A melanin-koncentráló hormonreceptor-1 hiánya növeli az inzulinérzékenységet az elhízott leptinhiányos egerekben anélkül, hogy befolyásolná a testsúlyt

Absztrakt

A hipotalamusz peptid melanin-koncentráló hormon (MCH) fontos szerepet játszik az energia homeosztázisban. Az MCH-t túlzott mértékben expresszáló állatoknál hyperphagia, elhízás és inzulinrezisztencia alakul ki. Ebben a vizsgálatban olyan egereket hoztak létre, amelyekből hiányzik az MCH receptor-1 (MCHr1 kiütés) és a leptin (ob/ob) kettős-null egerek (MCHr1 kiütéses ob/ob), hogy megvizsgálják, hogy az elhízás és/vagy az inzulinrezisztencia összefügg-e a Az ob/ob egerek elhízott fenotípusát az MCHr1 gén ablációjával gyengítettük. Az MCHr1 knockout ob/ob egereknél az orális glükózterhelés alacsonyabb vércukorszint-választ és szignifikánsan alacsonyabb inzulinszintet eredményezett az ob/ob egerekhez képest, annak ellenére, hogy a testtömeg, a táplálékfelvétel vagy az energiafelhasználás között nem volt különbség. Ezenkívül az MCHr1 knockout ob/ob egereknek magasabb volt a mozgásszervi aktivitásuk és a sovány testtömegük, alacsonyabb a testzsírtömegük és megváltozott a testhőmérsékletük szabályozása az ob/ob egerekhez képest. Összefoglalva, az MCHr1 fontos az inzulinérzékenység és/vagy a csökkent testtömegtől nem függő mechanizmus révén történő szekréció szempontjából.

BAT, barna zsírszövet
CRH, kortikotropin-felszabadító hormon
MCH, melanin-koncentráló hormon
MCHr1, MCH receptor-1
MSH, melanocita-stimuláló hormon
RER, légzéscsere arány
SCD-1, sztearoil-CoA-deszaturáz-1
UCP-1, a protein-1 szétkapcsolása

Köztudott, hogy az elhízás az inzulinrezisztencia és a 2-es típusú cukorbetegség kialakulásának fő tényezője. A cukorbetegek gyakran megváltoztathatják inzulinrezisztenciájukat a testsúlyuk csökkentésével. Az elhízást és az inzulinérzékenységet összekapcsoló mechanizmust azonban még nem ismerjük. Az ob gén mutációi elhízást és inzulinrezisztenciát eredményeznek, és ez modellként szolgálhat a fokozott táplálékfelvételhez, ami elhízáshoz és inzulinrezisztenciához vezet.

A hibás ob-gént hordozó egereknél elhízás és inzulinrezisztencia alakul ki, így ezek az egerek jó modellt jelentenek a hiperfágia okozta inzulinrezisztenciára. A leptinhiányos ob/ob egerek elhízottak, hiperfágikusak, hiperinsulinémiásak, inzulinrezisztensek, csökkent a testhőmérsékletük és az energiafelhasználásuk (rev. 15-ben). A leptin főleg az adipocitákból választódik ki, és az étvágy csökkentésére, az energiafelhasználás növelésére és az egerek maghőmérsékletének emelésére szolgál, valamint a barna zsírszövetben a szimpatikus aktivitás (BAT) (16). Továbbá a leptin intakt szimpatikus idegeket igénylő mechanizmusokkal növeli a glükóz, inzulin és glükagon szintjét (17). Ezzel szemben az MCH csökkentheti a szimpatikus aktivitást, mivel az MCHr1 knockout egerek szimpatikus tónusa megnövekedett (11), és az MCH infúzió csökkenti a testhőmérsékletet egerekben (6). Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy az MCH és a leptin ellentétes hatást gyakorol az autonóm idegrendszerre.

