A MicroRNS 34a részben gátolja a bézs és barna zsírképződést az elhízásban azáltal, hogy elnyomja az adipocita fibroblaszt növekedési faktor 21 jelzését és a SIRT1 funkciót

ABSZTRAKT

BEVEZETÉS

Az elhízás globális járványa nagymértékben megnövelte a zsírbiológia iránti érdeklődést, különös tekintettel az energiát eloszlató barna zsírra (1). Míg a fehér zsírszövet (WAT) a felesleges kémiai energiát tárolja, ami súlygyarapodáshoz vezet, addig a barna zsírszövet (BAT) a párosítatlan légzés útján hőenergiát fordít a mitokondriális szétválasztott 1-es fehérje (UCP1) hatására, megvédve a hipotermia és az elhízás ellen (2– 5.) A legújabb tanulmányok egy második típusú barna jellegű zsírt, a „bézs zsírt” fedeztek fel, amely jelen van a WAT-ban és genetikailag elkülönül a klasszikus BAT-tól (6). Érdekes módon a 2-fluorodeoxi-glükózt és a pozitronemissziós tomográfia (PET) pásztázást alkalmazó legújabb humán vizsgálatok azt mutatták, hogy a felnőtt embereknek barna a zsírjuk, és hogy a barna zsír aktivitása és mennyisége fordítottan kapcsolódik a testtömeg-indexhez (BMI), és jelentősen csökkent elhízás (3, 7). Az energiafelhasználás növelése a BAT barna zsír és a WAT bézs zsír előállításának előmozdításával, különösen elhízott egyéneknél, vonzó lehetőség lenne a súlycsökkentés és az elhízással kapcsolatos betegségek kezelésére.

A barna és a bézs zsírraktárak különböző aktivátorokra reagálva alakulnak ki, beleértve a hideg hatását, a hormonokat, a testmozgást és a transzkripciós szabályozókat, például a PRDM16, a PPARγ, a SIRT1 és a PGC-1α (8–11). Kimutatták, hogy a Fibroblast 21-es növekedési faktor (FGF21) kedvezően befolyásolja az anyagcserét és az energiaegyensúlyt azáltal, hogy fokozza a zsírsav-β-oxidációt az elhúzódó koplalás során, valamint elősegíti a zsírbarnulást WAT-ban, valamint BAT-ban, válaszként az egerek hideg hatására 12–16). Fontos, hogy egy nemrégiben végzett emberi tanulmány kimutatta, hogy a hideg expozíció megnövelte az FGF21 és az irizin barna zsír aktivátorok keringési szintjét, és hogy ezen endokrin szabályozók bármelyikével végzett kezelés felülszabályozta a barnulási géneket és elősegítette a termogenezist (17).

Új bizonyítékok azt mutatják, hogy a mikroRNS-ek (miR-k) szintén fontos szabályozóként működnek, amelyek gátolják az adipociták barna átalakulását. Az izmokkal dúsított miR-133a a barna zsírdifferenciálás kulcsfontosságú transzkripciós aktivátorának, a PRDM16 és a hideg expozíciónak közvetlenül csökkentette az expresszióját, csökkentette a miR-133a szintjét és elősegítette a barna zsírsejtek differenciálódását (18, 19). Kimutatták, hogy a barna adipocitákkal dúsított miR-155 gátolja a barna zsírsejtek differenciálódását azáltal, hogy közvetlenül a barnulási transzkripciós faktor C/EBPβ-t célozza meg (20). Egy nemrégiben végzett miR expressziós profilelemzés feltárta, hogy az elhízott egyének adipocytáiban a miR-34a szint emelkedett (21), de az emelkedett miR-34a funkcionális szerepe az elhízásban továbbra sem ismert.

