A MiR-20a-5p szabályozza a gemcitabin kemoszenzitivitását azáltal, hogy az RRM2-t célozza meg hasnyálmirigyrákos sejtekben, és prediktorként szolgál a gemcitabin-alapú kemoterápia számára.

Huimin Lu, Shan Lu, Dujiang Yang, Ling Zhang, Jun Ye, Mao Li, Weiming Hu; A MiR-20a-5p szabályozza a gemcitabin kemoszenzitivitását azáltal, hogy az RRM2-t célozza meg hasnyálmirigyrákos sejtekben, és prediktorként szolgál a gemcitabin-alapú kemoterápia számára. Biosci Rep 2019. május 1 .; 39 (5): BSR20181374. doi: https://doi.org/10.1042/BSR20181374

mir-20a-5p

Hivatkozási fájl letöltése:

Absztrakt

Az M2 ribonukleotidreduktáz alegység (RRM2) fontos gemcitabinrezisztenciával kapcsolatos génként működik a hasnyálmirigyrákban (PC). Itt azt a potenciális mikroRNS-t kívántuk megvizsgálni, amely az RRM2 célzásával szabályozza a gemcitabin kemoszenzitivitását, és feltárja a miRNS jelölt klinikai jelentőségét a PC-ben. Az MTT-vizsgálat és a Western blot-elemzés feltárta, hogy a PC-sejtekben a hosszú ideig tartó gemcitabin-kezelés gyógyszerrezisztenciát és RRM2-növekedést indukált, és az RRM2 csendje blokkolta a gemcitabin-rezisztenciát. A jósolt nyolc RRM2-hez kapcsolódó mikroRNS közül a miR-20a-5p expressziója mutatta a legnagyobb eltérést a gemcitabin-rezisztens sejtek és a szülői sejtek között. Ezenkívül a Dual-Luciferase riporter génvizsgálat azt mutatta, hogy a miR-20a-5p közvetlenül megcélozta az RRM2 3'UTR-t, ezáltal gátolta az RRM2 expresszióját és legyőzte a PC-sejtek gemcitabin rezisztenciáját. Retrospektív vizsgálat szerint a miR-20a-5p plazma szint korrelált a PC-s betegek gemcitabin rezisztenciájával. A ROC görbe azt mutatta, hogy a miR-20a-5p bőséges szint megjósolhatja a gemcitabin rezisztenciát 89% -os AUC mellett (P

Bevezetés

A hasnyálmirigyrák (PC) halálozási aránya az összes főbb rák közül a legmagasabb, az összes túlélési arány csak körülbelül 5%. A PC-k halálozási aránya Kínában körülbelül 1,14-szeres növekedést mutatott, a 2003. évi 2,85/100 000-ről 2011-re 3,26/100 000-re, éves százalékos változással 1,68 [1]. A kemoterápia a PC elengedhetetlen kiegészítő kezelése, és jelenleg a gemcitabint alkalmazzák. De a gemcitabinnal szembeni rezisztencia a PC-ben végzett hatékony kemoterápia fő akadálya. Sürgősen szükség van a gemcitabin elleni PC-rezisztencia molekuláris mechanizmusának jobb megértésére.

A ribonukleotid-reduktáz (RR) egy olyan enzim, amely katalizálja a dezoxiribonukleotidok képződését ribonukleotidokból, a sejtek replikációjának kritikus folyamatát [2]. Számos szilárd daganat, beleértve a hasnyálmirigyet is, túlexpresszálódik [3]. A bizonyítékok arra utalnak, hogy az RR pozitív szerepet játszik a tumorsejtek proliferációjában és áttétjeiben, valamint a PC kemoterápiában alkalmazott nukleozid analógokkal, köztük a gemcitabinnal szembeni rezisztencia kialakulásában [4]. Az RR egy Rrm1 által kódolt alegységből és egy Rrm2 által kódolt β alegységből áll. Az RRM1 – RRM2 holoenzim biztosítja a dNTP-ket az S-fázisú nDNS replikációjához és helyrehozásához proliferáló sejtekben. A magas szintű RRM1 expresszió korrelál a gemcitabinra adott rossz reakcióval, amely közvetlenül az RRM1-et célozza meg [5]. Míg az alacsony RRM2 expresszió hasnyálmirigyrákban előre jelzi a gemcitabinra adott nagyobb választ [6]. Eközben az RRM2 leütés a tenyésztett sejtekben a ciszplatin rezisztenciát is legyőzi [7]. Kimutatták, hogy az RRM2 expressziója kemorezisztens sejtekben indukálódik gén amplifikációval, transzkripciós aktivációval és talán más, azonosítatlan mechanizmusokkal [8]

Az adatok felhalmozása azt mutatta, hogy a PC patogenezisében mikroRNS-ek (miRNS-ek) vettek részt. A MiRNS-ek kicsi, endogén, nem kódoló RNS-molekulák, amelyek 18–24 nukleotidot tartalmaznak, amelyek az mRNS lebomlását okozzák, vagy gátolják a transzlációt azáltal, hogy komplementer szekvenciákkal kötődnek megcélzott mRNS-jeik 3'-nem transzlált régiójában (3′-UTR) [9]. A génexpresszió miRNS-szabályozása fontos szerepet játszik a szöveti differenciálódásban, a sejtproliferációban, az apoptózisban és a kemorezisztenciában [10,11]. Ezenkívül bizonyos dNTP analógokkal szembeni rezisztencia kapcsolódik a miRNS differenciál expressziójához [12]. Azonban a miRNS szerepe a PC-sejtek kemoterápiára való érzékenységében még nem teljesen ismert, és további vizsgálatra szorul.

Ezért a miRNS és az RRM2 potenciális kölcsönhatásának tanulmányozása és a miRNS-ek hasnyálmirigyrák-terápiákban való felhasználásának lehetőségének további feltárása érdekében arra törekedtünk, hogy meghatározzuk nyolc RRM2-hez kapcsolódó miRNS közvetlen hatását, amelyeket TargetscanSites, picTarSites, RNA22Sites, PITASites vagy miRandaSites jósolt .org algoritmusok a megszerzett gemcitabin rezisztenciáról. Az egyik drámai mértékben csökkent miRNS, a miR-20a-5p szerepe a gemcitabin rezisztenciában szekvenciális vizsgálatra összpontosult.

Mód

Sejtkultúra

Az emberi MIA-PaCa2 hasnyálmirigyrák sejtvonalat és a 293 humán embrionális vese sejtvonalat (HEK293) az American Type Culture Collection (ATCC) cégtől kaptuk. A gemcitabin-rezisztens MIA-PaCa2 sejteket (MIA-PaCa2-GEM) az MIA-PaCa2 sejtek folyamatos kezelésével szelektáltuk növekvő gemcitabin koncentrációban, amikor a sejtek összefolyása elérte a 40–60% -ot, ami 200 nM gemcitabin-rezisztens szubklónokat eredményezett [ 13]. Az összes sejtvonalat 10% FCS-sel és 5% HEPES-sel kiegészített DMEM-ben (18 mmol/l glükóz) tenyésztettük.

Betegadatok, plazma és szövetek

RNS kivonás

A plazma RNS és a tenyésztett sejtek RNS izolálását egy Blood Total RNS Isolation Kit (RP4001, BioTeke, Beijing, China) és Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) felhasználásával végeztük a gyártó protokollja szerint.

Reagensek

A gemcitabin oldatot (Eli Lilly, Indianapolis, IN, USA) sejttenyésztő táptalajban hígítottuk 100 μM alapanyagig, majd a kísérletek céljának megfelelően közvetlenül a sejttenyésztő táptalajhoz adtuk. Az oldószerek végső koncentrációja a táptalajban 0,1% vagy kevesebb volt.

Sejt életképesség

Az életképességet 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium-bromid (MTT) vizsgálattal mértük. Az MIA-PaCa2 vagy MIA-PaCa2-GEM sejteket 96 lyukú lemezekre szélesztettük egy éjszakán át a gemcitabinnal vagy a hordozóval végzett kezelés előtt. SiRNS vagy miR utánzó/inhibitor kezelés céljából a sejteket RNS oligoribonukleotidokkal transzfektáltuk 100 nM gemcitabin jelenlétében vagy hiányában. A kezelés végén 10% v/v 5 mg/ml MTT szer (Sigma-Aldrich) oldatot adunk hozzá 2 órán át. A táptalajt ezután eltávolítottuk, és a sejteket DMSO-ban (Sigma-Aldrich) oldottuk. A relatív citotoxicitást az abszorbancia 570 nm-en történő mérésével határoztuk meg luminométerrel (Molecular Devices, U.S.A.).

