A metformin gátolja a prosztatarák progresszióját a tumorral társult gyulladásos infiltráció célzásával

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
ORCID rekord Jun Jiangról
Levelezés céljából: jiangjun_64 @ 163.comdoclan @ yeah.net

Absztrakt

Célja: A gyulladásos beszivárgás fontos szerepet játszik mind a karcinogenezisben, mind az áttétekben. Szeretnénk megismerni a metformin gátló mechanizmusát a daganattal társuló gyulladásban prosztatarákban.

Kísérleti terv: Az egér prosztata transzgenikus adenokarcinóma (TRAMP) egér modelljének, in vitro makrofág migrációs tesztek és betegminták alkalmazásával megvizsgáltuk a metformin hatását a tumorral összefüggő gyulladásra a prosztatarák megindításakor és utána.

Eredmények: A TRAMP egerek metforminnal történő kezelése késlelteti a prosztatarák progresszióját az alacsony fokú prosztata intraepithelialis neopláziától a magas fokú PIN-ig, differenciálatlanul jól differenciálva, és PIN-t adenokarcinómáig, a gyulladásos infiltráció egyidejű gátlásával, amelyet a makrofágok csökkent toborzása bizonyít. Ezenkívül a metformin képes a következő folyamatok gátlására: egerek műtéti kasztrálásával indukált gyulladásos beszivárgás az androgén-deprivációs terápia (ADT) után, a betegeknél bikalutamid-kezelés és az LNCaP-sejtek hormon-hiánya. Mechanikusan a metformin elnyomja a gyulladásos beszivárgást azáltal, hogy mind a COX2, mind a PGE2 szintjét szabályozza a tumorsejtekben.

Ezt a cikket a Kiemelt témák című cikk tartalmazza. 5491

Transzlációs relevancia

Tekintettel arra a tényre, hogy a gyulladásos beszivárgás általában androgén-deprivációs terápiával (ADT) történik, és a metformin képes a prosztatarák progressziójának visszaszorítására a tumorral társult makrofágok beszivárgásának gátlásával, azt javasoljuk, hogy az ADT és a metformin kombinációja hatékonyabb terápiás stratégia lehet a prosztatarák kezelésében.

Bevezetés

A tumor mikrokörnyezet (TME) a daganatsejtek teljes sejtszintje, amelyet erek, extracelluláris mátrix és néhány nem rosszindulatú sejt alkot, beleértve a mesenchymális ős/stromális sejteket, a csontvelőből származó dendritikus sejteket, a fibroblasztokat és az immunsejteket (1). A tumor-asszociált makrofágokat (TAM), a TME egyik legfontosabb alkotóelemét, tumorsejtek toborozzák, majd M2-szerű sejtekké polarizálják. Ahelyett, hogy kölcsönhatásba lépnének a rákos sejt antigénjeivel és elpusztítanák a rákos sejteket, az M2 makrofágok megkönnyítik a protorigén funkciót azáltal, hogy citokineket, például interleukinokat (IL4, IL6, IL10 és IL13) és TGFβ termelnek. Ez végül a környező szövetek későbbi megzavarásához vezet, és fokozza a tumorsejtek túlélését, növekedését, invázióját, migrációját és disszeminációját (2). Több bizonyíték azt jelzi, hogy a TME kritikus szerepet játszik nemcsak az iniciációban, a progresszióban és az áttétekben, hanem szerepet játszik a különböző rákos megbetegedések terápiás rezisztenciájának kialakulásában is (3, 4). Ezenkívül a TME-n belüli sztrómasejteket vonzó terápiás célpontként javasolták, és genetikailag stabil tulajdonságuk miatt ezeknek a sejteknek a célzása általában a rezisztencia és a kiújulás kockázatának csökkenésével jár (5).

