A nano-szelén és a metformin szinergetikus hatása a 2-es típusú diabéteszes patkánymodellre: Diabéteszes szövődmények enyhítése az inzulinérzékenység, az oxidatív mediátorok és a gyulladásos markerek révén

Szerepek Adatkúra, módszertan, írás - eredeti vázlat

Alexandria Egyetem Természettudományi Kar Biokémiai Tanszéke, Alexandria, Egyiptom

Szerepek Konceptualizálás, Hivatalos elemzés, Vizsgálat, Felügyelet, Validálás, Írás - áttekintés és szerkesztés

Alexandria Egyetem Természettudományi Kar Biokémiai Tanszéke, Alexandria, Egyiptom

Shaymaa A. Abdulmalek,
Mahmoud Balbaa

Cikk
Szerzői
Metrikák
Hozzászólások
Média közvetítés
Peer Review

Ábrák

Absztrakt

Háttér és célkitűzések

Jelen cikkünkben a szelén nanorészecskék (Se-NP) új stratégiáját tárjuk fel a 2-es típusú diabetes mellitus (T2DM) kezelésére a Se-NP-k hatásának vizsgálatával önmagában és szokásos antidiabetikus metforminnal (MET) kombinálva ) magas zsírtartalmú étrendben/streptozotocin (HFD/STZ) által indukált T2DM-ben.

Mód

A HFD-t naponta kiegészítették kísérleti patkányokkal 8 héten keresztül, majd egyszeri alacsony dózisú, 35 mg/kg STZ injekcióval indukálták a T2DM-et. A különböző terápiás stratégiák szinergetikus hatását a diabéteszes szövődményekre a Se-NP-k és a MET beadása után értékeltük 8 héten keresztül. Molekuláris és biokémiai elemzéseket végeztünk, hogy kiderítsük kezelésünk hatékonyságát az inzulinérzékenységen, az oxidatív mediátorokon és a gyulladásos markereken.

Eredmények

Megfigyeléseink kimutatták, hogy a HFD/STZ által kiváltott patkányok toxikus hatást gyakorolnak a szérum- és májszövetekre, és figyelemre méltó oxidatív károsodást és hipergyulladást váltottak ki, ami jelentősen megzavarta az inzulin szignál útvonalát. Kísérleti állatok vagy monoterápiás kezeléssel - két dózisú Se-NP-vel (0,1 és 0,4 mg/kg) és/vagy MET (100 mg/kg) önmagában, valamint a kombinált terápia mellett figyelemre méltó védő antidiabetikus hatást eredményeztek. az éhomi vércukorszint és az inzulinszint jelentős csökkenése 8 hetes kezelés után. Ugyanakkor a pIRS1/pAKT/pGSK-3β/pAMPK aktív inzulinjelző fehérjék szintje jelentősen javult. Ezenkívül a Se-NP-k gyulladáscsökkentő hatást mutattak a citokin expressziójának mérséklésével, és helyreállt az egyensúly az oxidatív stressz és az antioxidáns státusz között. Ezenkívül a antidiabetikus gyógyszer MET beadása szintén jelentős javulást mutatott a cukorbetegség szövődményeiben a kezelési periódus után.

Következtetés

Ez a tanulmány a kombinált Se-NP-k és a MET hatásmechanizmusát nyújtja ígéretes terápiás alternatívaként, amely szinergetikusan enyhíti a diabéteszes szövődményeket és az inzulinrezisztenciát.

Idézet: Abdulmalek SA, Balbaa M (2019) A nano-szelén és a metformin szinergetikus hatása a 2-es típusú diabéteszes patkánymodellre: Diabéteszes szövődmények enyhítése inzulinérzékenység, oxidatív mediátorok és gyulladásos markerek révén. PLoS ONE 14 (8): e0220779. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220779

Szerkesztő: Michael Bader, Max Delbruck Centrum fur Molekulare Medizin Berlin Buch, NÉMETORSZÁG

Fogadott: 2019. május 25 .; Elfogadott: 2019. július 23 .; Közzétett: 2019. augusztus 23