A vizsgálat célja az MCHr1 szerepének vizsgálata volt a leptinhiányos elhízott egerek fenotípusában. Az inzulinérzékenységet és a glükóz clearance-et orális glükóz-tolerancia teszt elvégzésével vizsgálták. Megvizsgáltuk a testtömeget, a testzsírt, az étel bevitelt és az energiafelhasználást, valamint a szérumkémiát és a májzsír felhalmozódását is. Ezenkívül a BAT-ban levő protein-1 (UCP-1) szétkapcsolódásának testhőmérsékletét és expressziós szintjét mértük az autonóm idegrendszerre gyakorolt hatások jeleként.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Az MCHr1 knockout egereket az AstraZeneca Transgenics and Comparative Genomics alkalmazásával állítottuk elő, amint arról korábban beszámoltunk (11), és hét generációt kereszteztek a C57BL/6-ra. Az ob/+ egereket Harlan Olac (Blackthorn, Bicester, Egyesült Királyság) látta el teljesen keresztbe a C57BL/6-ra. Az egereket csoportos elhelyezéssel etettük, és 4% összes lipidet, 18,5% fehérjét, 55,7% szénhidrátot és 3,5% rostot (R36; Lactamin, Stockholm, Svédország) tartalmazó normál étrendet adtunk a jó állatgyakorlatnak megfelelően. 4 hetes életkor után az egereket egyedül tartották. A genotipizálást PCR-rel végeztük. Az MCHr gén esetében az egyik primert a rövid karon (5′-GAGTCCCCCAGCATTGAGAAC-3 ’), az exonrészben elhelyezkedő második primert (5′-AGCTCCCACTGACATCACCT-3’), a harmadikat pedig a PGK- NEO promoter (5′-AGCGCATGCTCCAGACTGCCTT-3 '). Az ob mutációt kombinált PCR és restrikciós emésztési megközelítéssel detektáltuk, felhasználva azt a tényt, hogy az ob mutáció új restrikciós enzim helyet hoz létre. A PCR-fragmenseket az (5'-GACTTCATTCCTGGGCTTCA-3 ') és (5'-ATCCAGGCTCTCTGGCTTCT-3') primerekkel amplifikáltuk, és a kapott termékeket DdeI-vel emésztettük (In Vitro Sweden, Stockholm, Svédország). A vizsgálatot a helyi etikai bizottság által állatkísérletekkel jóváhagyott etikai bizonyítványnak megfelelően végezték.

Az MCHr1 knockout ob/ob egerek generálása.

A tenyésztés első lépésében az MCHr1 knockout (-/-) egereket kereszteztük ob/+ egerekkel, hogy utódokat hozzunk létre, amelyek mind az MCHr1 (+/−), mind az ob mutáció (ob/+) szempontjából heterozigótaak voltak. Ezután ezeket a vegyület heterozigóta egereket kereszteztük, és azonosítottuk az MCHr1 knockout (-/-) ob/+, valamint az MCHr1 vad típusú (+/+) ob/+. Végül az MCHr1 knockout (-/-) ob/+ -okat kereszteztük, hogy hím MCHr1 knockout ob/ob és MCHr1 knockout ob vad típusú (+/+) eredményezzünk a vizsgálat számára. Ezenkívül az MCHr1 vad típusú ob/+ keresztezéssel hím MCHr1 vad típusú ob/ob és MCHr1 vad típusú ob vad típusú (+/+) egereket kaptunk, amelyeket vizsgáltunk.

Testnövekedés, táplálékfelvétel és székletelemzések.

A testtömegeket hetente mértük 4 és 23 hetes kor között. A táplálékbevitel mérésére normál étrenddel ketreceket (23 × 16 cm) készítettünk, és 80 ° C-on szárítottuk 1 órán át, hogy korrigálják a páratartalom különbségeit. Szobahőmérsékleten 12 óra elteltével a ketreceket pontosan lemértük. A 20 hetes egereket 12 órán keresztül éheztettük a sötét időszakban, majd az előmérlegelt ketrecekbe tették, szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez. Az egereket 48 órán át a ketrecben hagyták, majd visszatették eredeti ketreceikbe. Az összes üreget összegyűjtöttük további elemzés céljából. A ketreceket 1 órán át 80 ° C-on inkubáltuk, hogy kiszáradjon a víz és a vizelet, majd 12 óra múlva újra lemérjük. Az állatok székletét egy éjszakán át 55 ° C-on szárítottuk, és vizsgálatig légmentesen lezárt edényekben -20 ° C-on tároltuk. A székletpelletek bruttó energiatartalmát bomba kaloriméterrel határoztuk meg (C 5000; IKA Werke, Staufen, Németország).