Ebben a tanulmányban azt mutatjuk be, hogy az elhízásban megemelkedett miR-34a gátolja a bézs és a barna zsírképződést. Az étrend okozta elhízással rendelkező egerekben a miV-34a lentivírus által közvetített csökkentése minden típusú WAT-ban növelte a bézs zsír markereit, és elősegítette a további barnulást BAT-ban. Mechanisztikus vizsgálatokban kimutattuk, hogy a miR-34a downregulációja fokozta az FGF21 receptor komplex (FGFR1-βKL) és a SIRT1 expresszióját, hozzájárulva a PGC-1α FGF21/SIRT1-függő dezacetilezésén keresztül a barnulási transzkripciós program aktiválásához. Fontos, hogy a zsírszövetben a zsírbarnulás mellett az anti-miR-34a által közvetített jótékony hatások, beleértve a csökkent zsírosságot, valószínűleg több szövetből származnak, mivel a miR-34a csökkentése javítja a máj FGF21 jelátvitelét és a zsíroxidációs gének expresszióját.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Reagensek és anyagok. Antisense miR-34a-t, kódolt RNS-t, TaqMan miRNS-vizsgálati készletet és kis interferáló RNS-eket (siRNS-eket) a βKL (s96291 és s96292), FGFR1 (s66023 és s66025) és SIRT1 (s96764 és s174220ios) rendszerek számára . A βKL elleni antitesteket (AF2619) az R&D Systems-től szereztük be. FGFR1 (sc-121), SIRT1 (sc-15404), PGC-1α (sc-13067), RNS polimeráz II (sc-9001), tubulin (sc-8085) és aktin (sc-1616) antitesteket vásároltunk és a foszforilezett extracelluláris szignál által szabályozott kináz (p-ERK) (9101), t-ERK (4695), foszforilezett AMP kináz (p-AMPK) (2531), t-AMPK (2532) antitestek és a pan-acetil-Lys-t (9441) a Cell Signaling Technology cégtől vásároltuk. A CD137 (ab64836) és az UCP1 (ab10983 és MAB6158) antitesteket az Abcam and R&D Systems-től szereztük be. NAD/NADH kvantitációs készletet vásároltunk a Biovision-tól. Az immunhisztokémiai (IHC) vizsgálatokban használt βKL (LS-B3568) és FGFR1 (nb600-1287) antitesteket az LS Biology és a Novus Biological cégtől szereztük be. A rekombináns FGF21-et Escherichia coli-ban expresszáltattuk és a korábban leírtak szerint tisztítottuk (12).

IHC tanulmányok. Az UCP1 és CD137 elleni elsődleges antitesteket biotinnal jelölt szekunder antitest és peroxidáz-csatolt sztreptavidin készlet (Abcam) segítségével tettük láthatóvá, és a mintákat NanoZoomer szkennerrel (Hamamatsu) készítettük. Az fluoreszcencia IHC-hez Alexa Fluor 647-gyel vagy 488-mal jelölt szekunder antitesteket használtunk. A sejtmagot DAPI-val (4 ', 6-diamidino-2-fenil-indol; Invitrogen) festettük. A mintákat konfokális mikroszkóppal (Zeiss LSM 700) készítettük.

Mitokondriális DNS másolat száma. A teljes DNS-t DNS-extrakciós készlet (Omega Bio-Tek) segítségével izoláltuk. Soros hígítási standard görbét készítettünk, és a DNS-t kvantitatív PCR-rel (qPCR) számszerűsítettük. A mitokondriális DNS kópiaszámot a mitokondriális gén, a COX II gén és az egy kópiás nukleáris gén, a ciklofilin A gén DNS-ének arányából számítottuk.

CS aktivitás vizsgálata. A mitokondriális citrát-szintáz (CS) aktivitását kit (Sigma-Aldrich) segítségével mértük a gyártó utasításainak megfelelően. Összesen 1-2 μg fehérjét alkalmaztunk szubkután inguinalis WAT-ból (scWAT), gonadal WAT-ból (gWAT) vagy BAT-ból.

NAD + és NADH mérések. A NAD + és a NADH szintjét enzimatikus reakcióikkal mértük a gyártó utasításai szerint (Biovision, Inc.), a korábban leírtak szerint (23).

A 3T3-L1 sejtek differenciálása. A 3T3-L1 sejteket M1 táptalajon tenyésztettük (Dulbecco által módosított Eagle táptalaj [DMEM], 10% -os marha magzati szérum [FBS], 4,5 mg/ml glükóz, 4 mM glutamin és 1 mM nátrium-piruvát). Két nappal azután, hogy a sejtek összefolynak, az adipocita differenciálódást M2 tápközeggel (0,5 mM 3-izobutil-1-metilxantint, 1 μM dexametazont és 1,5 μg/ml inzulint tartalmazó M1 tápközeggel) kiegészítve indukáljuk. Két nappal később a táptalajt M3 tápközegre cseréltük (1,5 μg/ml inzulint tartalmazó M1 táptalaj). Az M3 táptalajt 2 naponta cseréltük. A 3T3-L1 zsírsejtek differenciálódását Oil Red O festéssel igazoltuk.

Az oxigénfogyasztás mértékének mérése. A differenciált 3T3 sejteket anti-miR-34a oligonukleotiddal transzfektáltuk, és 48 óra múlva palmitinsavat (2 mM) adtunk hozzá. A sejteket tovább kezeltük 30 perces időközönként oligomicinnel (14 μM), az FCCP farmakológiai szétkapcsolóval (10 μM) vagy a komplex III és I inhibitor antimycin A-val (4 μM [mindegyik]). Az oxigénfogyasztás mértékét XF analizátorral (Seahorse Bioscience, Inc.) mértük.

