A napraforgóolaj-kiegészítés befolyásolja a miR-20a-5p és miR-142-5p a szoptató szarvasmarha emlőmirigyében

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, formális elemzés, vizsgálat, módszertan, erőforrások, szoftver, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

befolyásolja

GABI, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, Franciaország, INRA, UMR1213 Növényevők, Saint Genès Champanelle, Franciaország, Clermont Université, VetAgro Sup, UMR Növényevők, Clermont-Ferrand, Franciaország

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, vizsgálat, módszertan, vizualizáció, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulás GABI, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, Franciaország

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, vizsgálat, módszertan, szoftver, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulás GABI, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, Franciaország

Szerepek Formális elemzés, vizsgálat, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulás GABI, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, Franciaország

Szerepek Formális elemzés, vizsgálat, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulás GABI, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, Franciaország

Szerepek Formális elemzés, vizsgálat, írás - áttekintés és szerkesztés

Társulások INRA, UMR1213 Növényevők, Saint Genès Champanelle, Franciaország, Clermont Université, VetAgro Sup, UMR Növényevők, Clermont-Ferrand, Franciaország

Egyformán közreműködött ebben a munkában: Fabienne Le Provost, Christine Leroux

Szerepek konceptualizálás, finanszírozás megszerzése, projekt adminisztráció, erőforrások, felügyelet, validálás, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - ellenőrzés és szerkesztés

Társulás GABI, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, Franciaország

Egyformán közreműködött ebben a munkában: Fabienne Le Provost, Christine Leroux

Szerepek konceptualizálás, finanszírozás megszerzése, projekt adminisztráció, erőforrások, felügyelet, validálás, vizualizáció, írás - eredeti vázlat, írás - ellenőrzés és szerkesztés

Társulások INRA, UMR1213 Fűevők, Saint Genès Champanelle, Franciaország, Clermont Université, VetAgro Sup, UMR Herbivores, Clermont-Ferrand, Franciaország

  • Lenha Mobuchon,
  • Sandrine Le Guillou,
  • Sylvain Marthey,
  • Johann Laubier,
  • Denis Laloë,
  • Sébastien Bes,
  • Fabienne Le Provost,
  • Christine Leroux

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Mobuchon L, Le Guillou S, Marthey S, Laubier J, Laloë D, Bes S és mtsai. (2017) A napraforgóolaj-kiegészítés befolyásolja a miR-20a-5p és miR-142-5p expresszióját a szoptató szarvasmarha emlőmirigyében. PLoS ONE 12 (12): e0185511. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0185511

Szerkesztő: Juan J. Loor, Illinoisi Egyetem, AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Fogadott: 2017. április 27 .; Elfogadott: 2017. szeptember 14 .; Közzétett: 2017. december 27

Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, minden szerzői jogtól mentes, és bárki szabadon reprodukálhatja, terjesztheti, továbbíthatja, módosíthatja, továbbépítheti vagy más módon felhasználhatja bármilyen törvényes célra. A mű a Creative Commons CC0 közkincs dedikációja alatt érhető el.

Adatok elérhetősége: Az ebben a cikkben leírt összes szekvencia letölthető. A Hiseq2000 szekvenszer RNS-seq adatait elküldtük a GEO adattárba. GSE81616.5 csatlakozási szám alatt vannak besorolva.

Finanszírozás: Ezt a munkát az INRA, az ApisGène (http://www.apis-gene.com/, a NutriMirMa projekt keretében az LM-nek nyújtott támogatások) és az AIP BioRessources támogatta.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A legújabb adatok szerint a bioaktív élelmiszer-összetevők (mikro- és makrotápanyagok) befolyásolják a miRNS-ek expressziós profilját vagy működését [36–40]. Például egerek retroperitoneális zsírszövetében a konjugált linolsavkezelés módosította a miR-103, miR-107, miR-143, miR-221 és miR-222 expresszióját, és expressziójuk korrelált az erősen expresszált génekkel az adipocitákban és a lipid anyagcserével kapcsolatos [41]. Kérődzőknél kevés tanulmány vizsgálta a táplálkozás miRNS expresszióra gyakorolt ​​hatását. Romao és munkatársai kimutatták, hogy nyolc miRNS expresszióját az őzek hátsó zsírjában és perirenális zsírjában erősen befolyásolta a magas zsírtartalmú étrend [42]. Újabban arról számoltak be, hogy a bárányok szubkután és zsigeri zsírszöveteiben található 11 miRNS expresszióját befolyásolja az almalisztnek a lenolajból történő megváltozása [43]. Nagyon kevés adat áll rendelkezésre az emlőmirigy miRNS-expressziójának táplálkozási szabályozásáról. Egy kezdeti nutrigenomikai tanulmány a 30 miRNS expressziójának változásáról számolt be táplálkozási korlátozással a szoptató kecskékben [44]. Nemrégiben Li és munkatársai [45] kimutatták, hogy a 14 és 22 miRNS expresszióját a szoptató tehenek emlőmirigyében lenmag és sáfrányos kezelés befolyásolta, ill.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat és állatok

