A magas diétás sótartalom súlyosbítja a Helicobacter pylori által kiváltott gyomor karcinogenezist

ABSZTRAKT

Az emberi gyomor Helicobacter pylori-val történő tartós kolonizációja a gyomor adenokarcinóma kockázati tényezője, a H. pylori által kiváltott karcinogenezis pedig egy CagA néven ismert bakteriális onkoprotein hatásától függ. Epidemiológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a magas étkezési sófogyasztás a gyomorrák kockázati tényezője is. A magas sótartalmú étrend hatásainak vizsgálatához a mongol futóegéreket vad típusú (WT) cagA + H. pylori törzzsel vagy izogén cagA mutáns törzzsel fertőztük meg, és az állatokat rendszeres étrenden vagy magas sótartalmú étrenden tartottuk fenn. A fertőzés utáni 4 hónapban a WT-fertőzött/magas sótartalmú étrendű állatok 100% -ánál, a WT-fertőzött/rendszeres étrendű állatok 58% -ánál és a cagA mutáns törzzsel (P + H. pylori törzsek.

BEVEZETÉS

A Helicobacter pylori egy Gram-negatív baktérium, amely a világ népességének felén található és a robusztus immunválasz ellenére is tartósan kolonizálja az emberi gyomrot (1–3). Habár a legtöbb H. pylori-fertőzött személy tünetmentesen marad, ennek a szervezetnek a gyomorban való jelenléte növeli a gyomor adenokarcinóma kockázatát (4, 5), és a H. pylori az I. osztályú rákkeltő anyagként van besorolva (6). A H. pylori fertőzés klinikai kimenetelét számos tényező határozza meg, beleértve a gazda genetikáját, a környezeti tényezőket (beleértve az étrendet) és a H. pylori törzsek variációját a virulencia determinánsok expressziójában (4, 5, 7).

Nagy a genetikai változatosság a H. pylori klinikai izolátumok között (8, 9). A nemkívánatos klinikai eredménnyel járó egyik törzsspecifikus genetikai jellemző a kromoszómális DNS 40 kb-os régiója, amelyet cag patogenitási szigetnek (PAI) neveznek. A cag PAI egy „bakteriális onkoproteint” kódol, amely CagA néven ismert, és egy IV-es típusú szekréciós rendszert (T4SS), amely a CagA-t gazdasejtekbe juttatja (10–12). Gazdasejtekké történő transzlokáció után a CagA kölcsönhatásba lép a gazdasejtek sokféle célmolekulájával, pleiotróp hatásokat eredményezve, amelyek magukban foglalják a citoszkeletális átrendeződéseket, az NFκB aktiválódását, a szoros csomópontok megváltoztatását és a vaskereskedelem perturbációját (10, 13–16).

A cagA expresszióját számos környezeti körülmény, köztük a vas-koncentráció, a pH-érték és a sókoncentráció (17–20) változásaival szabályozzák. A cagA szabályozásának molekuláris mechanizmusai még nem teljesen ismertek, de a Fur vasfelvétel szabályozója ismert módon modulálja a cagA expresszióját (21). A megnövekedett sókoncentrációkra reagálva a cagA expresszió egyes H. pylori törzsekben fel van szabályozva, másokban azonban nem (20). A kolumbiai betegek H. pylori klinikai törzseinek elemzésében a törzsek képessége a magas sótartalmú állapotokra adott válaszként szabályozni a cagA-expressziót a TAATGA-motívum két példányának a cagA-promóter régióban való jelenlététől függ (22). A cagA-szekvenciák törzs-specifikus variációi (15, 23), a bazális cagA-expresszió szintje (24) és a cagA-expresszió szabályozása a környezeti viszonyokra reagálva (22) mind befolyásolhatják az egyedi H által okozott CagA-közvetített sejtes változások mértékét. pylori törzsek.

Epidemiológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a H. pylori fertőzés és a magas étkezési sófogyasztás növeli a gyomorrák kockázatát emberi alanyokban (25–30). Számos tanulmány értékelte a magas sótartalmú étrend hatását a H. pylori fertőzésre és a gyomorrákra állatmodellekben (31–37). Egy tanulmány arról számolt be, hogy a magas étkezési sófogyasztás növelte a gyomorrák előfordulását egy kémia által kiváltott karcinogenezis modellben (33), egy másik tanulmány pedig arról számolt be, hogy a H. pylori fertőzés és a magas sótartalmú étrend függetlenül okozhat atrófiás gyomorhurutot és bélmetapláziát mongol futóegér (34). Más tanulmányok arról számoltak be, hogy a magas sóbevitel módosíthatja a gyomor H. pylori kolonizációját vagy megváltoztathatja a Th2 válaszokat, de a betegség általános eredményeit a H. pylori fertőzés és a megnövekedett étrendi sóbevitel kombinációja nem befolyásolta (35–37). Az egerekhez adaptált H. pylori Sydney-1 törzset (SS1) számos korábbi tanulmányban alkalmazták. Nemrégiben arról számoltak be, hogy ennek a törzsnek van egy nem funkcionális cag patogenitási szigete (PAI) (38, 39); ezért az ezzel a törzzsel végzett kísérletek nem teszik lehetővé a cag PAI-függő hatásainak értékelését.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Baktériumtörzsek és tenyésztési körülmények. H. pylori 7.13 törzset használtuk szülői vad típusú (WT) törzsként ezekhez a kísérletekhez. Egy izogén cagA mutáns törzset különböztettünk meg a korábbi vizsgálatokban használt hasonló mutánsoktól (14., 41.), egy kanamicinrezisztencia kazetta (aphA) beépítésével egy egyedi NdeI helyre, amely megfelel a 7.13. Törzs cagA 1067 nukleotidjának, a korábban leírt módon. módszertan (42). A H. pylori törzseket 5% juhvért tartalmazó triptikus szója agar lemezeken vagy 5% magzati szarvasmarha szérummal kiegészített brucella táptalajban (Thermo-Fisher) növesztettük 37 ° C-on, 5% CO2-ot tartalmazó környezeti levegőben vagy mikroaerob atmoszférában. egy BD GasPak EZ Campy konténerrendszerrel. Az izogén cagA mutánsok kiválasztásához a véragar lemezeket kanamicinnel (40 μg/ml) egészítettük ki. A cagA inszerciós inaktiválását PCR és Western blot analízissel igazoltuk.

A baktériumok terhelésének értékelése a futóegér gyomrában. A Gerbil gyomorszövetet izoláltuk, lemértük, steril brucella táptalajban homogenizáltuk, és sorozatos hígításokkal 5% juhvért (Hemostat Laboratories), vankomicint (Sigma-Aldrich) (20 μg/ml), nalidixinsavat ( Sigma-Aldrich) (10 μg/ml), bacitracinnal (Sigma-Aldrich) (30 μg/ml) és amfotericin B-vel (Sigma-Aldrich) (2 μg/ml) a H. pylori növekedés kiválasztásához. Ezeket a lemezeket 37 ° C-on, mikroaerob kamrában (BD GasPak EZ Campy tartályrendszer) inkubáltuk 5 napig. A baktériumok terhelését úgy határoztuk meg, hogy meghatároztuk a jelen lévő CFU számát gramm szövetben.

H, K-ATPáz immunhisztokémiai kimutatása. A gyomorszövetet citrátpufferrel (pH 6,0) kezeltük 105 ° C-on 20 percig, 10 percig hűtve, majd 60 percig egér immunglobulinnal (Vector Laboratories) blokkoltuk. Miután nátrium-azidot tartalmazó 0,03% -os hidrogén-peroxiddal leállítottuk és szérummentes fehérjével blokkoltuk, az egér hidrogén-kálium-ATPáz (H, K-ATPase; Abcam) elsődleges antitestjét adtuk hozzá, és a reakcióelegyet 60 percig inkubáltuk. Az elsődleges antitest kimutatását EnVision + jelzett polimer rendszerrel és kromogén 3,3′-diaminobenzidin-tetrahidroklorid (DAB) reagenssel (Dako-Agilent) végeztük, mielőtt a fénymikroszkóppal elemeztük. A metszeteket vakon pontozta 0-tól 3-ig terjedő skálán egy patológus. A „0” pontszám normális parietális sejteloszlást jelez (nincs parietális sejtvesztés), „1” jelzi a foltos eloszlást és a parietális sejtek enyhe veszteségét, A „2” a parietális sejtek mérsékelt veszteségét, a „3” a parietális sejtek teljes vagy majdnem teljes elvesztését jelzi, több mezőben meghatározva.

Statisztikai elemzések. A baktérium-kolonizációs sűrűségeket logaritmikus transzformációval normalizáltuk az elemzés előtt, párosítatlan Student-féle t-teszt alkalmazásával. A különböző állatcsoportok szövettani eredményeit Mann-Whitney U-teszttel hasonlítottuk össze. A kolonizációs hatékonyságot és a diszplázia vagy az adenokarcinóma arányát különböző állatcsoportokban Fisher pontos tesztjével hasonlítottuk össze. A gyomor pH és a gyulladás pontszámok közötti összefüggést Pearson korrelációs együtthatóval értékeltük. A génexpresszió eredményeit párosítatlan Student-féle t-teszt és varianciaanalízis (ANOVA) segítségével elemeztük. Az összes statisztikai elemzést GraphPad Prism szoftvercsomaggal végeztük.

