült Államokban, valamint a nagy és kicsi kutyák között a 92 kutyától kapott PCoA1 mentén, amelyekhez a felmérési kérdőívekből további adatok álltak rendelkezésre.

Vita

Számos eredményünk összhangban áll az akadémiai laboratóriumokban végzett korábbi tanulmányokkal. Megállapítottuk, hogy a Firmicutes, a Proteobacteriumok és a Bacteroides voltak a legelterjedtebb baktériumok mind a macska, mind a kutya bél mikrobiomjában, ami összhangban áll a korábbi vizsgálatokkal [22–24,32,92,93]. A cégek 45% -át (Q1 = 22%, Q3 = 66%), 32% -át (Q1 = 3%, Q3 = 52%) és 15% -át (Q1 = 1%, Q3 = 23%) alkották a bélbaktériumok kutyákban, és 38% -ot (Q1 = 21%, Q3 = 59%), 37% -ot (Q1 = 3%, Q3 = 62%) és 14% -ot (Q1 = 4%, Q3 = 22%) tettek ki macskáknál szintén összehasonlítható a korábban közölt arányokkal. [22–24,32,92,93]. Összehasonlító elemzések kimutatták, hogy a kutya és a macska belének bakteriális összetétele jelentősen eltér egymástól. A macskáknál szignifikánsan magasabb alfa változatosságot találtunk a kutyákhoz képest, ami szintén megerősíti a korábbi eredményeket [47,53]. Ezért ezek a megállapítások együttesen azt mutatják, hogy az itt alkalmazott DTC megközelítés összehasonlítható eredményeket hoz a laboratóriumi standard technikák alkalmazásával kapott eredményekkel.

A korábbi eredmények megismétlése mellett ez a tanulmány újszerű ismereteket tárt fel a háziállat bélmikrobiomáiról. Számos tanulmány kimutatta, hogy mind az étrend, mind a környezet befolyásolhatja a bél mikrobiómáit, és lehetséges, hogy a közös környezetben élő fajok nagyfokú hasonlóságot mutathatnak a bél mikrobiómáiban [1,3,8]. Eredményeink arra utalnak, hogy a közös környezet ellenére a kutyák és macskák bélmikrobiómái jelentősen eltérnek egymástól. Az alfa változatosság nagyobb volt a macskákban a kutyákhoz képest, bár ennek a különbségnek a mozgatórugói még nem azonosíthatók. Míg a táplálkozási és viselkedési különbségek a szokásos gyanúsítottak, a bél térfogatának eltérései szintén a bél mikrobiális különbségeit okozhatják e háziállatok között [94,95]. Ezenkívül a legnagyobb fajok közötti különbségeket figyeltük meg az ASV szinten anélkül, hogy kiegyenlítették volna, jelezve, hogy a baktériumok populációin belüli kis genetikai eltérések, például a baktériumtörzsek vagy az altörzsek közötti különbségek megkülönböztetik a kutya és a macska mintákat ebben a vizsgálatban.

A megfigyelt fajok közötti különbségek mellett elemzéseink határozottan alátámasztják a bélbaktériumok (alfa és béta változatosság) észlelhető szintjének jelenlétét kutyákban ebben a vizsgálatban. Bélmikrobiómájuk alapján három különálló kutyacsomót tudtunk kimutatni. Érdekes módon nem figyeltük meg a bél mikrobiómán alapuló csoportosulását macskáknál. A klaszterezés hiánya macskákban a macska résztvevőinek kisebb mintanagyságának tudható be ebben a vizsgálatban. Alternatív megoldásként a kutya béltérfogatának nagy különbségei hozzájárulhatnak a bél mikrobiális variációinak kifejezett különbségeihez a kutyákon belül [94,95], míg a macskák testméretében a markáns eltérések hiánya hozzájárulhat a macskák csoportosulásának hiányához. További munkára van szükség a kutyák ilyen csoportosulásának mozgatórugóinak és biológiai jelentőségének meghatározásához.

Mivel a DTC megközelítés megkerülheti a társállat-vizsgálatok számos akadályát, nagyon hasznos lehet a kedvtelésből tartott állatok mikrobiómáinak egészségre és betegségekre gyakorolt hatásának tanulmányozásában a jövőben. A DTC megközelítéssel összeállított nagyobb kohorszméretek ideális esetben összekapcsolják a mikrobiómákat a háziállatok sajátos, egészséggel kapcsolatos sajátosságaival. A tulajdonságspecifikus mikrobiális törzsek, funkciók és metabolitok azonosítása új kedvtelésből tartott állatok egészségügyi termékeinek (pl. Probiotikumok) és kezeléseinek (pl. Mikrobiális gyógyszerek, posztbiotikumok) kifejlesztését szolgálhatja kedvtelésből tartott állatoknál [16,97]. Továbbá, mivel ezek a háziállatok közös háztartási környezetben vannak az emberekkel, és közös bélbaktériumaik vannak, a kedvtelésből tartott állatok mikrobiómáinak jobb megértése megvilágíthatja a mikrobiom és az emberi betegségek közötti újszerű kapcsolatokat [8,12,63,69,97–100].