Az egér prosztata transzgenikus adenokarcinoma (TRAMP) hosszú évtizedek óta az egyik legjobb in vivo prosztatarákos állatmodell. A vírusos SV40 onkoprotein expressziójával a prosztata epitheliumában (16) az egerek PIN kódot kapnak 10-12 hetes korban, ritka prosztatarákban. Az invazív prosztata adenokarcinoma azonban általában 18-20 hétig jelentkezik, és szinte az összes TRAMP egér prosztatarák-pozitívvá válik 30-36 hetes korban, és a rákos sejtek egy része áttétet is adhat más szerveknek, például nyirokcsomóknak, tüdőknek, máj és csont (17). Annak ellenére, hogy ennek az állatmodellnek vannak bizonyos korlátai, mivel a vírusantigének természetesen nem társulnak az emberi prosztatarákhoz, sőt némi kiterjedt neuroendokrin differenciálódáshoz (18), ez nemcsak hasonlít az emberi prosztatarák kialakulásához és progressziójához (19), hanem alkalmas a antiandrogén terápiával szembeni rezisztencia kialakulása (20).

Anyagok és metódusok

Állatok és kísérleti eljárások

Szövettani elemzés

Az állatokból ventrális prosztata mintákat gyűjtöttünk, és 10% -os formalinban rögzítettük 24 órán át, majd paraffinba ágyazottuk a hematoxilint és az eozint (H&E). A tárgylemezeket fénymikroszkóp alatt fényképeztük (Olympus, BX53). A különböző szintű prosztata elváltozások szövettani besorolása a TRAMP egerekben részben Roy-Burman P (20) által készített leírásokon alapult. A szövettani jellemzőket a következő specifikációk szerint osztályozták: (i) normál szövet (NT); (ii) alacsony minőségű PIN (LGPIN); (iii) kiváló minőségű PIN (HGPIN); (iv) jól differenciált adenokarcinóma (WD-Adeno); és (v) differenciálatlan adenokarcinóma (UD-Adeno). A kvantitatív elemzést a korábban leírt módon, kisebb módosításokkal végeztük (28). Röviden, minden állat esetében 10 véletlenszerű mezőt vettünk le 10-szeres nagyítással, amelyet további 4 negyedre osztottunk. Minden negyedben a legfejlettebb szövettani jellemzőt normálnak, LGPIN, HGPIN, WD-Adeno vagy UD-Adeno osztályozták. Így meghatároztuk az egyes kísérleti csoportokban az elváltozások egyes altípusainak számát, és összehasonlítottuk a különböző altípusok százalékos arányát a különböző kísérleti csoportok között.

Betegek és szövetminták

Immunhisztokémiai festés

A beágyazott tumormintákat szeleteltük és üveglemezekre szereltük, majd immunfestést végeztünk a korábban leírtak szerint (21, 29). Elsődleges antitestek AR (1: 200, Abcam), KI67 (1: 200, sejtjelzés), CD68 (1: 200, Abcam), CD163 (1: 150, Origene), CD204 (1: 150, Origene), COX2 ellen (1: 400 Origene), szinaptofizint (1: 400, Proteintech) és CD56 (1: 600, Proteintech) használtunk. A festés intenzitását minősített klinikai patológusok (Dr. Qiang Ma és Hualiang Xiao) értékelték a korábban leírtak szerint (30–32). Megjegyzendő, hogy a gyulladásos markerek (CD68, CD163 és CD204) pontszámait a pozitív sejtek területenkénti megszámlálásával kaptuk (30). Röviden: 10 véletlenszerű, vagy 3 reprezentatív mezőt (az emberi szövet mikrorayája, illetve az egér szövetei esetében) 40-szeres nagyítással rögzítettünk. Megszámláltuk az egyes képek pozitívan festett sejtjeit. Az AR és a COX2 IHC-pontszámát úgy számítottuk ki, hogy az intenzitás pontszámokat megszoroztuk a festési pontszám mértékével (31). A Ki67 mérését felülvizsgáltuk az IHC képek felhasználásával, 40-szeres nagyítással. Röviden: 10 egér egérből álló, véletlenszerűen daganatos hámsejteket tartalmazó mezőt 40-szeres nagyítással rögzítettünk, majd két igazolt patológus értékelte a jelölési indexet (32). Az IHC-ket fénymikroszkóp alatt fényképezték (Olympus, BX53).

Immunfluoreszcens festés

A CD68/CD163, CD163/CD204, CD68/CD204 és CD68/CD163/CD204 immunfluoreszcens festését formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott szakaszokon végeztük. A metszeteket CD68 (nyúl, Abcam, 1: 100), CD163 (egér, Origene, 1: 100) és CD204 (kecske, Abcam, 1: 2000) elleni primer antitestekkel inkubáltuk. A kimutatáshoz felhasznált másodlagos antitestek fluoreszcein-izotiocianáttal konjugált nyúl anti-kecske antitestek (FITC, 1: 200, DINGGUO CHANGSHENG BIOTECHNOLOGY, Peking, Kína), Alexa Flour 594 (1: 200, Zhongshan Gold Bridge Biotechnology) konjugált kecske egér elleni antitestek. ), Alexa Fluor 647-hez (1: 200, Affinity Biosciences) konjugált kecske nyúlellenes antitestek. A metszeteket 15 percig DAPI-val festettük (KGA215, KeyGen BioTECH) 37 ° C-on, és képeket konfokális mikroszkóppal (LSM700; Zeiss) kaptunk.

Sejtkultúra és életképesség-vizsgálat (MTT vagy CCK8)

Sejtvonalakat (LNCaP, PC-3, DU145, THP1, RAW264.7, RM-1 és WPMY-1) a Shanghai Bank Biológiai Tudományok Intézetéből (Kínai Tudományos Akadémia) szereztünk be. Ezeket a sejteket 5% CO2 és 37 ° C hőmérsékleten tenyésztettük a megfelelő táptalajban az ATCC szerint. Az életképességi vizsgálatokat 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolium-bromid (MTT) festékkel (5 mg/ml, Sigma) vagy sejtszámláló Kit-8-mal (CCK8) végeztük. Az oldott formazán sűrűségét 490 nm-en spektrofotometriásan leolvastuk (Bio-Rad).

Makrofág-toborzási vizsgálat

A prosztatarák sejteket a jelzések szerint kezeltük, és a kondicionált táptalajt (CM) vagy a kontroll táptalajt összegyűjtöttük, 10% friss marha-magzati szérum (FBS) tápközeggel (1: 1) hígítva, a transzwell mélyedések alsó kamrájába 5 -mm pórusú polikarbonát membránbetét (Corning). THP1 (1x105) vagy RAW264.7 (1x105) sejteket szélesztettünk a felső kamrára makrofág-migrációs vizsgálat céljából. A migrált sejteket összegyűjtöttük az alsó táptalajból, megszámoltuk vagy kristálylilával megfestettük, és öt véletlenszerűen kiválasztott nézetet számláltunk. Mindegyik kísérletet legalább háromszor megismételtük.

Sejtinvázió és migrációs vizsgálat

A prosztatarák/makrofág sejteket együtt tenyésztettük 24 üregű transzwell lemezeken. A sejteket a jelzések szerint kezeltük, és a CM-t vagy a kontroll táptalajt összegyűjtöttük, 10% friss FBS-tápközeggel hígítottuk (1: 1), és az alsó 24-lyukú lemezekre szélesztettük; és a prosztatarák sejteket (LNCaP, 1x105; RM-1, 3x104) szélesztettük a felső transzwell-kamrákba (Corning) matrigellel vagy anélkül. 48 órán át 37 ° C-on végzett inkubálás után a membrán felső felületéhez rögzített sejteket vattapálcikákkal gondosan eltávolítottuk, míg a kamra alsó oldalához eljutott sejteket 10% -os formalinnal rögzítettük, és 3 percig kristálylilával festettük. szobahőmérséklet és megszámoljuk. Mindegyik kísérletet legalább kétszer megismételtük.

