Az oxidatív stressz szabályozza az adipocita-apolipoprotein E-t és elnyomja az elhízásban való kifejeződését

Absztrakt

CÉLKITŰZÉS-Az apolipoprotein E (apoE) endogén expressziója jelentős hatással van az adipocita lipid anyagcseréjére, és az elhízás jelentősen elnyomja. A zsírszövet-oxidáns stressz az adipocita diszfunkció fontos közvetítőjeként jelenik meg. Ezeket a vizsgálatokat azért végezték el, hogy értékeljék az oxidáns stressz szerepét az adipocita apoE szabályozásában.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREKA C57/BL6 egerekből származó ApoE gén és fehérje expressziót 3T3-L1 adipocitákban vagy érett adipocitákban és zsírszövetekben oxidatív stressz indukciója után értékeltük. Megvizsgálták az elhízott zsírszövet és zsírsejtek válaszát a sovány egerekhez képest az antioxidánsokra is.

EREDMÉNYEK-A sovány egerek 3T3-L1 sejtjeiben vagy az adipocitákban és a zsírszövetben található oxidáns stressz jelentősen csökkentette az apoE mRNS és a fehérje szintjét. Antioxidáns felvétele kiküszöbölte ezt a redukciót. Az oxidáns stresszt a nukleáris faktor-κB (NF-κB) transzkripciós komplex aktiválása kísérte, és az apoE-re gyakorolt hatását egy NF-κB aktivációs gátló eliminálta. Az elhízott egerek frissen izolált zsírszövetének vagy érett zsírsejtjeinek kezelése antioxidánssal fokozta az apoE expressziót, de nem volt hatással a sovány egerek sejtjeire vagy szövetére. A sovány egerek frissen izolált adipocitáinak inkubálása elhízott egerek sztromovaszkuláris sejtjeivel szignifikánsan elnyomta az adipocita apoE-t, összehasonlítva a sovány egerek sztromovaszkuláris sejtjeivel végzett inkubációval, de ezt a szuppressziót megfordították antioxidáns vagy semlegesítő antitest beépítése a tumor nekrózis faktor-α-ba.

KÖVETKEZTETÉSEKAz oxidáns stressz jelentősen modulálja a zsírszövetet és az adipocita apoE expresszióját. Ezenkívül az oxidáns stressz hozzájárul az adipocita apoE elnyomásához az elhízásban. Ez a szuppresszió a zsírszövet sztromovaszkuláris sejtjei és az adipociták kölcsönhatásától függ.

Az elhízást széles körben elismerték a metabolikus és a szív- és érrendszeri betegségek egyre elterjedtebb okaként (1,2). Nemrégiben felismerték azt is, hogy az elhízás krónikus gyulladásos reakcióval társul a zsírszövetben, és hogy ez a gyulladás szorosan összefügg az anyagcsere és a kardiovaszkuláris kockázattal (1,3,4). Az elhízott állatok vagy emberek zsírszövetét a gyulladásos sejtek, elsősorban a makrofágok beáramlása jellemzi sztromovaszkuláris rekeszébe, fokozva a helyi gyulladásos citokinek termelését (5–8). Ugyancsak növekszik a reaktív oxigénfajták (ROS) termelése a zsírszövetben (9). A zsírszövetben az oxidatív stressz mellett fellépő lokalizált gyulladás az adipocita gén expressziójának fontos változásaihoz vezet, amelyek az adipocita lipid anyagcseréjére és a triglicerid tartalmára hatással vannak. A zsírszöveti gyulladás és az oxidatív stressz a keringő gyulladásos citokinek és ROS szisztémás növekedését is előidézi, ami káros hatással van a szisztémás inzulinhatásra és a szubsztrát metabolizmusára (1,9,10).

Az érett adipociták és makrofágok számos közös fehérjét expresszálnak, és ezek egyike az apolipoprotein E (apoE). Makrofágokban az apoE endogén expressziója elsősorban a lipid fluxus elősegítésére szolgál (11,12). Az artériás fal makrofágból származó apoE-jét azonban helyi gyulladáscsökkentő és antioxidáns hatásokkal is összefüggésbe hozták (13–15). Az ApoE magasan expresszálódik a hepatocitákban és a szteroidogén sejtekben is (16–18). A makrofágokhoz hasonlóan ez a két sejttípus is magas lipid fluxust tapasztal a lipoprotein metabolizmus és a szteroid hormon szekréció differenciált funkciói miatt. Az adipociták differenciált funkciójuk részeként magas lipid fluxust is tapasztalnak, és az apoE magas szintű expresszióját először Zechner et al. (19) Újabban meghatározták az endogén módon expresszált adipocita apoE fontos szerepét az adipocita lipid és lipoprotein metabolizmus modulálásában (20).