Sejttranszfekció

Az RNS izolálása

RNS mintákat készítettünk 50 mg emlőszövetből a Nucleospin® miRNS izolációs készlet (Machery-Nagel, Inc.) felhasználásával, amint arról Le Guillou és mtsai. [13]. Az RNS-t 3 M nátrium-acetát, 96% etanol és 5 mg/ml glikogén felhasználásával kicsapjuk. Sejtkultúrákból előállított RNS-minták esetében a sejteket PBS-sel öblítettük, majd az RNS-t az RNA Now kit (Ozyme) felhasználásával extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően, beleértve az éjszakai kicsapást is, hogy garantáljuk a miRNS maximális hozamát. Az RNS koncentrációját és tisztaságát spektrofotometriával becsültük (NanodropTH, ND-1000).

Könyvtár előkészítés, szekvenálás és adatfeldolgozás

Nagy teljesítményű szekvenálást végeztünk két LF és két LF-SO könyvtárban. Két tehén RNS-ét egyesítettük, hogy minden könyvtárat előállítsunk. A készleteket egyenlő mennyiségű (10 μg) RNS felhasználásával nyertük, véletlenszerűen kiválasztott két tehén emlőszövetéből. A könyvtár előkészítési és szekvenálási technikákat Le Guillou et al. [13]. Röviden, a könyvtárakat az Illumina kis RNS készletével készítettük, emlőmirigyből izolált RNS-sel, majd az Illumina HiSeq 2000-en végzett szekvenálást a GATC biotech Company (Next Gen Lab) a Solexa szekvenálási módszer szerint. Az RNS-seq adatokat ezután főleg miRDeep2 szoftverrel elemeztük [49], és Le Guillou et al. [13].

Fordított transzkripció és kvantitatív PCR

A miRNS reverz transzkripcióját nyolc miRNS-n végeztük, a nagy áteresztőképességű szekvenálási adatokban való bőség, a csoporton belüli stabilitás és a hajtásváltozás (S1 táblázat) alapján: miR-15a-5p (TaqMan® ID 005892_mat, Applied Biosystems), miR-17-5p (TaqMan® ID 002308), miR-20a-5p (TaqMan® ID 00580), miR-33a-3p (TaqMan® ID Custom Assay), miR-126-3p (TaqMan® ID 008451_mat), miR -142-5p (TaqMan® ID 000465), miR-181a-5p (TaqMan® ID 000480), miR-223-3p (TaqMan® 002295). A reverz transzkripciót és a kvantitatív PCR-t (qPCR) a TaqMan® MicroRNS reverz transzkripció és TaqMan® Small RNS Assay (Applied Biosystems) alkalmazásával hajtottuk végre, a Mobuchon és mtsai. [21].

Sejtkultúrákból származó génvizsgálatokhoz fordított transzkripciót hajtottunk végre 500 ng teljes RNS-en a SuperScript® VILO cDNS szintézis készlet segítségével a gyártó utasításai szerint (Invitrogen) és a következő körülmények között: 42 ° C 60 percig és 85 ° C 5 perc. A mennyiségi PCR-futtatásokat ABsolute Blue QPCR Mix, SYBR Green® (Thermo Scientific ™) felhasználásával, a gyártó utasításai szerint, Mastercycler Ep Realplex rendszeren (Eppendorf) végeztük, az alábbi körülmények között: 95 ° C-on 15 percig, 45 ciklusig 95 ° C 15 másodpercig és 60 ° C 1 percig, és olvadási görbe. Az ELOVL6 (F 5'-CAATATTTTCCCAGGGTTCTCC-3 'és R 5'-AGCTGCCCTTTCAAGAGTTG-3') és a TWF1 (F 5'-GGCATCCAAGCAAGTGAAGA-3 'és R 5'-GCTTCCCACACAAC' C a GAPDH (GlycerAldehyde-3-foszfát-dehidrogenáz F 5'-ATGGTGAAGGTCGGAGTGAA-3 'és R 5'-ACGATGTCCACTTTGCCAGA-3') értékeit, és az eredményeket a 2-ΔΔCt módszer [50].