EREDMÉNYEK

H. pylori gyomor gyomor telepítése. A gerberákat WT H. pylori vagy egy izogén cagA mutáns törzs fertőzte meg, és rendszeres étrenden vagy magas sótartalmú étrenden tartották őket. A fertőzés utáni 16. héten a gyomrot eltávolítottuk, homogenizáltuk és bakteriológiai táptalajra helyeztük. A baktériumterhet kiszámítottuk a CFU/gramm szövet mennyiségének meghatározásával. A szaggatott vonal jelzi a kimutatási határt. Az adatok az átlagok átlagértékeit (SEM) jelentik minden csoportban (n = 19 - 20 állat csoportonként).

A gyomor H, K-ATPázának immunhisztokémiai elemzése a H. pylori-fertőzött futóegér gyomortestéből származó szövetekben. (A) Parietális sejtek egy nem fertőzött kontroll gyomorban. (B) A rendszeres étrenden tartott WT-fertőzött állat foltos eloszlást és a parietális sejtek mérsékelt veszteségét mutatja. (C) A magas sótartalmú étrenden tartott WT-fertőzött állatban a parietális sejtek jelentős veszteséget szenvednek. (D) A parietális sejtek elvesztését két fertőzött állatcsoportban értékeltük (csoportonként 5 állat; a sávok az átlag ± SEM értékeket jelölték). A „0” pontszám azt jelzi, hogy nincs parietális sejtvesztés; normális eloszlás a korpuszban és az antrumban, az „1” a parietális sejtek foltos eloszlását és enyhe veszteségét, a „2” a parietális sejtek mérsékelt veszteségét, a „3” pedig a parietális sejtek teljes vagy majdnem teljes elvesztését jelzi a gyomorszövetben . A WT H. pylori fertőzött és magas sótartalmú étrenden tartott állatok szignifikánsan megnövekedett parietális sejtek veszteséget mutattak a WT-vel fertőzött állatokhoz képest, rendszeres étrenden (P = 0,0463, Mann-Whitney U elemzés).

A hipoklorhidria fokozott gyomorgyulladással és dysplasiaval jár. Ezt követően elemeztük, hogy van-e összefüggés a gyomor pH-ja és a gyulladás súlyossága között. A vizsgálatba bevont összes állat (beleértve a nem fertőzött állatokat, a WT-vel fertőzött állatokat és a cagA mutánssal fertőzött állatokat magas sótartalmú és rendszeres étrenden egyaránt) együttes elemzésében szignifikáns összefüggés volt a gyomor pH-ja és a gyulladás súlyossága között (4B. Ábra) (P H. pylori-fertőzött állatok, súlyos gyomorgyulladással és diszpláziával, mint H. pylori-fertőzött állatoknál, akiknél nincsenek ezek a jellemzők.

A cagA expressziója fokozott a sós étrendben tartott futóegéren. Mivel korábbi in vitro vizsgálatok kimutatták, hogy a CagA onkogén effektor molekula H. pylori általi termelése pozitívan szabályozott a megnövekedett nátrium-klorid-koncentrációkra adott válaszként (20, 22), feltételeztük, hogy a cagA expresszió hasonló uregulációja in vivo is előfordulhat válasz a megnövekedett étrendi sóbevitelre Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez számszerűsítettük a cagA bakteriális expresszióját a futóegér gyomrában, az Anyagok és módszerek című részben leírtak szerint. A magas sótartalmú étrendben tartott WT-fertőzött állatokban a cagA-expresszió jelentős növekedését figyelték meg a rendszeres táplálékon tartott WT-fertőzött állatokhoz képest (P H. pylori-t in vitro tenyésztettek magas sótartalmú körülmények jelenlétében (20 Megfigyeltük azt is, hogy a cagA expressziója in vivo növekedett az in vitro expresszióhoz képest, ami összhangban áll a korábban közölt eredményekkel (49).