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: A szerzők nem kaptak külön támogatást ehhez a munkához.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az elmúlt években a világméretű járványos krónikus betegségek, például a T2DM, felkeltették a figyelmet. A cukorbetegség prevalenciája 425 millió volt 2017-ben a Nemzetközi Diabétesz Szövetség (IDF) adatai szerint, ez a szám 2045-re várhatóan 629 millióra nő 48% -os növekedéssel. Ezenkívül a cukorbetegség előfordulása a Közel-Keleten és Észak-Afrikában 39 millió volt 2017-ben, és 110% -os növekedéssel 2045-re 82 millióra nő. A cukorbetegség minden típusa közül a T2DM teszi ki a cukorbetegség eseteinek túlnyomó többségét, mintegy 90% -ot (IDF Diabetes Atlas. 2017). Számos tanulmány célja, hogy tisztázza a T2DM-ben felmerülő és az T2DM patogenezisének egyik fő jellemzőjének számító IR kialakulásában szerepet játszó inzulin jelátviteli útvonalak metabolikus és molekuláris változásait [1]. Nyilvánvaló, hogy az inzulin jelátviteli út azáltal kezdődik, hogy az inzulin kötődik a célsejteken lévő receptoraihoz. Ezután az aktivációs események a sejtekben az β inzulinreceptor és az IRS1 aktiválásával kezdődnek, ezáltal a PI3K-t annak helyére toborozzák. A májsejtekben a PI3K fő célpontja az AKT, amely kulcsszerepet játszik a glükózfelvételben [2]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a pIRS1 és a pAKT up-szabályozása fontos szerepet játszik a glükózfelvétel javításában és vérszintjének szabályozásában [3].

A diabéteszes betegek több kóros tulajdonsággal rendelkeztek, beleértve a gyulladást és az oxidatív stresszt. A szelén hatékony gyulladáscsökkentő és antioxidáns hatásának köszönhetően számos vizsgálat feltárta a kapcsolatot a DM és a szelén szérumszintje között. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a magasabb szelénszint a T2DM fejlődésének alacsonyabb kockázatával függ össze [16, 17, 18]. Érdekes módon a Se-NP-k antioxidáns és gyulladáscsökkentő aktivitásuk mellett belső hipoglikémiás hatással bírnak, így a T1DM és a T2DM Se-NP-vel kezelhető az oxidatív stressz enyhítésén és az inzulin szenzibilizálásán keresztül [19].

Jelen tanulmányban Se-NP-ket készítettünk egylépéses módszerrel úgy, hogy aszkorbinsavval redukáltuk a nátrium-szelenitet. A részecskék aggregációjának megakadályozása és a stabilitás javítása érdekében dextrint vezettek be a redox rendszerbe. Magas biohasznosulásuk, alacsony toxicitásuk és újszerű terápiás tulajdonságaik miatt a Se-NP-ket a T2DM-ben alkalmazott gyógyszeres terápiák ígéretes eszközének ismerték el. Ebben a tanulmányban új terápiás stratégiákat dolgoztunk ki a T2DM számára, hogy tisztázzuk a Se-NP-k és/vagy Se-NP-k két dózisának MET-vel kombinált alkalmazásának potenciális szerepét annak megvizsgálása érdekében, hogy a Se-NP-k képesek-e antidiabetikus aktivitást mutatni, vagy akár in vivo javíthatja a terápiás hatást. Értékeljük továbbá a Se-NP-k moduláló szerepét az HFD/STZ-diabéteszes patkányok májszövetében az oxidatív károsodás enyhítésében, valamint az antioxidáns védekező képesség helyreállításában. Továbbá megvizsgáljuk, hogy a Se-NP-k és a MET szájon át történő beadása késleltetheti-e az IR megjelenését, esetleg befolyásolva az inzulin szignál és a gyulladás útját.