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Sejttenyésztő táptalajokat, szarvasmarha magzati szérumot (FBS) és antibiotikumokat az Invitrogen (Carlsbad, CA) cégtől vásároltunk. A kecskéből származó apoE antiszérum a International Immunology (Murrieta, CA) cégtől származik. A κBα (foszfo-IκBα) és IκBα antitestek foszfo-inhibitora a Cell Signaling Technology cégtől (Danvers, MA) származott. A TNF-a semlegesítő antitest a Biovision-tól (Mountain View, CA) származott. A nukleáris faktor-KB (NF-KB) aktivációs gátlót, a 6-amino-4- (4a-fenoxifeniletilamino) kinazolint (QNZ) a Calbiochem cégtől vásároltuk. A Liberase blendzyme 3 a Roche cégtől származott. Az inzulint, dexametazont, 3-izobutil-1-metilxantint (IBMX), hidrogén-peroxidot, N-acetil-1-ciszteint (NAC), xantin-oxidázt, hipoxantint, glükóz-oxidázt és BSA-t a Sigma-tól (St. Louis, MO) szereztük be.

Sejtkultúra és a primer adipociták izolálása.

A 3T3-L1 sejteket az American Type Culture Collection-től (Rockville, MD) szereztük be. A sejteket 10% FBS-sel kiegészített Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalajban (DMEM) penicillinnel és sztreptomicinnel 5% -os CO2 inkubátorban 37 ° C-on tartjuk. Két nappal az összefolyás után a sejteket differenciáló közegben inkubálva 0,5 mmol/l IBMX-t, 0,2 μmol/l dexametazont és 10 μg/ml inzulint tartalmazó inkubálással. Három nappal a differenciálási koktél hozzáadása után a sejteket 10 μg/ml inzulint és 10% FBS-t tartalmazó DMEM-be helyeztük. Az összes kísérletet a differenciálás után 10 nappal hajtottuk végre.

ApoE mRNS kvantálás.

A teljes RNS-t izoláltuk zsírszövetből, úszó zsírsejtekből, sztromovaszkuláris sejtekből vagy 3T3-L1 adipocitákból RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA) alkalmazásával. Az első szálú cDNS-t 1 μg teljes RNS-ből szintetizáltuk a Thermoscript RT-PCR rendszer (Invitrogen) alkalmazásával, a gyártó utasításainak megfelelően. Valós idejű PCR-t hajtottunk végre minden mintán az Mx3000p Quantitative PCR rendszer (Stratagene, La Jolla, CA) alkalmazásával, iTaq SYBR Green Supermix és ROX alkalmazásával. Az apoE mRNS relatív mennyiségét a β-aktin mRNS bőségének korrekcióját követően számítottuk ki, és minden kísérletnél a kísérleti kontrollhoz viszonyítva többszörös változásként fejeztük ki (20). Az apoE és β-aktin gének amplifikálásához használt primerpárok az 5'-AGGATCTACGCAACCGACTC-3 ', 5'-GGCGATGCATGTTCCACTA-3' és az 5'-GGCCCAGAGCAAGAGAGGTA-3 ', 5′-GGACTCATC voltak. A reakciótermék tisztaságát az egyes csúcsok olvadási görbéinek vizsgálatával igazoltuk.

Western blottolás.

Az összes fehérjét sejtekből vagy szövetekből extraháltuk radioimmunprecipitation assay pufferrel (0,5% nátrium-deoxikolát, 0,1% SDS, 1% Triton X, 20 mmol/l Trisma bázis, 150 mmol/l NaCl és 5 mmol/l EDTA), kiegészítve proteáz inhibitor koktél. A mintákat 5 percig centrifugáltuk, a felső zsírréteget eldobtuk, és a szolubilizált fehérje tiszta átlátszó rétegét összegyűjtöttük. A teljes fehérjekoncentrációt Bio-Rad DC protein assay alkalmazásával elemeztük. Minden mintán ötven mikrogramm fehérjét vetünk alá SDS-PAGE analízisnek, nitrocellulózra visszük át, és apoE, IκBα foszforilezett IκBα vagy β-aktin antitestekkel vizsgáljuk. A Western blot képeket ImageQuant TL szoftver (GE Healthcare, Piscataway, NJ) segítségével számszerűsítettük, belső terhelés kontrollként β-aktint használva.