VITA

Ebben a jelentésben egy mongol gerbil modellben megmutatjuk, hogy a magas étrendi sóbevitel fokozza a H. pylori által kiváltott karcinogenezist. A nagy sótartalmú étrend H. pylori által kiváltott gyomorrákra megfigyelt hatása a gerbil modellben jól korrelál az emberi epidemiológiai adatokkal, amelyek ismételten kimutatták a magas sótartalmú étrendet fogyasztóknál a gyomorrák megnövekedett arányát (25–30). ). A tanulmányban alkalmazott magas sótartalmú étrend (8,75% nátrium-klorid) megközelíti a nátrium-klorid koncentrációját egyes, az emberek által fogyasztott élelmiszerekben. Például a szárított halat gyakran 3-20% sóban tartósítják, az ecetes ételek legfeljebb 25% sót, a szójaszósz pedig 19% sót tartalmaz (35). Az emberi étrenddel ellentétben, amely napról napra jelentősen változik, az ebben a vizsgálatban szereplő futóegéreket magas sótartalmú étrenddel táplálták, változatlanul hosszabb ideig.

A jelenlegi tanulmányban azt figyeltük meg, hogy a WT-törzzsel fertőzött és rendszeres étrenddel etetett futóegérek között a gyomorrák az állatok 60% -ában a fertőzés utáni 4. hónapban volt jelen. A gyomorrák ezen előfordulási gyakorisága a futóegér modellben hasonló vagy kissé magasabb, mint azt számos korábbi tanulmányban közölték (18, 40, 41). Gyomorrák olyan állatokban alakult ki, amelyek WT cagA + H. pylori törzzsel fertõzõdtek meg, de nem olyan állatokban, amelyek izogén cagA mutáns törzzsel fertõzõdtek meg. Bár a jelenlegi vizsgálatban nem elemeztünk egy kiegészített mutáns törzset, a cagA mutáns törzs gyomorrákot okozó kudarca összhangban áll számos más vizsgálat eredményeivel (18, 41). Összességében ezek az eredmények a H. pylori fertőzés állatmodelljeiben kombinálva transzgén állatkísérletek (50), sejttenyésztési kísérletek (16) és humán epidemiológiai vizsgálatok (51) bizonyítékaival bizonyítják, hogy a CagA fontos szerepet játszik a gyomorrákban patogenezis.

A magas sótartalmú étrend nem fertőzött állatoknál történő alkalmazása nem ösztönözte a gyomorrák kialakulását, ami arra enged következtetni, hogy a magas sótartalmú étrend hatása a gyomorrákra a H. pylori fertőzés jelenlététől függ. Különösen azt figyeltük meg, hogy a magas sótartalmú étrend a gyomor karcinóma megnövekedett gyakoriságához vezetett a WT cagA + H. pylori törzzsel fertőzött állatokban, de a cagA mutáns törzzsel fertőzött állatokban nem. Ez bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a magas sótartalmú étrendnek a gyomorrák patogenezisére gyakorolt hatása elsősorban a cagA + H. pylori törzsekkel való fertőzés összefüggésében releváns. Nincs tudomásunk olyan vizsgálatokról, amelyek a magas sótartalmú étrend, a cagA + H. pylori törzsekkel való fertőzés és a gyomorrák kapcsolatát vizsgálták volna az emberi populációkban, de a világ számos olyan részén, ahol magas a gyomorrák aránya, ott a cagA + törzsek magas gyakorisága, és a lakosság nagy része magas sótartalmú étrendet fogyaszt.

Számos korábbi tanulmány elemezte a magas sótartalmú étrend (tipikusan 8% hozzáadott só, hasonlóan a jelenlegi tanulmányhoz) hatását a H. pylori által kiváltott gyomor patológiára állatmodellekben, de nem jutottak következetes következtetésre (31–37). Nevezetesen, a rágcsálókra vonatkozó vizsgálatokat számos ilyen jelentésben H. pylori Sydney 1. törzs (SS1) felhasználásával hajtották végre, amely inaktív PAI-t tartalmaz (38, 39). Javasoljuk, hogy a magas sótartalmú étrend hatása a H. pylori által kiváltott gyomorrákra könnyebben kimutatható legyen olyan kísérletek során, amelyekben cagA + törzset és futóegér modellt alkalmaznak.

A magas sótartalmú étrend mellett a közelmúltban kimutatták, hogy az alacsony vastartalmú étrend fokozza a H. pylori által kiváltott karcinogenezist a gerbil modellben (18). Az alacsony vasviszonyok változásokhoz vezetnek számos H. pylori gén expressziójában, ideértve a cagA expressziójának szabályozását is (17), és serkentik a T4SS caggal társuló pili összeállítását is, amikor a H. pylori érintkezik a gyomor hámsejtjeivel (18). ). Ennek a két különálló étrendi beavatkozásnak potenciálisan vannak olyan jellemzői, amelyek fokozott H. pylori virulenciához vagy a gazda betegség progressziójához vezetnek. Például a vas felszívódása károsodhat a hipoklorhidria hátterében (52–54).