Anyag és módszerek

Anyagok és vegyszerek

TRIzol RNS izoláló reagensek (katalógusszám: 15596026, Invitrogen). EXPRESS egylépéses SYBR GreenER készlet, univerzális (katalógusszám: 11780200, Invitrogen). DEPC-vel kezelt víz (katalógusszám: D5758), Triton X100 (CAS-szám: 9002-93-1), STZ (fehér vagy sárga por, CAS-szám: 18883-66-4). HEPES, Trypan Blue és MTT (Sigma-Aldrich, USA). Magzati marhaszérum, RPMI-1640, HEPES pufferoldat, L-glutamin és gentamicin (Lonza, Belgium). Az alapozó szekvenciákat (2 ml-es csavaros kupakú csőben szárítva) a Sigma-Aldrich-től (USA) szereztük be. Idetartozó antitestek, [anti-AKT1 (NBP2-01724) vagy anti-AKT1-p ser473 (NBP2-35349)], [anti-GSK-3β (MAB2506) vagy anti-GSK-3β-p Ser9 (NB100-81948)], [anti-IRS1 (NB100-82001) vagy anti-IRS1-p Tyr612 (NBP1-73967)], [anti-AMPK alfa (MBS835324)], [anti-AMPK-alfa-p T172 (MBS462009)] [anti- p65-p Ser536 (NB100-82088)], [anti-COX2 (NB100-689)] és [anti-p-aktin (NB600-501)]. TNF-α (katalógusszám: MBS355371), iNOS (katalógusszám: MBS723326). Az IL-6 (katalógusszám: MBS355410), IL-1β (katalógusszám: MBS825017), AGE-k (katalógusszám: MBS774145) és patkány inzulin (katalógusszám: MBS760915) vizsgálati készleteket a Mybiosource (San Diego, Kalifornia, USA) szállította. . MET tablettát (500 mg) az Eva Pharma-tól (Egyiptom) vásároltak. Oldószereket és egyéb kapcsolódó biokémiai reagenseket, beleértve a nátrium-szelenitet, a nátrium-dodecil-szulfátot, a Tween 20-at és más általánosan használt reagenseket, kiváló minőségű termékekkel kaptuk a Sigma-Aldrich-től, USA.

Se-NP készítése

A Se-NP-k szintézisét Qian Li és munkatársai által leírt módszer szerint hajtották végre. [26] néhány módosítással. Nátrium-szelenit (100 mM) és aszkorbinsav (50 mM) törzsoldatokat készítettünk. A reagált nátrium-szelenit: aszkorbinsav arányt (1: 1, 1: 2, 1: 3, 1: 4, 1: 5 és 1: 6) a törzsoldatban változtattuk. Mágneses keverés közben az aszkorbinsav-oldatot 30 percig szobahőmérsékleten cseppenként hozzáadjuk a nátrium-szelenit oldathoz. Ezután a keverékeket addig hagytuk reagálni, amíg megfigyelték a szín színtelenről világos vörösre váltását. Ezt követően az elegyet Milli-Q vízzel 25 ml-re hígítottuk.

A Se-NP bevonata

A korábban előállított Se-NP-t 5% -os koncentrációjú Dextrinnel vontuk be, amelyet a szín megjelenése után mágneses keverővel, szobahőmérsékleten, egyrétegű bevonási módszerrel adtunk hozzá. Az elkészített nanorészecskéket dextrin oldattal hígítottuk víz hozzáadása helyett. Végül a nanorészecskéket liofilizátorral mossuk és szárítjuk. Az elkészített nanorészecskéket TEM alkalmazásával jellemeztük.

Átviteli elektronmikroszkóp (TEM)

Se-NP-ket készítettünk a TEM-elemzéshez úgy, hogy a nanorészecske-szuszpenzió egy cseppjét szénnel bevont rézrácsokra helyeztük. Infravörös lámpa alatt a mintákat megszárítottuk, majd a képeket TEM Philips CM 200 műszerrel rögzítettük, 80 KV működési feszültséggel és legfeljebb 2,4 Aᵒ felbontással.

Citotoxicitási vizsgálat

Sejtvonal és karbantartás.

Sprague-Dawley hím patkányokat (200–250 g) az Alexandria Egyetem Orvostechnikai Központ állattartó házából nyertünk. A májsejtek izolálását a Reese és Byard által leírt kollagenáz perfúzióval hajtották végre [27]. A hepatocitákat (1x106 sejt/ml) 12,5 mM HEPES-t tartalmazó Krebs-Henseleit pufferba (pH 7,4) helyeztük, és 37 ° C-on tartottuk 95% O2 és 5% CO2 tartalommal. A kísérletekben a Trypan Blue-val mért 90% -ot meghaladó életképességű májsejteket használtuk [28].

Citotoxicitási vizsgálat.

A Se-NP-k in vitro antioxidáns bioaktivitása

DPPH gyökfogó tevékenység.