Statisztikai analízis

A miRNomes összehasonlítására szolgáló statisztikai elemzést az R 3.0.1 verzióval (R Development Core Team, 2013) és a DESeq2 biovezetõ csomaggal végeztük [51], Le Guillou és mtsai. [13]. Az adatokat a HTSFilter Bioconductor csomag segítségével szűrtük [47]. Ennek a módszernek az a célja, hogy meghatározza azt a küszöböt, amely maximalizálja a biológiai replikátumok szűrési hasonlóságát, vagy más szavakkal azt, hogy ahol a legtöbb gén normalizálódási száma általában alacsonyabb vagy egyenlő az összes minta (azaz szűrt gén) határértékével, vagy magasabb mint a határérték legalább egy mintában (azaz nem szűrt gének). Ezt a küszöbértéket megegyezőnek találták 199-vel. A p-értékeket többszörös tesztelés céljából a Benjamini-Hochberg módszerrel [52] állítottuk be, a korrigált p-értékkel rendelkezőket pedig 1. táblázat.

A tehenek alacsony takarmányú étrendben (LF) vagy ugyanabban az étrendben részesültek, 4% napraforgóolajjal kiegészítve (LF-SO).

HTSFilter csomagot [54] alkalmaztunk a miRNS eltávolítására, amely látszólag nem informatív jelet generált egy szűrési küszöb azonosításával, amely maximalizálja az úgynevezett szűrési hasonlóságot a replikátumok között. E szűrő után a miRNS-ek száma 272-re csökkent (S1 kiegészítő táblázat). Ezek közül 18 előrejelzett miRNS-t találtak, amelyeket egyetlen fajnál sem azonosítottak, és ezért potenciálisan új miRNS-nek tekinthetők [13].

Változások a szarvasmarha-emlőmirigyben miRNome a napraforgóolaj-kiegészítés függvényében

Az elemzéseket 2 RNS medencén végeztük, 2 tehén kapott qPCR és NGS módszerrel kapott LF vagy LF-SO étrendet. A tehenek alacsony takarmányú étrendet (LF) vagy ugyanezt az étrendet kapták, kiegészítve 4% napraforgóolajjal (LF-SO), n = 2.

Az RT-qPCR elemzéseket 11 tehénről végeztük LF vagy LF-SO étrendben. A tehenek alacsony takarmány-étrendet (LF) vagy ugyanezt az étrendet kapták, kiegészítve 4% napraforgóolajjal (LF-SO). ** 0,01

Az előrejelzések szerint a miR-20a-5p és a miR-142-5p a napraforgóolaj által differenciáltan expresszált géneket célozza meg

A miR-20a-5p és miR-142-5p funkcionális szerepének vizsgálatához számítási alkalmazásokat használtak a célok előrejelzésére. A száz lehetséges célpont között néhány gén részt vett a lipid anyagcserében (2. táblázat) és a közös szabályozási utakban (3. ábra).

ABCA1: ATP-kötő kazetta A (ABC1) alcsalád1, BTN1A1: BuTyrophiliN 1 alcsalád, A1 tag, LPIN1: LiPIN1, PPARγ: Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma, PPARGC1B: Peroxisome Prolorator Saktivátor-Beta-aktivátor -CoA Desaturase, VLDLR: Nagyon alacsony sűrűségű lipoprotein lipáz receptor.

Azonos mintákon eltérő módon expresszált géneket (DEG) korábban transzkriptikus elemzésekkel detektáltak [46]. A DEG funkcionális kategóriákba történő besorolása (a Gene Ontology annotáció nyomán) három, az anyagcserében részt vevő génosztályt azonosított a DEG 30% -ában, kiemelve a napraforgóolaj emlő anyagcserére gyakorolt ​​hatását, beleértve a lipid anyagcserét is. Ezek közül a miEG-20-5p és miR-142-5p feltételezett célpontjait vizsgáltuk. A feltételezett, a kezelésre fordított választ mutató célpontok közül a miRNS-adatokhoz képest kilenc DEG-t emeltünk ki (3. táblázat). Megállapították, hogy a lefelé szabályozott miR-20a-5p nyolc felfelé szabályozott DEG-t (ELK4 (ETS transzkripciós faktor), ELOVL6 (zsírsav-elongáz 6), ETV1 (ETS 1. variáns), KDM6B (lizin-demetiláz 6B), KIAA1524, A LONP2 (lon peptidáz 2, peroxiszomális), az M6PR (mannóz-6-foszfát receptor, kationfüggő), az USP12 (ubiquitin-specifikus peptidáz 12)) LF-SO tehenekben, és a miR-142-5p négy megszabályozott DEG (ELK4, ELOVL6, ETV1, PIK3CD (foszfatidil-inozitol-3-kináz katalitikus delta polipeptid)). Mindkét miRNS potenciálisan megcélozta az ELK4-et, az ETV1-et és különösen az ELOVL6-gént, amely a zsírsav-metabolizmusban szerepet játszó enzimet, a zsírsav-elongázt kódolja (4. ábra).

A miR-20a-5p és miR-142-5p hatása az ELOVL6, a lipid metabolizmusban szerepet játszó gén expressziójára