Következtetések

Ez a koncepciókon alapuló tanulmány azt mutatja, hogy a DTC megközelítése a kedvtelésből tartott állatok mikrobiómáinak tanulmányozásában megkerüli az állatorvosi kutatás számos kihívását, miközben összehasonlítható eredményeket és újszerű felismeréseket hoz. 192 kutya és 46 macska 16S rDNS szekvenálásával nemcsak a bél mikrobiómájának különbségeit mutatjuk be e két faj között, hanem a bél mikrobiómájának érezhető variációit is kimutatjuk a mintában szereplő kutyákon belül, és hogy a földrajz és a testtömeg összefüggésbe hozható a kutya bél mikrobiom változatosságával valamint a kompozíció. E megállapítások ellenére a 16S rDNS-től nyert kedvtelésből tartott mikrobiómákra vonatkozó ismeretek korlátozottak, és azt javasoljuk, hogy a jövőbeni tanulmányok vizsgálják meg a metagenomikai megközelítéseket, amelyek törzsszintű adatokat és a bélbaktériumok funkcionális jellemzőit nyújthatják.

Segítő információ

S1 ábra. A 16S szekvenálási adatok minőség-ellenőrzése.

(A) A nyers adatok összes olvasásának száma. (B) Kezdetben 23 ismert phylát azonosítottunk az adathalmazban, valamint néhány baktériumot, amelyek 16S rDNS-jük alapján nem rendelhetők hozzá az ismert phylához. Ezen phylák közül sokra kevés olvasmány vonatkozott, és csak a vizsgálati minták kevesebb mint 5% -ában voltak jelen, ezért eltávolították őket. (C) Az ilyen kevéssé bőséges taxonok eltávolítása nem eredményezett jelentős szekvenálási mélységbeli veszteséget. (D) A 13 megmaradt phyla előfordulása az egyének között (y-tengely) és az adatbázisban való bőségük (x-tengely).

S2 ábra A macskák és a kutyák közötti menedékjogi különbségek.

Az Actinobacteriumok relatív bősége nagyobb volt a macska bélben, a Fusobacteriumok nagyobb a kutya bélben.

S3 ábra. A kutya és a macska bél mikrobiómájának összehasonlítása.

(A) Reverziós görbe a macskák és kutyák közötti alfa diverzitásbeli különbségeket mutatja be Shannon sokszínűségi index felhasználásával. A hibasávok a szórásokat jelentik. (B) A véletlenszerű erdőosztályozó teljesítménye (ASV szinten) ROC görbékkel értékelve (macska: türkiz, kutya: narancs). AUC = 0,99 mindkettőnél. (C) Különbözően bőséges ASV-k azonosítása log2-szeres változás és változó fontossági tényező alkalmazásával (100-ra méretezve).

S4 ábra. A bélmikrobiomák összehasonlítása UniFrac távolságok alkalmazásával.

(A-B) A kutya és a macska bél mikrobiómájának összehasonlítása az UniFrac távolság (felül) és a súlyozott UniFrac távolság (alul) alkalmazásával. (CD) A bélmikrobiom összehasonlítása a három kutyafürtön az UniFrac távolság (felül) és a súlyozott UniFrac távolság (alul) alkalmazásával. Az összes P-értéket a PERMANOVA-tól kaptuk 10 000 permutáció alkalmazásával.

S5 ábra Fajon belüli variációk a kutya bél mikrobiomán belül.

(A) Az első 20 PCoA-tengely sajátértékeit bemutató görbék. (B) Hézagstatisztika, amelyet a PAM klaszterezésből nyertünk, a legfelső 3 PCoA tengely és 1000 bootstrapped ismétlés felhasználásával. (C) Bray-Curtis távolságok (fehér) és (három) között a három macskafürtön. Mindhárom esetben a klaszteren belüli távolságok kisebbek voltak, mint a csoportok közötti távolságok. (D) ROC görbék a véletlenszerű erdőosztályozó modell kiértékelésével a macskafürtök előrejelzéséhez.

S6. Ábra A macska bél mikrobiómájának fajtaváltozatai.

Sem a PCoA elemzés (A) sem a PAM-klaszterezésből kapott résstatisztika (B) felfedte a macskák különálló klasztereit. 1000 csoportos indítást hajtottunk végre a klaszterezéshez a felső 3 PCoA tengely felhasználásával (C).