Közvetett kalorimetria, aktivitás és hideg expozíció.

A közvetett kalorimetriát a korábban leírt módon (18) mértük 24 hetes egerekben 22 ° C-on. Az intézkedéseket 5 másodpercig, 9 percenként végeztük. Az első 2 óra adatait kizártuk az elemzésből, hogy lehetővé tegyük az új környezethez való alkalmazkodást. A mozgásszervi aktivitást mind a kalorimetrikus kamrákban 48 órán keresztül, mind az aktivitásdobozokban (Kungsbacka mät-och reglerteknik, Kungsbacka, Svédország) 1 óra alatt, 10: 00-11: 00 óra között figyeltük. A rektális hőmérsékleteket 26 hetes tudatos egerekben regisztráltuk rektális szonda (az ELFA által szállított alkatrészek, Järfälla, Svédország). A hőmérséklet-leolvasásokat 1 perccel az előtt és a következő időpontokban vettük, miután az egereket 6 ° C-os hideg helyiségbe helyeztük: 15, 30, 45 és 60 perc.

A testzsír és a sovány testtömeg meghatározása.

A testzsírt (%) és a sovány testtömeget (g) denzitometriával határoztuk meg 25 hetes egerekben, a korábban leírtak szerint (19).

Glükóz tolerancia teszt.

A 28. héten át tartó egereket 12 órán át (12:00 és 12:00 óra között) éheztettük, mielőtt szájon át beadtuk a glükóz oldatot (2 g/kg). A farok vért 1 perccel a glükóz beadása előtt és 5, 15, 30 és 60 perccel gyűjtöttük. A glükózszinteket Accu-chek eszközzel és plazma kalibrált tesztcsíkokkal mértük (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország). Az inzulinszinteket ultraszenzitív inzulinenzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálati készlet segítségével határoztuk meg (Crystal Chem, Downers Grove, IL). Az inzulinérzékenység további vizsgálatához QUICKI számítást hajtottak végre az alábbiak szerint: 1/[log (I0) + log (G0)], ahol I0 az éhomi inzulin (ng/μl) és G0 az éhomi glükóz (mmol/l). . Korábban kimutatták, hogy a QUICKI korrelál az emberek inzulinérzékenységével (20).

Minta kollekció.

A szöveteket és a szérumot a korábban leírt módon gyűjtöttük össze (21). A májat és a BAT-ot megfagyás előtt lemértük. A májbiopsziák trigliceridtartalmát egy triglicerid CP készlet segítségével határoztuk meg (ABX Diagnostics, Montepellier, Franciaország).

Szérumelemzés.

A kortikoszteront radioimmunassay kit segítségével (kód: RPA 548; Amersham Biosciences, Uppsala, Svédország) mértük. A trigliceridek és az összkoleszterin esetében CHOD-PAP-ot (TG/GB, 12146029216, koleszterin-szám 2016630; Roche Diagnostics, Mannheim, Németország) alkalmaztunk, és a nem észterezett zsírsavszinteket elemezzük nemészterezett zsírsavak C assay kit segítségével (Cat. 999-75406; Wako Chemicals, Neuss, Németország). A koleszterin eloszlási profilokat a korábban leírtak szerint mértük (19).

Az mRNS expressziójának meghatározása.

A teljes RNS extrakciót, a cDNS szintézist és a mennyiségi meghatározást a korábban leírt módon hajtottuk végre (21). A Taqman PCR-ben alkalmazott primerek és próbák szekvenciáját az 1. táblázat mutatja be.