Western blottolás

Az LNCaP és RM-1 sejteket 6 lyukú lemezekre oltottuk, 2x105 sejt/üregben, különböző koncentrációjú metforminnal (0, 1, 5, 10, 20 mmol/l) kezeltük. A sejtlizátumokat SDS – PAGE-n szétválasztottuk, majd Western-blot vizsgálatot végeztünk a korábban leírtak szerint (23, 33) a következő primer antitestekkel: COX2 (1: 1000, Origene) és β-aktin (1: 5000, Cell Signaling).

Enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat (ELISA)

Amint azt korábban leírtuk (29), az LNCaP, RM-1 és RAW264.7 sejteket 6 lyukú lemezekre oltottuk, és a szérum 24 órán át éhezett. A metformin jelzett koncentrációit hozzáadtuk a táptalajhoz, és 48 órán át tenyésztettük. A felülúszót összegyűjtöttük, és a táptalajba engedett prosztaglandin E2-t (PGE2) vagy IL6-ot és TNFa-t megmértük a kereskedelemben kapható ELISA-készletek felhasználásával a Cloud-clone corp-tól.

SiRNS által leütni a COX-2-t

A siRNS humán COX2 elleni szekvenciái a korábban leírtak voltak (29). Az egér COX2 elleni siRNS-szekvenciákat a Shanghai Genechem Co., Ltd-től (Kína) szereztük be. SiCOX2-1 esetében: érzékelő oligo 5′-UAC CCG GAC UGG AUU CUA UTT-3 ′, antiszensz oligo 5′-AUA GAA UCC AGU CCG GGU ATT-3 ′; az siCOX2-2 esetében: sense oligo 5′-GCC AUG GAG UGG ACU UAA ATT-3 ′, antiszensz oligo 5′-UUU AAG UCC ACU CCA UGG CTT-3 ′; és az siCOX2-3 esetében: sense oligo 5′-GAG CAC CAU UCU CCU UGA ATT-3 ’, antiszensz oligo 5′-UUC AAG GAG AAU GGU GCU CTT-3’. A prosztatarák sejteket 80% -os összefolyás mellett 6-lyukú lemezekre szélesztettük, és a transzfekció előtt 24 órán keresztül éheztettük a szérum nélkülözéssel. A transzfekcióhoz hígított siRNS-hez 5 μL lipo2000-t adtunk, és a keveréket a táptalajhoz adtuk. A sejteket 48 órán át transzfektáltuk, és a sejt-lizátumokat használtuk a Western blot-hoz, és a táptalajt használtuk fel makrofág-migrációs vizsgálatokhoz.

Sejtciklus és apoptózis

A PC-3, DU145 vagy WPMY-1 sejteket 75 cm2-es lombikba oltottuk, és a szérum 24 órán át éhezett. Metformint adtunk a tenyészethez 0, 1, 5, 10 és 20 mmol/l végkoncentrációig, és 24 órán át inkubáltuk. A sejteket háromszor hideg PBS-sel mostuk, 70% etanolban újraszuszpendáltuk a sejtciklus eloszlás elemzéséhez, vagy az apoptózis elemzéséhez használt közvetlenül Annexin V kötő pufferben.

Statisztikai analízis

A GraphPad Prism 5.0-t használtuk az összes statisztikai elemzéshez. Az adatokat átlag ± SD-ként adtuk meg. Ha az adatok normális eloszlást követnek, a két adatcsoport közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját t és χ 2 teszttel elemeztük, és a több csoport közötti különbségeket egyirányú varianciaanalízissel, majd az összehasonlításhoz a legkevésbé szignifikáns eltérési eljárással elemeztük. eszközökkel. Azok számára, amelyek nem felelnek meg a normál eloszlásnak, nemparametrikus statisztikai teszteket használtunk. A 0,05 alatti P értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.