A magas zsírtartalmú étrend hatása a bél mikrobiomák dysbiosisára az Öböl-háborús betegség egérmodelljében

Tárgyak

Absztrakt

Bevezetés

Az öböl-háborúban az ellenségeskedés befejezése után (1990. augusztus – 1991. Április) nem sokkal egészségügyi problémák sora kezdett felmerülni az öböl-háborús veteránokban, és ezek mind a mai napig fennmaradtak. A jelentett egészségügyi problémák a tünetek zavarba ejtő és összetett konstellációi, amelyek ma Öböl-háborús betegségként (GWI) ismertek. Az elmúlt két évtizedben az Orvostudományi Intézet számos tanulmányt végzett a GWI-ről és az egészségről, és a legfrissebb áttekintés arra a következtetésre jutott, hogy "a bizonyítékok elegendőek annak megállapításához, hogy oksági kapcsolat áll fenn az Öböl-háborúba történő bevetés és az egészségügyi kimenetel között". (3 1. o.). Az összes olyan tünetet figyelembe véve, amelyről beszámoltak, hogy a GWI része, a poszttraumás stressz rendellenesség volt az egyetlen feltétel, amelyről úgy ítélték meg, hogy elegendő bizonyíték van az ok-okozati összefüggésre. A többi tünet, amelyek esetében a bizonyíték elegendő volt a telepítéssel való összefüggés megállapításához, a hangulati rendellenességek (szorongás, depresszió), a GI tünetei (irritábilis bél szindróma [IBS], dyspepsia) és a krónikus fáradtság szindróma 1. Ezek az eltérő eredmények megnehezítik a GWI egyetlen mechanizmushoz való hozzárendelését mindaddig, amíg figyelembe nem vesszük a bél mikrobiomját.

Az emberek és a legtöbb emlős emésztőrendszerében nagyon sok baktérium, vírus, gomba és régészet él. Ezek a mikroorganizmusok együttesen alkotják a bél mikrobiomját. Becslések szerint a bél 100 billió sejtet tartalmaz, és ezek a sejtek> 150-szer több egyedi gént expresszálnak, mint az emberi genom 2. A bélmikrobiom kommensális tagjai támogatják az emberi egészséget, de annak megzavarása számos klinikai és fiziológiai rendellenességben szerepet játszott [lásd a véleményeket 3,4,5]. Az enterális dysbiosishoz kapcsolódó számos állapot emlékeztet a GWI-re. Először is az IBS 6,7 és a dyspepsia 8 a bél dysbiosisának prototípusos formájaként jelenik meg. Másodszor, a GWI-vel kapcsolatos központi idegrendszeri tünetek (általános szorongás, PTSD és depresszió) gyakran együtt járnak az IBS-sel és a bél egyéb gyulladásos állapotaival 9,10. Harmadszor, a krónikus fáradtságot/fibromyalgiát a megváltozott 11, 12 mikrobiom-összetételhez is kötik. Ezért a GWI három fő tünetcsoportja külön-külön összekapcsolható a bél dysbiosisával, ami arra utal, hogy egy megszakadt mikrobiom áll mindhárom mögött. A legutóbbi tanulmányok nagyon kevés száma igazolta, hogy a bél mikrobiómája megváltozott az Öböl-háborús veteránoknál 13 és a GWI állatmodelljeinél 14,15,16 .