Statisztika.

Glükóz tolerancia, szérum kémia és kortikotrofin-felszabadító hormon expresszió.

Az éhomi glükózszintek nem különböztek szignifikánsan a csoportok között (2A. Ábra). Érdekes módon az éhomi inzulin 49% -kal alacsonyabb volt az MCHr1 knockout ob/ob egerekben az ob/ob egerekhez képest (31 ± 8 és 61 ± 9 ng/ml, 2B. Ábra). A QUICKI számításokból kiderült, hogy az MCHr1 knockout ob/ob egerek indexe szignifikánsan magasabb az ob/ob-hez képest (0,46 ± 0,04, illetve 0,38 ± 0,01, P 40% -kal alacsonyabb az MCHr1 knockout ob/ob egerekben, mint az ob/ob egerek (2. táblázat). A kortikotropin-felszabadító hormon (CRH) expressziós szintje a hipotalamuszban nem volt különbözõ a csoportok között (az adatokat nem közöltük). A trigliceridek és koleszterin szérumszintje, valamint a koleszterin eloszlása a különbözõ lipoprotein osztályokban nem volt különbözik az MCHr1 knockout ob/ob egerek és az ob/ob egerek között (2C. ábra és 2. táblázat).

Közvetett kalorimetria, mozgásszervi aktivitás és testösszetétel.

A 48 órás közvetett kalorimetrikus mérés nem mutatott ki különbséget a légzési csere arányban (RER) vagy az energiafelhasználásban az MCHr1 knockout ob/ob és az ob/ob egerek között, noha mindkét csoport különbözött a vad típusú egerektől (3A. Ábra). A spontán mozgásszervi aktivitást 48 órán keresztül mértük mind az indirekt kalorimetriás ketrecekben (3C. Ábra), mind pedig 1 óra alatt nappal az aktivitás dobozokban (3D ábra). Az MCHr1 knockout ob/ob egereknek magasabb volt a mozgásszervi aktivitása az ob/ob egerekhez képest, mind a 48 órás időtartam alatt (P 60 g. Érdekes, hogy egy orális glükóz tolerancia teszt azt mutatta, hogy az MCHr1 knockout ob/ob alacsonyabb perccel a glükóz beadása után, alacsonyabb inzulinválasz és alacsonyabb éhomi inzulinszint az ob/ob egerekhez képest. A QUICKI, amelyet korábban az inzulinérzékenységgel jól korreláló indexként validáltak (20), magasabb volt az MCHr1 knockout ob-ben/ob egerek az ob/ob egerekhez képest. Ezek a megállapítások egyértelműen jelzik a fokozott inzulinérzékenységet, és arra utalnak, hogy az MCHr1 hozzájárul az ob/ob egerek gyenge inzulinérzékenységéhez. Ezenkívül az MCHr1 kiütéses ob/ob egereknek nagyobb a sovány tömege, alacsonyabb testzsír, magasabb mozgásszervi aktivitás és jobb hidegtűrés, mint az ob/ob egereknél.

Köztudott, hogy az elhízás az inzulinrezisztencia és a 2-es típusú cukorbetegség elsődleges kockázati tényezője (rev. 3-ban). Az MCHr1 knockout ob/ob egereknél szignifikánsan alacsonyabb volt a glükóz és inzulin válasz az orális glükóz terhelésre, mint az ob/ob egereknél. Az alacsonyabb inzulinszint jobb inzulinérzékenységet jelez, ami arra utal, hogy az MCHr1 szerepet játszik az inzulinérzékenység szabályozásában. Ezt támasztja alá egy nemrégiben megjelent publikáció, amely azt mutatja, hogy a patkányok központi MCH-injekciója inzulinrezisztenciát váltott ki a testtömeg befolyásolása nélkül (24 A magasabb sovány testtömeg és az alacsonyabb testzsír részben megmagyarázhatja az inzulinérzékenység javulását. Az inzulinszint jelentős csökkenése azonban valószínűleg más fiziológiai változásoknak is tulajdonítható, mint a testösszetétel apró változásai. Érdekes megjegyezni, hogy az embereknél a testmozgás javítja a glükóz toleranciát. Így a megnövekedett mozgásaktivitás az MCHr1 knockout ob/ob egerekben szintén szerepet játszhat az inzulinérzékenység javulásában.

Az MCH és az MCHr1 szintén befolyásolja a nem elhízott állatok glükóz metabolizmusát. Az MCHr1 knockout egerek éhomi inzulin- és inzulinreakciója alacsonyabb volt egy orális glükóz-provokációval szemben, mint a vad típusú egerekben, összhangban az MCHr1 knockout-egerek alacsony inzulinszintjének korábbi megállapításával (9,10). Egy további mechanizmus, amellyel az MCH befolyásolhatja a glükóz metabolizmusát, az inzulin szekréció. Az MCHr1 mRNS jelen van az inzulintermelő B-sejtekben, és az MCH stimulálhatja az inzulin szekrécióját (25). Felvetődött, hogy az MCH, mint neurotranszmitter, fontos szerepet játszik az anyagcsere autonóm szempontjaiban, ideértve a hasnyálmirigy kontrollját is (26). Az MCH patkány plazmában is jelen van (14). Tehát, mivel az MCHr1 knockout ob/ob egerek glükóz clearance-e valamivel lassabb, nem zárhatjuk ki, hogy a B-sejtek MCHr1 hiánya csökkent inzulin szekréciót eredményez az MCHr1 knockout ob/ob egerekben.

A glükokortikoidok a máj és a perifériás inzulinérzékenység csökkentésével vesznek részt a glükoregulációban (27). Köztudott, hogy a leptinhiányos egereknél megnő a glükokortikoid szint (28,29). Ezzel szemben mind az MCH, mind az EI neuropeptid stimulálhatja a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengelyt és növelheti a kortikoszteron szintjét (30). Vizsgálatunkban az MCHr1 knockout ob/ob egerek kortikoszteronszintje 40% -kal alacsonyabb volt az ob/ob egerekhez képest. A CRH expressziós szintje azonban statisztikailag nem volt különbözõ a csoportok között, ami arra utal, hogy az MCHr1 hatása a CRH-tól lefelé irányul. Az alacsonyabb kortikoszteronszint az MCHr1 knockout ob/ob egerekben hozzájárulhat az alacsonyabb inzulinszinthez és a jobb glükóz metabolizmushoz. A leptin gátló hatása a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengelyre tehát magában foglalhatja az MCHr1 és az MCH útvonalat, amit az MCH knockout ob/ob egerek eredményei is alátámasztanak (31).

Számos bizonyíték áll rendelkezésre arról, hogy az MCH és az MCHr1 befolyásolja a testsúlyt, a táplálékfelvételt és az energiamérleget, valamint a leptin és az inzulin hatását (4–11,14,25). Az orexigén neuropeptid Y és MCH peptideket az ob/ob egerekben felfelé szabályozzák, ami magyarázat lehet a megfigyelt hiperfágiára (32,33). Az ebben a vizsgálatban használt MCHr1 knockout ob/ob egerek ugyanolyan hiperfágikusak voltak, mint az ob/ob egerek. Ezért úgy tűnik, hogy ezeknek a jeleknek az ob/ob egerek hiperfágiájához való hozzájárulása nem igényli a funkcionális MCHr1-et. Ezenkívül az MCHr1 nem szükséges egy másik orexigén peptid: ghrelin (21) közvetítőjeként.

Az MCHr1 knockout ob/ob egereknek megnőtt a mozgásszervi aktivitásuk ob/ob alomtársaikkal összehasonlítva, ami hozzájárulhat a magasabb sovány tömeghez és az alsó testzsírhoz. Megalapozott, hogy a dopamin és a dopamin receptorok megváltoztatják a mozgásszervi aktivitást (rev. 34-ben). A közelmúltban kimutatták, hogy az MCHr1 knockout egerekben fel van szabályozva a mezolimbikus dopamin receptorok és a noradrenalin transzporterek, ami azt jelzi, hogy az MCHr1 modulálhatja a mezolimbikus monoamin funkciókat (35). Ezek az eredmények részben magyarázhatják a megnövekedett mozgásszervi aktivitást.