Az Fgfr1 3′UTR-luc plazmidok felépítése és a luciferáz vizsgálat. Az FGFR1 3 'transzlálatlan régióját (3'UTR) tartalmazó SpeI/HindIII fragmenst amplifikáltuk, és inszertáltuk a pMIR plazmidba. A mutációkat helyspecifikus mutagenezissel végeztük, és DNS-szekvenálással igazoltuk. A Luciferase vizsgálatokat a korábban leírtak szerint végeztük (23–25).

qRT-PCR. A mikroRNS-eket miRNS izolációs készlet (Ambion) segítségével izoláltuk. A miR-34a szintjét kvantitatív reverz transzkripció-PCR-rel (qRT-PCR) határoztuk meg és snoRNS202-re normalizáltuk. Az mRNS-szinteknél az összes RNS-t TRIzollal izoláltuk, és a szinteket qRT-PCR-rel 36B4-re normalizáltuk. Az alapozó szekvenciák az S1 táblázatban találhatók a kiegészítő anyagban.

PGC-1α acetilezés és ChIP vizsgálatok. A WAT szöveteket 3 egérből egyesítettük, és kivonatokat készítettünk, és azonnal felhasználtuk immunprecipitációs (IP) és immunoblotting (IB) acetilezési vizsgálatokhoz, a korábban leírtak szerint (23-25). Az IP-puffer 1 μM trichostatin A-t (TSA) és 10 mM N-acetil-muraminsavat (NAM) tartalmazott a dezacetilezés gátlására. Kombinált anti-miR-34a és siRNS kísérleteket hajtottunk végre 3T3-L1 adipocitákban, hogy meghatározzuk az FGFR1, BKL, SIRT1 és miR-34a hatását az FGF21 jelátvitelre, az AMPK aktivációra, a PGC-1α dezacetilezésre és a mitokondriális DNS kópiaszámra. A barnuló géneknél a PGC-1α és az RNS polimeráz II foglaltságára gyakorolt hatást kromatin IP-vel (ChIP) határoztuk meg, a korábban leírtak szerint (23–25).

EREDMÉNYEK

A miR-34a csökkentése elősegítette a bézsszerű zsírtermelést minden típusú WAT-ban étrend okozta elhízással rendelkező egerekben. Az IHC festési eredmények azt mutatják, hogy a bézs sejtspecifikus CD137 marker (piros), a barnuló UCP1 marker (zöld), valamint egyesített képek vannak gWAT, prWAT és scWAT (A-tól C-ig) és BAT (D) -hez BALB/c egerekből. ND-t vagy HFD-t és kontroll-lentivírust (LE) vagy anti-miR-34a-t expresszáló lentivírust (L-34ai) injektáltunk.

Az miR-34a gátolja a hideg hőmérséklet okozta zsírbarnulást a 3T3-L1 adipocitákban. A legfrissebb bizonyítékok azt mutatják, hogy a miR-k a barna zsír átalakításának fontos szabályozóiként működnek a hideg hatására (18, 19). Mivel a miR-34a elhízásban történő csökkentése megnövelte a bézs és a barna zsírok markereit, megvizsgáltuk a hideg expozíció hatását a miR-34a szintre, és tovább vizsgáltuk a miR-34a lehetséges szerepét az UCP1 zsírbarnuló marker expressziójában differenciált 3T3- L1 adipociták (5A. Ábra). A 3T3-L1 zsírsejtek hideg hőmérsékletnek való kitettsége lényegesen csökkentette a miR-34a szintet, és drámai módon megnövelte a mitokondriális DNS kópiaszámot (5B. És C. Ábra). A barnulással összefüggő Ucp1, Pgc-1a és Prdm16 gének mRNS-szintje, valamint az IHC által kimutatott UCP1 fehérje szintje szintén jelentősen megnőtt a hideg hatására (5D és E ábra). A miR-34a exogén expressziója jelentősen megfordította ezeket a hideg hőmérséklet által kiváltott hatásokat (5B-E. Ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a miR-34a a zsírbarnulás általános inhibitoraként funkcionálhat nemcsak a fent bemutatott elhízási körülmények között (1–4. Ábra), hanem hideg expozíció esetén is.

Az miR-34a gátolja a hideg hőmérséklet által kiváltott UCP1 barna zsírmarkert a 3T3-L1 zsírsejtekben. (A) Kísérleti vázlat differenciált 3T3-L1 adipocitákra. (B-E) A hideg hatásának és a miR-34a adenovírus által közvetített expressziójának hatása a miR-34a szintre (B), mitokondriális DNS kópiaszámra (C), a barnulással kapcsolatos gének mRNS szintjére (D) és a az UCP1 barna zsírjelző, az IHC (E) által kimutatott.