Apoptózis

A sejteket FITC-konjugált Annexin V-vel (BD Biosciences, Heidelberg, Németország) és propidium-jodiddal (5 mg/ml) (Sigma-Aldrich) festettük, és Flow Cytometer-vel (Beckton Dickinson, BD Biosciences, Németország) elemeztük [16]. ].

qRT-PCR

Az RNS-koncentrációkat NanoDrop 2000 spektrofotométerrel (Nano Drop Technologies, Wilmington, USA) mértük, és 500 ng teljes RNS-t vagy miRNS-t fordítottunk át cDNS-re a nagy kapacitású RNS segítségével a cDNS KIT-re (Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich, Németország) vagy a Taqman microRNS reverz transzkripciós készlet (Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich, Németország). A valós idejű PCR-t Taqman Gene Expression master keverékkel (Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich, Németország) vagy egy mirVana ™ qRT-PCR miRNS Detection Kit (Ambion, USA) alkalmazásával hajtottuk végre. A miRNS-ek és az U6 belső kontroll primereit a Thermo Fisher Scientific GmbH (Dreieich, Németország), az RRM2 és a belső kontroll GAPDH primereket pedig a Shenggong Company (Shanghai) tervezte és szintetizálta.

Western blot elemzés

Teljes sejt-fehérje kivonatokat készítettünk RIPA lízispuffer segítségével (50 mM Tris, pH 7,4; 150 mM NaCl; 1 mM NaF, NaVO4 és EGTA; 1% NP40; 0,25% nátrium-deoxikolát; 0,2 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid; 1 μg/ml antipain, aprotinin és kimosztatin; 0,1 μg/ml leupeptin; 4,0 μg/ml pepstatin) és Western-blot analízissel detektáljuk a leírás szerint [16]. Az alkalmazott antitestek egér monoklonálisak voltak az RRM2-hez (ab57653, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság), egér monoklonálisak a kaszpáz-3-hoz (ab13585, Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság), egér monoklonálisak a β-Actinhoz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) és HRP-konjugált másodlagos antitest a Santa Cruz Biotechnology-tól (Santa Cruz, Kalifornia, USA).

Lipotranszfekció

A MiR utánzót vagy inhibitort vagy siRNS-t HiPerFEct transzfekciós reagenssel (Qiagen, Hilden, Németország) transzfektáltuk a sejtekbe a gyártó utasításainak megfelelően. A modelltranszfekcióhoz csak transzfekciós reagenst használtunk.

miR-20a-5p utánzó: 5′-UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG-3 ’(MCH01529, abmgood), miRNS Mimic Negative Control (MCH00000, abmgood), miR-20a-5p inhibitor (MIH01529, abmgood) és miRNA abhibitor Negative Control ) a Sigmától vásároltuk.

Dual-luciferáz riporter vizsgálat

Az RRM2 célgén 3′-UTR feltételezett miR-20a-5p kötődési helyét (tömeg vagy mutáció, 3A. Ábra) klónoztuk a szentjánosbogár luciferáz 3 'UTR irányában levő psi-CHECK (Promega) vektorba primer luciferáz szignálként rellina-luciferáz normalizációs szignálként psiRRM2-wt és psiRRM2-mut. Maga a psi-CHECK vektor normalizálásként renilla-luciferáz szignált szolgáltatott, hogy kompenzálja a transzfekció és a betakarított hatékonyság közötti különbségeket. A HEK293 sejtekbe történő transzfektálást Lipofectamine 2000 (Invitrogen) alkalmazásával hajtottuk végre. A Renilla és a szentjánosbogár luciferáz aktivitását 24 órával a Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Mannheim, Németország) transzfekció után mértük luminométerrel (Molecular Devices, U.S.A.). A relilla renilla-luciferáz aktivitásokat a gyártó utasításai szerint elemeztük (Promega, Mannheim, Németország).