A magas RER azt jelzi, hogy az MCHr1 kiütéses ob/ob és az ob/ob egerek elsősorban szénhidrátokat használnak energiaforrásként, miközben a zsír tárolódik. A máj zsírtartalma mindkét elhízott csoportban magas volt. Az SCD-1 részt vesz a egyszeresen telítetlen zsírok bioszintézisében, és az ob/ob egerekben erősen szabályozott (22). Az SCD-1 mRNS szintje nem különbözött az MCHr1 knockout ob/ob és az ob/ob egerek között. Ez a megfigyelés eltér az MCH knockout ob/ob egerek eredményeitől, amelyek csökkentették az SCD-1 expressziót az ob/ob egerekhez képest, a magas máj trigliceridtartalom ellenére (31). Így az MCH és az MCHr1 eltérhet az SCD-1 gén szabályozásában.

A leptinhiányos MCH knockout és az MCHr1 knockout egerek a test növekedése, a sovány tömeg, az inzulinszint és az energiafelhasználás tekintetében is különböznek. A mag testhőmérséklete nem különbözött az MCHr1 knockout ob/ob és ob/ob között, ellentétben az MCH knockout ob/ob egerek eredményeivel (31). Amint azt az MCH knockout ob/ob egereknél bemutattuk, az MCHr1 knockout ob/ob termogenezise javult a hideg hatására, de a testhőmérséklet csökkenése kevésbé volt kifejezett az MCHr1 knockout ob/ob egereknél (ez a tanulmány és 31). A modellek közötti különbségek azt jelzik, hogy az MCH-nak más módja van a jelzésnek, mint az MCHr1-en keresztül. Az MCH gén más neuropeptideket, az EI neuropeptidet, a GE neuropeptidet és az MCH gén túlnyomott polipeptidjét is kódolja (2,36). Egy másik lehetséges magyarázat az, hogy az MCH preprohormonból származó proteolitikus feldolgozás után kapott többi neuropeptid külön jelátviteli utakon keresztül befolyásolja ezeket a paramétereket. Hogy a GE neuropeptid funkcionálisan aktív peptidként létezik-e, nem világos, de az EI neuropeptidről kimutatták, hogy együtt expresszálódik MCH-val és megváltoztatja a mozgásszervi aktivitást (37,38), míg az MCH-gén túlnyomott polipeptidje befolyásolja a szomatosztatin szekrécióját (36).

Ez a tanulmány az MCHr1 kiütését leptinhiányos háttérrel jellemezte, és eredményeink egyértelműen azt mutatják, hogy az MCHr1 hiánya hatással van az inzulinszintre, a mozgásszervi aktivitásra, a testhőmérsékletre, a testzsírra és a sovány testtömegre. Nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbséget a táplálékfelvétel, a testsúly, az energiafelhasználás, a máj trigliceridek vagy a szérum lipidek tekintetében az ob/ob egerekhez képest. Adataink azt sugallják, hogy az MCHr1 knockout ob/ob egerek az elhízás ellenére is javították az inzulinérzékenységet. Az MCHr1 fontos lehet a szimpatikus idegrendszeren keresztül ható testhőmérséklet autonóm szabályozásához is. Amikor az MCHr1 knockout ob/ob-t összehasonlítottuk a korábban közölt MCH knockout ob/ob-vel, számos különbség volt, beleértve a testtömeget, a sovány testtömeget és az energiafelhasználást. E különbségek oka az MCH gén más ismert peptidjeinek tulajdonítható, vagy az, hogy az MCH az MCHr1 mellett több jelzőrendszeren keresztül is végrehajtja tevékenységét.