NF-κB útvonal bevonása.

Az NF-κB út aktiválását először az IκBα foszforiláció szintjének kimutatásával értékeltük. Miután a 3T3-L1 adipocitákat 1 mmol/l H2O2-mal 0, 1, 5 vagy 10 percig kezeltük, a sejteket lizáltuk foszfatáz inhibitor koktél jelenlétében. Ötven mikrogramm teljes sejtkivonatot Western blot-analízisnek vetünk alá a 32/36 szerin foszforilezett IκBα-ra specifikus antitest alkalmazásával. A blotokat lecsupaszítottuk, és az összes IκBα fehérje ellen antitesttel reagáltattuk. Az NF-κB útvonal érintettségét úgy is értékeltük, hogy QNZ-t (az NF-κB komplex aktiváció gátlója) adtunk a sejtekhez 1 mmol/l H2O2 jelenlétében vagy hiányában.

Sejtes H2O2 mérése.

A sejtes ROS-t fluoreszcens festékkel (5-és-6) -klór-metil-2'7'-diklór-hidroflorezcein-dezacetát-acetil-észter (CM-H2DCFDA; Molecular Probes) alkalmazásával mértük, ahogy azt korábban kisebb módosításokkal leírtuk (24). Glükóz-oxidázzal vagy xantin-oxidázzal végzett kezelést követően a differenciálódott adipocitákat fenolmentes DMEM-mel mostuk, és 2 μmol/l CM-H2DCFDA-val inkubáltuk 45 percig 37 ° C-on. A fluoreszcenciát a BIOTEK Synergy H fluoreszcens lemezolvasó alkalmazásával elemeztük 485 nm gerjesztési hullámhosszon és 530 nm-en. A sejtes ROS-koncentrációt H2O2 standard görbe alkalmazásával számszerűsítettük.

Statisztikai analízis.

A kísérleti csoportok közötti statisztikai különbségeket a Student kétmintás t tesztjével értékeltük. P értékek 70% (4B. Ábra).

Az elhízás a ROS fokozott termeléséhez vezet a zsírszövetben, és korábban kimutattuk, hogy a zsírszövet és az érett zsírsejtek apoE expressziója elhízott egerekben csökkent a sovány egerekhez képest. Ezért ezt követően a ROS potenciális szerepét értékeltük a zsírszövet csökkentésében és az adipocita apoE expressziójának elhízásban való hozzájárulásában. Ehhez a kérdéshez az elhízott és sovány egerek frissen izolált zsírszövetének vagy érett zsírsejtjeinek antioxidáns NAC-val történő kezelésének hatását hasonlítottuk össze (5. ábra). Amint arról korábban beszámoltunk, az ob/ob egerekből izolált zsírszövetekben és adipocitákban az apoE expresszió alacsonyabb, mint a sovány alomtárs kontrolloké (23). A sovány egerekből izolált zsírszövet vagy zsírsejtek kezelése NAC-val nem befolyásolta szignifikánsan az apoE expresszió szintjét. Az elhízott egerekből izolált zsírszövet vagy érett zsírsejtek kezelése NAC-val azonban a zsírszövet mRNS-szintjét ötször, illetve négyszeresére növelte. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a zsírszövet oxidatív stressz fontos tényező, amely hozzájárul a zsírszövet és az adipocita apoE szuppressziójához elhízás esetén.