Az adipocita miR-34a és FGFR1-βKL szintje fordítottan korrelál. Ezután az anti-miR-34a által közvetített zsírbarnulás lehetséges mechanizmusait vizsgáltuk elhízott egerekben. A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy az FGF21 elősegíti a barna és a bézs zsírképződést az adaptív termogenezisben (14, 17). Meglepő módon konzervált miR-34a magszekvenciát detektáltunk az FGF21 receptor (FGFR1) 3'UTR-jén belül (6A. Ábra). Ezenkívül korábbi tanulmányokban kimutattuk, hogy a miR-34a gyengítette a máj FGF19 jelátvitelt közvetlenül a βKL célzásával (22). A βKL a májban az FGF19, de a májban és a zsírszövetben található FGF21 membrán coreceptorja is (31). Ezért feltételeztük, hogy a miR-34a legalább részben gátolja az adipozitást és a zsírbarnulást azáltal, hogy az adipocita FGF21 receptor komplexet (FGFR1-βKL) célozza meg. Az elhízott egerek WAT-ban valóban fordított összefüggés volt a miR-34a és az FGFR1-βKL expressziója között a WAT-ban (6B. Ábra), és az inverz korrelációt 3T3-L1 zsírsejtekben is kimutatták (6C és D ábra). ), alátámasztva ezt a hipotézist.

Az miR-34a lebontja az adipocita FGF21 receptor komplexet, az FGFR1-βKL-t, közvetlenül a gének 3'UTR-ére irányul. (A) Potenciális miR-34a célszekvenciák különböző fajok FGFR1 3′UTR szekvenciáiban. A GC, AU és GU ingatag bázis párosítását jelzi. (B) qRT-PCR-rel detektáltuk a miR-34a, valamint az FGFR1 és βKL mRNS szintjét ND-vel vagy HFD-vel táplált egerek WAT-jában. Az adatok középértékek és SEM (n = 6). **, a P miR-34a az FGFR1 közvetlen célzásával gyengíti az FGF21 jelátvitelt. Annak megállapítására, hogy az FGFR1 a miR-34a közvetlen célpontja-e, az FGFR1 3'UTR-ben lévő miR-34a kötő szekvenciát vagy egy mutált szekvenciát beillesztettünk egy luciferáz riporterbe (6E. Ábra). A miR-34a downregulációja növelte a vad típusú (WT) szekvencia riporteraktivitását, de nem a mutált szekvenciát, és fordítva, a miR-34a túlzott expressziója csak a WT szekvencia esetében gátolta a riporter aktivitást (6F. És G. Ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a miR-34a közvetlenül lebontja az FGFR1-et, és hogy a gátlást valószínűleg a miR-34a kötődése közvetíti az FGFR1 mRNS 3'UTR-jéhez.

Az étrendi elhízásban a miR-34a alacsony szintű szabályozása fokozza az FGF21 jelátvitelt. Ezt követően a miR-34a FGF21 jelátvitelre gyakorolt hatását vizsgáltuk differenciált 3T3-L1 zsírsejtekben a funkció növelésének és elvesztésének kísérleteivel. Az ERK FGF21 által közvetített foszforilációja az FGF21 válaszkészség mértéke (31, 32). Az FGF21 kezelés megnövelte az aktivált p-ERK szintjét, de ezeket a hatásokat nem észlelték a miR-34a-t túlzott mértékben expresszáló sejtekben, és fordítva, a miR-34a downregulációja növelte a p-ERK szintjét (7A. És B. Ábra), jelezve, hogy a miR-34a gyengíti adipocita FGF21 jelátvitel.

Az anti-miR-34a fokozta a PGC-1a barnulási gén aktivitását az FGF21/SIRT1-függő dezacetilezés révén. (A) Kísérleti vázlat a 3T3-L1 zsírsejtekhez. (B) SiRNS-kezeléssel csökkent fehérjetartalom. (C-H) Az FGFR1, βKL vagy SIRT1 siRNS által történő csökkentésének hatása p-ERK szintekre (C), p-AMPK szintekre (D), acetilezett PGC-1α szintekre (E), PGC-1α foglaltság barnulási génekre (F), a barnulási gének mRNS-szintje (G) és a mitokondriális DNS kópiaszám (H). Az adatok átlagok és SEM (n = 3). *, P 2014. április 30-án érkezett.

2014. május 19-én visszaküldve módosításra.

Elfogadva 2014. augusztus 27.

2014. szeptember 2-án online elfogadott kézirat.