Anyagok és metódusok

A GWI állatmodellje

Mikrobiom elemzés

DNS-t extraháltak a vakbél tartalmából (

Adatok elemzése és statisztikák

A splash teszt adatait párosítatlan tanuló t tesztjével elemeztük a GraphPad Prism (v6.07) for Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA, www.graphpad.com) segítségével. Az emelt plusz labirintus egyes karjaiban töltött időt kétirányú ANOVA-val és az azt követő Sidak többszörös összehasonlító tesztekkel elemezték. Az élelmiszer- és testtömegadatokat kétirányú ANOVA-val elemeztük, majd Tukey-t post hoc tesztek Prism segítségével Az α-sokféleség mutatóit PAST szoftver (v3.20; ingyenes szoftver a tudományos adatok elemzéséhez), Oyvind Hammer, Természettudományi Múzeum, Oslói Egyetem, Norvégia alkalmazásával szereztük be: https://folk.uio.no/ohammer /múlt/). Az eredményeket statisztikailag elemeztük egyirányú ANOVA-val és az azt követő Tukey-val post hoc összehasonlítások, a Prism használatával. Kiszámítottuk a β-diverzitás mutatóit is, és statisztikai elemzéseket végeztünk, PAST szoftver segítségével is. Az eredményeket kétirányú NPMANOVA alkalmazásával elemeztük, és post hoc az összehasonlításokat egyirányú NPMANOVA-kkal végezték. A taxonómiai eloszlásokat a menedékjogi szinten (kezelés X phylum) és az alacsonyabb taxonómiai szinteket (kezelés X idő) kétirányú ANOVA-val elemeztük, majd post hoc összehasonlítások Tukey tesztjeivel a GraphPad Prism alkalmazásban.

Eredmények

A HF hatása a táplálékfelvételre és a testsúlyra a GWI modelljében

Az 1. ábra azt mutatja, hogy az ebben a tanulmányban használt GWI-modell összefoglalja az állapot néhány legfontosabb jellemzőjét, például a hangulatváltozásokat. A PER + PB-vel kezelt egerek csökkent önmotivált gondozást mutattak, ami rövidebb ápolási időnek felel meg a splash tesztben a kontrollokhoz képest (p 1. ábra

A 2. A ábra az összes csoport táplálékfelvételi intézkedéseit mutatja be, és a kétirányú ANOVA elemzéssel az idő jelentős fő hatásait tárták fel (F11,484 = 72,71, p 2. ábra

A diéta hatása a táplálékfelvételre (A) és a testtömeg (B). Az egereket GWI-szerekkel vagy Con-val (kontroll) kezeltük, majd normál (ND) vagy magas zsírtartalmú (HF) étrendet tápláltunk 3 hétig. Ezt követően a HF-diétán lévő egerek felét (Con és GWI) további 3 hétre ND-re (HF-ND) helyezték át. A fennmaradó GWI és Con egereket ND vagy HF táplálékkal etették végig (ND-ND vagy HF-HF). A táplálékfelvételi intézkedéseket az élelmiszer-fogyasztás (g), az egér testsúlya (kg) alapján számították ki 24 órán keresztül, és g/kg/24 órában jelentették őket. Az eredmények átlag ± SEM, N = 7–9.

A GWI ágensekkel és a HF kezelésének hatása a bél mikrobiomjára OTU szinten

A kapott szekvenciák száma a következő volt: 117 212 ± 7 509 Con-ND-ND esetében, 103 432 ± 17 384 Con-HF-HF esetében, 128 772 ± 9 319 Con-HF-ND esetében, 100 369 ± 10 433 GWI-ND-ND esetében, 111 781 ± 32 363 GWI-HF-HF esetén és 128 371 ± 32 694 GWI-HF-ND esetén. Nem voltak statisztikailag szignifikáns különbségek e csoportok között a szekvenciaszámok tekintetében. Good lefedettségi értéke ± SD a következő volt: 99,63 ± 0,043 a Con-ND-ND esetében, 99,7 ± 0,056 a Con-HF-HF esetében, 99,67 ± 0,025 a Con-HF-ND esetében, 99,63 ± 0,025 a GWI-ND-ND esetében, 99,71 ± 0,06 GWI-HF-HF esetén és 99,69 ± 0,079 GWI-HF-ND esetén.

A 3. ábra bemutatja az α-diverzitás elemzését, a Chao-1 index felhasználásával a bél mikrobiomban való gazdagságának mérésére. A kezelés fő hatása (F5,44 = 26,1, p 3. ábra

A Simpson (1-D) indexen alapuló α-diverzitás elemzések eredményei azt mutatták, hogy bár a bél mikrobiómájának heterogenitása nem különbözött a GWI ágenssel kezelt egerek és a kontrollok között, a bél mikrobiómájának heterogenitása következetesen a legnagyobb volt a HF egerekben, míg a kezelésnek nincs következetes hatása a bél mikrobiomjának heterogenitására a Shannon-index alkalmazásával (Kiegészítő ábra S1). A β-sokféleség tekintetében a Jaccard-indexen alapuló elemzések, amelyek tükrözik a megosztott mikrobiom-tagság (azaz a közösségi összetétel) eredményeit, azt mutatták, hogy a minták OTU-profiljai szorosan csoportosultak az étrend szerint, és hogy az étrend-kezelési csoportokban a minták kezeléssel csoportosítva (4. ábra). Kétirányú NPMANOVA elemzésekből kiderült, hogy a kezelés fő hatásai (p 4. ábra

A kezelések hatása a β-sokféleségre. A PCoA különbségeket mutat a Jaccard indexet használó vizsgálati csoportok bélmikrobiom-profiljainak hasonlóságában. Con = kontroll; GWI = PER + PB; ND = normál étrend; HF = magas zsírtartalmú étrend.

A kiemelkedő OTU-k taxonómiai azonossága (≥1,5% átlagos relatív gyakoriság az összes alany között) a kezelési csoportok között változó volt. Ezeket az eredményeket az 5. ábra hőtérképében mutatjuk be. Látható, hogy a GWI ágenssel kezelt és kontroll csoportok hasonló OTU expressziós mintákat mutattak be az étrend szerint. Ezekben a csoportokban a legkiemelkedőbb különbségek a Bacteroidetes csökkenései voltak (lásd az 5. ábra alja közelében található klasztereket), és a Con-HF-HF és GWI-HF-HF csoportokban a Firmicutes (a tetejénél lévő fürtök) növekedése volt. Továbbá, az egyes étrendcsoportokon belül nyilvánvalóak voltak az OTU relatív bőségének különbségei a GWI ágenssel kezelt és a kontrollok között. Amint azt a közösségi α és β sokféleségről fentebb beszámoltuk, a GWI ágenssel kezelt és a kontroll csoportokban egerek áttérve a HF-ről az ND-re az OTU relatív bőségének mintázatai a kísérlet során az ND-vel táplált csoportokban „helyreálltak”. (azaz ND-ND csoportok).

Hőtérkép, amely bemutatja az OTU relatív bőségének mintáit a kezelési csoportok között. Minden csoport minden alanyát oszlopokba rendezték, és a baktériumok rendszertani sorokban vannak feltüntetve. Con = kontroll; GWI = PER + PB; ND = normál étrend; HF = HF étrend. Az y tengely mentén történő klaszterezés a Ward algoritmus segítségével történt.

Bakteriális taxonok, amelyek a kezelések során eltérően voltak. A LEfSe-t a Galaxy Project segítségével hajtották végre, és az eredmények a sávdiagramokban jelennek meg (A) és a hozzá tartozó kladogram (B). Az egyes kezelési csoportokban eltérő bőségértéket mutató taxonokat (az LEfSe szerint) a kis karikákkal és árnyékolással kiemelt kladogram mutatja. Valamennyi csoport statisztikailag szignifikáns egymáshoz képest (LDA> 3,6). Con = kontroll; GWI = PER + PB; ND = normál étrend; HF = magas zsírtartalmú étrend.

A GWI ágensekkel és a HF kezelésének hatása a bél mikrobiomjára filotípus szinten

A 7. ábra a kezelési hatásokat szemlélteti a filotípus szintjén. A specifikus bakteriális phylára gyakorolt kezelési és étrendi hatásokat a relatív bőség százalékában adják meg. A menekülés fő hatása szignifikáns volt (F7,352 = 2616, p 7. ábra

A phyla relatív bőségének százaléka a kezelési és étrendi csoportokban. Halmozott oszlopok tartoznak a 8 legkiemelkedőbb phylához. Con = kontroll; GWI = PER + PB; ND = normál étrend; HF = magas zsírtartalmú étrend.

Mivel a megfigyelt% -os relatív gyakorisági különbségek a Firmicutes és a Bacteroidetes phyla-n belül jelentkeztek, és azon megállapítások fényében, hogy a Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) aránya nagyobb az elhízott és túlsúlyos embereknél, mint a sovány kontrolloknál 41, ezt kiszámoltuk Az összes kezelési csoport arányát és az eredményeket a 8. ábra mutatja. A kezelés fő hatása szignifikáns volt (F5,44 = 50,8, p 8. ábra

A GWI-ügynökökkel és a magas frekvenciával történő kezelés hatása a taxonokra a menekültügyi szint alatt

Az LEfSe elemzésből származó összes OTU-t (6. ábra) elemzésnek vetettük alá a Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) alkalmazásával, megkísérelve azonosítani azokat a taxonokat, amelyek fajonként (azaz a Az OTU szekvenciája> 99% -ban azonos volt a BLAST taxonómiai adatbázisban szereplő baktériumfaj szekvenciájával). Az 1. táblázatban bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a Con-HF-ND kivételével az összes csoportot specifikus baktériumfajok képviselik. A Con-ND-ND csoportot az jellemezte Muribaculum intestinale mivel Fusimonas bowini a GWI-ND-ND csoportra volt jellemző. A Con-HF-HF csoportot a Flintibacter butyricus és Bacteroides zarnu és a megfelelő GWI-HF-HF csoportot elhatárolta Bacteroides vulgatus, Mucispirillum schaedleri és Parabacteroides goldstenii. Végül a biomarkerek Paramuribactum intestinale, Duncaniella muris és Bacteroides acidifaciens a GWI-HF-ND csoportban jelentek meg.

Vita

A PER-lel és a PB-vel, valamint a HF-vel végzett kezelés jelentős változásokat eredményezett a bél mikrobiomjának összetettségében. A különböző étrendi körülményekhez tartozó OTU-k szorosan és a többi csoporttól eltekintve csoportosultak. A teljes HF-et tápláló egerek (HF-HF) a PCoA-ábrán voltak a legtávolabb az egerekkel ND-vel táplált egerektől (ND-ND). Érdekes, hogy amikor a GWI és a kontroll egereket a HF-ről ND-re (HF-ND) helyezték át, mindkét csoport a legközelebb a saját ND-ND csoportjához csoportosult, ami a táplálkozási váltás után a β-változatosság részleges helyreállítására utal. Mindazonáltal az egyes diétás állapotfürtökön belül a GWI ágenssel kezelt egerek jelentősen eltértek a kontrolltól. Ezek az eredmények hangsúlyozzák azt a tényt, hogy egy életmódbeli kockázati tényező, mint például a HF, hangsúlyozhatja a PER és PB hatásait a közösség sokszínűségére, és megállapíthatja ennek a hatásnak a visszafordítható jellegét, miután visszatér az ÉD-re.

Jelen eredmények ellentétben állnak egy nemrégiben készült tanulmánygal, amely a bél mikrobiómájának változását mutatja be a GWI 14 egérmodelljében. Alhassan és munkatársai kimutatták, hogy az Öböl-háborús szerekkel és kortikoszteronnal kezelt egerek az OTU gazdagságát és a Firmicutes és Tenericutes relatív bőségének szignifikáns növekedését mutatták a Bacteroideteshez képest a menedékjog szintjén. Ezzel szemben mind az ND-ND, mind a HF-ND csoportokban megfigyeltük az OTU-gazdagság csökkenését a GWI-kezeléssel, és nem figyeltünk meg a Tenericutes relatív bőségének növekedését a GWI-szerrel kezelt egerekben. Ezek az eltérések tükrözhetik az alkalmazott öbölháborús modellek különbségeit, a kezelés utáni különböző túlélési idők alkalmazását, valamint az Alhassan-ban csak a stresszt jelentő csoport hiányát. et al. 14 tanulmány. E két preklinikai vizsgálat eltérései ellenére megerősíti annak lehetőségét, hogy a bél mikrobiómaváltozásai szerepet játszhatnak a GWI tüneteiben az Öböl-háborús veteránok dysbiosisának közelmúltbeli jelentése 13 .

Jelen tanulmánynak számos erőssége van. Először is alátámasztja azt a hipotézist, miszerint a bél mikrobioma dysbiosis hozzájárul a GWI tüneteihez. Másodszor, ez az életmódbeli kockázati tényező - zsírban gazdag étrend - hatásának első jellemzése a bél mikrobiomjának PER + PB okozta változásaira. Az életmódbeli kockázati tényezők, amelyek hozzájárulnak a rossz egészségi állapothoz, fontos szerepet játszhatnak a GWI tüneteinek időtartamának és súlyosságának meghosszabbításában, és segíthetnek elmagyarázni, hogy a GWI tünetei mennyi ideig maradnak fenn, miután a PER és a PB szintje az öbölháborúban észlelt érték alá esett. Veteránok 1. Harmadszor, megmutatjuk, hogy a GWI szerekkel végzett kezelés és az étrend közötti kölcsönhatás jelentős, így azok együttes hatása a bél mikrobiomjára nagyobb, mint bármelyik kezelés önmagában. Negyedszer, a jelen tanulmány azt mutatja, hogy a bél mikrobioma dysbiosisának a HF általi fokozása a GWI modellben reverzibilis és nyitva hagyja annak lehetőségét, hogy az étrend módosítása vagy más, a bél mikrobiomját megváltoztató nem invazív kezelések (pl. Probiotikumok, antibiotikumok) enyhíti a krónikus, többrendszeres rendellenesség tüneteit.

Vizsgálatunknak három elsődleges korlátja van. Először is, ez egy molekuláris mikrobiológiai vizsgálat kísérletek nélkül, amelynek célja a bél mikrobiómájának változásainak összekapcsolása a GWI modellben a GI változásával (pl. Szivárgás, gyulladás). Másodszor, ennek a projektnek egyetlen kezelési túlélési ideje volt; a jövőbeli kísérleteknek tartalmazniuk kell a HF-nek való kitettséget hosszabb ideig (pl. 3-6 hónapig), hogy értékeljék a GWI tünetek súlyosságára és krónikusságára gyakorolt hatást. Harmadszor, még nem lehet meghatározni, hogy a GWI-szerek megfigyelt hatása a bél mikrobiomjára gyakorolt közvetlen hatásoknak vagy az immun- és/vagy idegrendszer modulációján keresztül közvetett hatásoknak köszönhető-e.

Összefoglalva, további tanulmányok elvégzésére van szükség a bél mikrobiomjának GWI-ben betöltött szerepével kapcsolatban annak a feltörekvő megállapításoknak a fényében, hogy jelentős enterális dysbiosist dokumentáltak a GWI-vel rendelkező veteránokban, valamint ennek a rendellenességnek az állatmodelljeiben. A GWI minden egyes fő tünetcsoportja egyenként kapcsolódik a bél mikrobiomjának változásaihoz, így hihető, hogy a megváltozott bél mikrobióm hozzájárulhat ennek a rendellenességnek az összes fő tünetéhez. Nyilvánvaló, hogy a GWI tünetei még jóval azután is fennállnak, hogy a toxikus anyagokat, amelyeknek a katonai személyzet az Öböl-háborúban ki volt téve (pl. PER és PB), eltávolították a testből. Ezért hangsúlyt kell fektetni a különféle életmódbeli kockázati tényezők értékelésére is a GWI tüneteinek potencírozására és/vagy kiterjesztésére való képességük szempontjából. A GWI-nek nincs orvosilag validált vagy hatékony kezelése, és ha további igazolást lehet gyűjteni a bél mikrobiom dysbiosis szerepéről, új és nem invazív terápiákról, amelyek a bél mikrobiomjának helyreállítását célozzák a GWI-vel rendelkező veteránoknál (pl. Probiotikumok, diétás beavatkozások, széklettranszplantáció) terápiákként tesztelhetők.

Az adatok elérhetősége

A jelenlegi vizsgálat során létrehozott MiSeq 16S rRNS génszekvencia-adatok kérésre rendelkezésre állnak.