Az elhízást a gyulladásos sejtek beáramlása jellemzi a zsírszövet sztromovaszkuláris rekeszébe. A stromovaszkuláris rekesz gyulladásos sejtjei és az adipocyták közötti jelzést az adipocita diszfunkciójának jelentős hozzájárulójaként elhízásként azonosították (5–7,30). Ezután azzal a kérdéssel foglalkoztunk, hogy az elhízott egerek zsírszövet-sztromovaszkuláris frakciója képes-e módosítani az apoE expresszióját sovány egerekből nyert adipocitákban (6A. Ábra). A sovány egerek frissen izolált, érett adipocitáit inkubáltuk egyedül, vagy a sovány egerek vagy elhízott egerek sztrovovaszkuláris sejtfrakciójával. 4 órás inkubálás után az elhízott egerek stromovaszkuláris sejtfrakciójával inkubált adipocitákban az apoE mRNS szintje> 80% -kal elnyomott. Ezután azt értékeltük, hogy a sztromovaszkuláris frakció szuppresszív hatása eltér-e az elhízott egerek zsigeri vagy szubkután zsírraktárából izolált sztromovaszkuláris frakciók esetében (6B. Ábra). Az elhízott stromovascularis frakció hozzáadása bármelyik zsírraktárból szignifikánsan elnyomta az adipocita apoE mRNS szintjét, de a visceralis stromovascularis frakció szuppressziója szignifikánsan nagyobb volt, mint a subcutan stromovascularis frakcióé.

A fenti megfigyelések azt mutatják, hogy az endogén apoE expresszió fontos a triglicerid adipociták általi megszerzéséhez extracelluláris trigliceridekben gazdag lipoproteinekből (TGRL). Ily módon az apoE expresszió szintje az adipocitákban befolyásolhatja a lipid megoszlását a keringő TGRL-ekben az adipociták és más szövetek között. Például a csökkent TGRL lipidlerakódás a zsírszövetben, amely a csökkent adipocita apoE expresszióból következik be (például az elhízásnál megfigyelhető), elősegítheti a lipidek májba és izomba történő bejuttatását, ahol ennek a lipidnek a lerakódása szerepet játszik szövetszpecifikus inzulinrezisztencia kialakításában (32 –35). Korábban kimutattuk, hogy a PPARγ agonistákra adott lipogén válasz az apoE -/- adipocitákban még akkor is hibás, ha apoE-tartalmú szérum jelenlétében inkubáljuk. A megnövekedett adipocita apoE expresszió tehát részt vehet a zsírszövet tágulásában is, amely a PPARγ agonisták beadásával figyelhető meg (36–38). Ezek a kérdések további tanulmányozást igényelnek.

A fenti szempontok hangsúlyozzák az adipocita apoE integrálásának fontosságát az adipocita lipid metabolizmusának általános modelljébe. Mint fentebb említettük, az izolált sejtek szisztémás beadása vagy kezelése PPARγ agonistákkal növeli az adipocita apoE expresszióját (21). Ezzel szemben a gyulladáscsökkentő angiotenzin II peptiddel történő kezelés csökkenti az adipocita apoE-t (22). A diéta által kiváltott vagy leptinhiányos elhízás csökkent apoE expresszióhoz vezet, és korábban bebizonyítottuk, hogy a TNF-a csökkenti az adipocita apoE expresszióját (21,23). A jelenlegi kézirat megfigyelései azt mutatják, hogy az elhízásban jelenlévő ROS és oxidáns stressz fontos út az adipocita apoE expressziójának elnyomásában. Ennek az útnak nagy a kórélettani jelentősége, tekintettel a feltárt bizonyítékokra, miszerint a zsírszövetben az oxidatív stressz mind az elhízásban, mind a cukorbetegségben megnövekszik (9,28), két betegség világszerte egyre elterjedtebbé válik.

Megfigyeléseink bizonyítékot szolgáltatnak az adipociták és a zsírszövet sztromovaszkuláris sejtek közötti fontos kölcsönhatásra is az oxidatív stressz indukálásához csökkent apoE expresszióval az adipocitákban. Ez a prooxidáns és proinflammatorikus kölcsönhatás arra utal, hogy a zsírszöveti gyulladást és az oxidáns stresszt csökkentő beavatkozások fokozzák az adipocita apoE expresszióját. A PPARγ agonisták elnyomják a proinflammatorikus fenotípust a makrofágokban, és a zsírszövet makrofágjainak apoptózisát eredményezik (39). Ezenkívül a PPARγ agonisták specifikus gyulladáscsökkentő hatását bizonyították a zsírszövetben (40,41). A PPARγ agonisták tehát mind az adipocita apoE génre gyakorolt közvetlen hatással, mind a zsírszövet gyulladásának elnyomásával növelhetik az adipocita apoE értékét.