Statisztikai értékelés

Az RRM2-hez kapcsolódó miRNS-ek expressziója és a miR-20a-5p közvetlenül megcélozza az RRM2 3′-UTR-t

Az RRM2-hez kapcsolódó miRNS-ek expressziójának különbségeinek kimutatására a MIA-PaCa2 és MIA-PaCa2-GEM sejtek között miRNS expresszió profilálást végeztünk. A TargetscanSites, a picTarSites, az RNA22Sites, a PITASites vagy a miRandaSites.org algoritmusok által előre jelzett mind a nyolc miRNS közül (2A. Ábra) a miR-20a-5p mutatta a legjelentősebb differenciál expressziót (csökkent ~ 75%, P 0,05) (2D ábra). Ezek az eredmények együttesen azt sugallják, hogy a miR-20a-5p drámai módon csökken a GEM-rezisztens hasnyálmirigyrák sejtjeiben, és közvetlenül kötődik az RRM2 3′-UTR előre jelzett szekvenciájához.

Az RRM2-hez kapcsolódó miRNS-ek és a miR-20a-5p expressziója közvetlenül megcélozza az RRM2 3'UTR-t

A miR-20a-5p gátolja az RRM2 fehérje expresszióját és megfordítja a gemcitabin rezisztenciát

A fenti eredmények alapján feltételeztük, hogy a miR-20a-5p blokkolhatja a gemcitabin rezisztenciát azáltal, hogy zavarja az RRM2 expresszióját. A miR-20a-5p utánzó vagy kontroll lipofekcióját alkalmaztuk MIA-PaCa2-GEM sejtekben, ami 48 óra elteltével a miR-20a-5p erősen fokozott expressziójához vezetett a gemcitabin-rezisztens sejtekben (3A. Ábra). Ezzel egyidejűleg az RRM2 fehérje expressziója jelentősen csökkent (3B. Ábra). Végül elvégeztük az MTT vizsgálattal (3C. Ábra, 0–72 óra) és az apoptózis elemzéssel (3D ábra, 72 óra elteltével) kiértékelt idő-válasz kinetikát MIA-PaCa2-GEM sejtekben miR-20a-5p utánzattal vagy kontrollal végzett lipotranszfekció után. gemcitabin jelenlétében. A gemcitabin (100 nM) és az ál- vagy miR-kontroll kombinációja nem volt nyilvánvaló hatással a MIA-PaCa2-GEM sejtekben, míg a miR-20a-5p utánzó erőteljesen csökkentette a MIAPaCa2-GEM sejtek életképességét gemcitabin jelenlétében (3C. Ábra) ). Eközben a miR-20a-5p utánzás és a gemcitabin kombinációja jelentősen fokozta a citotoxicitást az MIA-PaCa2-GEM sejtekben (3D ábra). De a miR-20a-5p inhibitor és a gemcitabin kombinációja nem befolyásolta a sejtek életképességét és a citotoxicitást az MIA-PaCa2-GEM sejtekben (3E és F ábra). Így az emelkedett miR-20a-5p képes volt megcélozni, hogy gátolja az MMR2 fehérje expresszióját és fordított gemcitabin rezisztenciát tanulmányunkban.

A miR-20a-5p az RRM2-t célozza meg a gemcitabin-rezisztencia megfordítása érdekében

A miR-20a-5p prediktorként szolgál a GEM alapú kemoterápia hatékonyságának előrejelzésére hasnyálmirigyrákos betegek első vonalbeli kezelésében

Megbeszélés és következtetés

Jelenleg a hasnyálmirigyrák továbbra is erősen rosszindulatú daganat, és a prognózisa rendkívül gyenge. A gemcitabin-alapú kemoterápia képezte a multimodális terápia magját és javította a hasnyálmirigyrákban szenvedő betegek prognózisát [17], de hatása szerény a magas gyógyszer-rezisztencia miatt. A szövetminták szűrése több miRNS-re meggyőző bizonyítékot tárt fel arra vonatkozóan, hogy a mi-rezisztens rákos sejtvonalakban nagyszámú miRNS-t szabályoznak [18]. Megvizsgáltuk a miR-20a-5p szerepét, egy potenciális miRNS a ribonukleotidreduktáz - RRM2 aktivitás alegységét célozta meg a hasnyálmirigyrákhoz kapcsolódó gemcitabin rezisztenciában a jelen tanulmány.

A gyógyszerrezisztencia gén, az RRM2, csökkenti a gemcitabin farmakológiai aktivitását azáltal, hogy befolyásolja metabolizmusát a hasnyálmirigyrák sejtjeiben [19]. Korábbi bizonyítékok arra utalnak, hogy az RRM2 megjósolhatja a gemcitabinnal kezelt betegek prognózisát, mivel ennek a génnek a hasnyálmirigyrákban való viszonylag magas expressziója rossz prognózissal jár, és azoknál a betegeknél, akiknek nem előnyös a gemcitabin-kezelés, általában magasabb az RRM2-expresszió [20]. . Ezenkívül az RRM2 csökkent szabályozása a hasnyálmirigyrák sejtjeiben növelheti a gemcitabin iránti kemoszenzitivitást [21]. Megfigyeltük, hogy az RRM2 mRNS-je és fehérje egyaránt szabályozott a megállapított gemcitabin-rezisztens hasnyálmirigyrák sejtekben, ami összhangban volt a korábbi vizsgálatokkal [19,20]. Ezenkívül az RRM2 expressziójának siRNS-sel történő csökkentése visszaállította a gemcitabin-rezisztens sejtek érzékenységét erre a gyógyszerre. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az RRM2 alapvető szerepet játszik a gemcitabin-rezisztencia közvetítésében a hasnyálmirigyrák MIA-PaCa2 vonalában, és tovább bizonyította az RRM2 pozitív szerepét a megszerzett gemcitabin-rezisztenciában.

Ezért a miR-20a-5p expressziójának klinikai mintákban történő értékelése döntő fontosságúnak bizonyul a gyógyszerrezisztencia előrejelzésében, mivel bebizonyosodott, hogy az RRM2 kevesebb hasznot eredményez a gemcitabin kezelésben hasnyálmirigyrákos betegeknél, akiknél megemelkedett az RRM2 expresszió [20 ]. Jelen tanulmány szignifikáns összefüggést tárt fel a miR-20a-5p expresszió és a gemcitabin alapú kemoterápiára adott klinikai válasz között hasnyálmirigyrákos betegeknél. Azok a betegek, akiknek magas a miR-20a-5p expressziója, részesültek előnyben a gemcitabin terápiában, szemben az alacsony miR-20a-5p betegekkel. A miR-20a-5p expressziós szintje a gemcitabinra adott klinikai válasz újonnan független előrejelzője lehet hasnyálmirigyrákos betegeknél. Összességében a miR-20a-5p a gemcitabin-alapú kemoterápia hatékonyságának előrejelzőjeként szolgált hasnyálmirigyrákos betegeknél.

Összegzésként bemutatjuk a jelen tanulmányban, hogy az RRM2 gátolja a gemcitabin rákellenes hatását a hasnyálmirigyrák sejtjeiben, és hogy a miR-20a-5p negatívan szabályozza ezt a hatást. A Mia-PaCa2-GEM sejtekben a gemcitabinra adott választ a miR-20a-5p és az RRM2 genetikai manipulációja szabályozza. Ezenkívül a klinikai adatok azt mutatják, hogy a miR-20a-5p erősen expresszáló betegek számára előnyös a gemcitabin alapú kemoterápia a PFS szempontjából. Összességében az eredmények arra utalnak, hogy a miR-20a-5p közvetítette RRM2-vel kapcsolatos gemcitabin-rezisztencia, és a miR-20a-5p jóslatként szolgálhat a gemcitabin-alapú kemoterápia hatékonyságának előrejelzésében hasnyálmirigyrákos betegek első vonalbeli kezelésében.

Szerzői közreműködés

Weiming Hu és Huimin Lu voltak felelősek a tanulmány tervezéséért. Huimin Lu, Shan Lu és Dujiang Yang felelősek az irodalomkeresésért. Huimin Lu, Ling Zhang, Jun Ye és Mao Li voltak felelősek az adatok kinyeréséért és elemzéséért. Weiming Hu és Huimin Lu voltak felelősek a kézirat elkészítéséért. Minden szerző jóváhagyta a kézirat végleges változatát.

Versenyző érdekek

A szerzők kijelentik, hogy a kézirathoz nincsenek versengő érdekek fűződve.

Finanszírozás

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek elismert finanszírozási források.