Korábbi tanulmányok arról számoltak be, hogy a H. pylori in vitro nagy sótartalmú körülményeknek való kitettsége változásokhoz vezet a több H. pylori gén, köztük a cagA expressziójában (22). A jelenlegi tanulmányban azt figyeltük meg, hogy a magas sótartalmú étrenden tartott WT-fertőzött állatok gyomrában a cagA génexpresszió megemelkedett a rendszeres étrenden tartott WT-fertőzött állatokhoz képest (amikor a 16S rRNS-hez viszonyított összehasonlítás alapján normalizálták). A cagA transzkripciónak ez a szabályozása a magas sótartalmú étrendre adott válaszként utánozza a cagA gén expressziójának szabályozását, amelyet in vitro megfigyelnek a magas sótartalmú körülményekre adott válaszként. Egy korábbi jelentéssel (49) egyetértésben azt is megfigyeltük, hogy a cagA transzkriptumok nagyobb mennyiségben voltak a gyomorszöveti mintákban, mint a laboratóriumi tápközegben tenyésztett baktériumoknál. Javasoljuk, hogy a magas sótartalmú étrendre adott válaszként a cagA gén expressziójának szabályozása fontos jellemzője annak a mechanizmusnak, amellyel a magas sótartalmú étrend fokozza a karcinogenezist.

Megfigyeltük, hogy a WT-törzzsel fertőzött és magas sótartalmú étrenddel etetett állatoknál szignifikánsan magasabb volt a gyomorgyulladás szintje, mint a rendszeres étrendben lévő WT-fertőzött állatoknál. Ennek a különbségnek a potenciális immunológiai alapjainak tisztázása érdekében számos citokin, kemokin és immunmoduláló molekula expresszióját elemeztük, amelyek szabályozzák a gyulladást. Ez az elemzés korlátozott terjedelmű volt, mert a reagensek és szekvenciák nem állnak rendelkezésre könnyen az egereken végzett immunológiai vizsgálatokhoz. Mindazonáltal sikerült bizonyítani, hogy az IFN-γ, IL-17, IL-1β, IL-6, IL-10, KC, iNOS és CCL12 relatív expressziós szintje megnőtt a WT H. pylori-fertőzött állatokban fertőzött állatokhoz képest. Érdekes módon mind az IL-1β, mind az iNOS transzkripció szignifikánsan megemelkedett a magas sótartalmú étrendben tartott WT-fertőzött futóegérekben, a szokásos étrendű társaikkal összehasonlítva, ami arra utal, hogy ezek a tényezők hozzájárulhatnak a magas sótartalmú gyulladás fokozásához. diéta.

Összefoglalva, a tanulmány eredményei azt mutatják, hogy a megnövekedett étrendi sófogyasztás jelentősen megváltoztatja a cagA + H. pylori törzs fertőzésének kimenetelét. A legegyszerűbb modellben a magas sókoncentrációk stimulálják a cagA fokozott expresszióját, és a CagA hatása gyulladáshoz, hipoklorhidriához és fokozott karcinogenezishez vezet. Ugyanilyen elfogadható modell azt javasolja, hogy a magas sókoncentrációk a H. pylori gének (beleértve a cagA-t is) (22) megváltozott expressziójához, valamint a gazdaszervezetben bekövetkező változásokhoz vezessenek, és hogy az ilyen változások konstellációja stimulálja a fokozott karcinogenezist. Függetlenül attól, hogy melyik mechanizmus működik, a jelenlegi eredmények kedvezően hasonlíthatók össze számos epidemiológiai bizonyítékkal, amelyek arra utalnak, hogy a magas sótartalmú étrend az emberek gyomorrákjának kockázati tényezője (25–30). Az étrendi sóbevitel csökkenése potenciálisan a H. pylori-asszociált gyomor adenokarcinóma kockázatának csökkenéséhez vezethet azokban a populációkban, amelyeknek nagy a kockázata ennek a rosszindulatú daganatnak.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a munkát részben az NIH AI068009 (T.L.C.), a CA116087 (T.L.C.), az F32 AI102568 (J.A.G.), az R01 DK58587 (R.M.P.), az R01 CA77955 (R.M.P.) és az Veteránügyi Minisztérium (T.L.C.) és H.M.S. Ezt a munkát a Vanderbilt Ingram Cancer Center is támogatta, és a Vanderbilt University Medical Center emésztőrendszeri kutatóközpontján keresztül végrehajtott alapszolgáltatásokat az NIH P30DK058404 támogatása támogatta.

Köszönjük Judy Romero-Gallo-nak és Jenny Noto-nak a segítő tanácsokat a futóegér modellel kapcsolatban.