A DPPH vizsgálatot a szintetizált Se-NP-k szabadgyök-eltávolító aktivitásának kimutatására Patel Rajesh és Patel Natvar [29] által leírt módszerrel végeztük, némi módosítással. Az előállítás után a szintetizált Se-NP-k és a szokásos aszkorbinsav sorozatkoncentrációihoz (0,25, 0,5, 1, 1,5 és 2 mg/ml) hozzáadtuk a DPPH-oldatot és metanollal hígítottuk. 15 perc elteltével az abszorbanciát 517 nm-en olvastuk le, metanolt használva vakként. A kontroll leolvasáshoz 150 μl DPPH-oldatot adtunk 3 ml metanolhoz, és az abszorbanciát azonnal felvettük 517 nm-en. A DPPH gyökfogó aktivitásának kiszámítását a következő képlet segítségével hajtottuk végre:

% kitisztítás =, ahol A0 a kontroll abszorbanciája és A a vizsgálati minta abszorbanciája.

NINCS radikális eltávolító tevékenység.

Sreejayan és Rao [30] módszerével NO-tisztító tevékenységet nem végeztek. A szintetizált Se-NP-k, valamint az aszkorbinsav (standard) 0,25, 0,5, 1, 1,5 és 2 mg/ml sorozatkoncentrációit elkészítjük, DMSO-ban oldjuk, és 2,0 ml nátrium-nitropruszidot (10 mM) foszfátpuffer sóoldatban oldunk. mindegyikhez adjuk, és 150 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubálás után az összes csőbe 5 ml Griess-reagenst adunk, a kontrollt is beleértve. Az abszorbanciát 546 nm-en mértük az UV-látható spektrofotométerrel; metanolt használtunk vakként. A kitermelési aktivitás százalékát a fentiek szerint számoltuk.

Hidrogén-peroxid-eltávolító aktivitás.

A Se-NP-k hidrogén-peroxid-eltávolító képességét spektrofotometriásan vizsgáltuk [31]. Különböző koncentrációjú szintetizált Se-NP-ket, valamint 0,25, 0,5, 1, 1,5 és 2 mg/ml aszkorbinsavat (standard) adtunk 0,6 ml 2 mM hidrogén-peroxid-oldathoz, amelyet pH = 7,4 foszfátpufferban készítettünk. Az abszorbanciát egy vak oldattal (foszfátpuffer) mértük 230 nm-en, és összehasonlítottuk az aszkorbinsavval (standard). A hidrogén-peroxid-eltávolító hatás százalékát a fentiek szerint számítottuk.

Csökkentő teljesítményvizsgálat.

A Se-NP-k redukáló erejét Yildirim et al. [32]. Különböző koncentrációban szintetizált Se-NP-ket, valamint aszkorbinsavat (0,25, 0,5, 1, 1,5 és 2 mg/ml) összekevertünk 2,5 ml foszfátpufferrel (0,2 M) és 2,5 ml kálium-ferricianiddal (1%). A Se-NP-k és az aszkorbinsav keverékét 20 percig inkubáltuk 50 ° C-on. Lehűtés után 2,5 ml 10% triklór-ecetsavat adunk az elegyekhez, és 10 percig 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. 2,5 ml felülúszót összekevertünk 0,5 ml frissen készített FeCl3-dal (0,1%). Ezután az abszorbanciát 700 nm-en mértük. A redukáló teljesítmény vizsgálati százalékát a DPPH assay-ban leírtak szerint számítottuk.

Teljes antioxidáns kapacitás vizsgálat.

A Se-NP-k TAC-vizsgálatát Umamaheswari és Chatterjee standard módszerével határozták meg [33]. Különböző koncentrációjú Se-NP-ket és aszkorbinsavat (0,25, 0,5, 1, 1,5 és 2 mg/ml) adtunk 1,0 ml kénsavat (0,6 M), nátrium-foszfátot (28 mmol) és ammónium-molibdátot (4,0) tartalmazó oldathoz. mmol). Az elegyeket 90 percig inkubáltuk 95 ° C-on. Az abszorbanciát 695 nm-en történő lehűlés után mértük. A gátlást a DPPH assay-ban leírtak szerint számítottuk.

Kísérleti állatok

Kísérleti terv

Hat normál étrendben részesülő nem diabéteszes kontrollcsoportot az alábbiak szerint osztottunk fel: