A normokaloros alacsony koleszterinszintű étrend modulálja a Th17/Treg egyensúlyt krónikus hepatitis C vírusfertőzésben szenvedő betegeknél

Molekuláris virológiai és onkológiai laboratórium, Francesco Balsano Alapítvány, Róma, Olaszország, Molekuláris Biológiai és Patológiai Intézet, Nemzeti Kutatási Tanács, Róma, Olaszország

Molekuláris virológiai és onkológiai laboratórium, Francesco Balsano Alapítvány, Róma, Olaszország

Hovatartozás prediktív orvostudományi egység, Sapienza Egyetem, Róma, Olaszország

A Sapienza Egyetem közegészségügyi és fertőző betegségek tagozatának osztálya, Róma, Olaszország

Hovatartozás prediktív orvostudományi egység, Sapienza Egyetem, Róma, Olaszország

Molekuláris virológiai és onkológiai laboratórium, Francesco Balsano Alapítvány, Róma, Olaszország

A Sapienza Egyetem közegészségügyi és fertőző betegségek tagozatának osztálya, Róma, Olaszország

Roberta Maggio,
Carmela Viscomi,
Paola Andreozzi,
Gabriella D'Ettorre,
Giovanni Viscogliosi,
Barbara Barbaro,
Manuele Gori,
Vincenzo Vullo,
Clara Balsano

Ábrák

Absztrakt

Próba regisztráció

Idézet: Maggio R, Viscomi C, Andreozzi P, D'Ettorre G, Viscogliosi G, Barbaro B és mtsai. (2014) A normokaloros alacsony koleszterinszintű étrend modulálja a Th17/Treg egyensúlyt krónikus hepatitis C vírusfertőzésben szenvedő betegeknél. PLoS ONE 9 (12): e112346. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0112346

Szerkesztő: Salvatore Petta, Università degli Studi di Palermo, Olaszország

Fogadott: 2014. május 5 .; Elfogadott: 2014. október 1 .; Közzétett: 2014. december 22

Adatok elérhetősége: A szerzők megerősítik, hogy az eredmények alapjául szolgáló összes adat korlátozás nélkül teljes mértékben elérhető. Minden lényeges adat a cikkben található.

Finanszírozás: Ezt a projektet az alábbiaktól kapott támogatások támogatták: Oktatási, Egyetemi és Kutatási Minisztérium (MIUR) - Nemzeti érdekű kutatási projektek (PRIN) (prot. 2009, YNERCE); MIUR- Alapkutatásba történő befektetési alap (FIRB) (prot. 2010, RBAP10A9H9); MIUR-FIRB (prot. 2010, RBAP10TPXK). Különösen R. Maggio ösztöndíját az Umberto Veronesi Alapítvány támogatta. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A hepatitis C vírus (HCV) fertőzés világszerte körülbelül 170 millió embert érint; a fertőzés akut fázisa ritkán tisztul meg, és a betegek többsége krónikusan megfertőződik. A HCV krónikus fertőzését gyakran a lipid-anyagcsere rendellenességei jellemzik, amelyek máj steatosishoz vezetnek [1]. Ezenkívül a lipid anyagcserének és a koleszterinnek kulcsszerepe van a vírus életciklusában [2]. Különösen a plazma membrán koleszterin szükséges a HCV bejutásához [3]; ráadásul a HCV replikációja koleszterinben gazdag doménekben zajlik a vírusreplikációs komplexen belül [4]. A közelmúltban az étrend magasabb koleszterin-bevitele a HCV-vel összefüggő májbetegség progressziójához kapcsolódott [5]. Ezért a koleszterinbevitel étrendi módosítása innovatív stratégiát jelenthet a HCV-fertőzés progressziójának csökkentésére.

Ezenkívül a legújabb tanulmányok kiemelik, hogy a Th17 sejt-differenciálódás szabályozható az LXRα és LXRβ néven ismert nukleáris receptor LXR-ekkel (Liver X Receptors) [20], [21]. Ezek a nukleáris receptorok a lipid anyagcsere és a koleszterin homeosztázis fontos modulátoraként működnek azáltal, hogy olyan géneket szabályoznak, mint az SREBP-1c (szterin szabályozó elemet megkötő fehérje 1c) és az ABCA-1 (ATP-t kötő kazetta transzporter-1) [22]. Ezért, figyelembe véve a koleszterin fontosságát a HCV életciklusa szempontjából [2], valamint az LXR-ek bevonását az immunválasz modulációjába, úgy gondoltuk, hogy a koleszterin [23], [24], LXR-közvetített jelzéssel [23]. ], [24] kulcsfontosságú elem lehet a T-limfociták Th17 sejtekben történő differenciálódásának szabályozásában. Ezenkívül a CHC-betegek magas szérum oxiszterolszintet, az LXR-ek endogén ligandumait és a koleszterin-oxidáció termékeit mutatják [25]. Továbbá közvetlen kölcsönhatásról számoltak be a HCV-magfehérje és az Retinoid X Receptor (RXR) alfa [26], [27] között, amely az LXR-ek jól ismert heterodimer partnere. Tehát az RXR/HCV-mag komplex szabályozhatja az LXR-aktivitást a HCV-fertőzés alatt, támogatva a HCV hatását az LXR-ekre és viszont a Th17 sejtek gyakoriságára, így potenciálisan befolyásolva a gazda immunrendszerét.

Ezek alapján kísérleti tanulmányt hajtottunk végre annak megvizsgálására, hogy a normokaloros alacsony koleszterinszintű étrend (NLCD) képes-e módosítani a Th17/Treg egyensúlyt krónikus HCV-fertőzésben szenvedő betegeknél. Ezzel a kísérleti beállítással közvetlenül hasonlítottuk össze az NLCD hatását CHC-ben az alkoholmentes zsírmájbetegségben (NAFLD) és az alkoholmentes steatohepatitisben (NASH) szenvedőkhöz képest, mivel a betegek utolsó két kategóriájára mind a máj steatosis, mind a lipid rendellenességek jellemzőek [ 28], hasonlóan a CHC betegeknél megfigyeltekhez, de a vírus érintettségének hiányában.

Betegek és módszerek

Etikai nyilatkozat

A próba protokollja és az azt támogató ellenőrzőlista kiegészítő információként érhető el; lásd az S1 CONSORT ellenőrzőlistát és az S1 protokollt. A tanulmányt a római Sapienza Egyetem Etikai Bizottsága jóváhagyta (jóváhagyási szám: 2534; 2012. július 26-án), és a Helsinki Nyilatkozatban megfogalmazott elvek szerint készült. A vizsgálatot a ClinicalTrials.gov webhelyen regisztrálták (regisztrációs szám: NCT02038387). Ezt a vizsgálatot a résztvevők beiratkozásának megkezdése után rögzítették, mivel ez pusztán megfigyelési vizsgálat, amely nem tartalmazza a gyógyszeradagolást; így első körben nem tartottuk szükségesnek a ClinicalTrials.gov webhelyen történő rögzítését. Sőt, pontosan betartottuk az intézményi etikai bizottság által 2012. július 26-án jóváhagyott eljárásokat, amelyeket a tárgyalás megkezdése előtt megszereztek. Az első betegtoborzást 2013-ban hajtották végre, az új betegek toborzása továbbra is folyamatban van. A szerzők megerősítik, hogy az összes folyamatban lévő és kapcsolódó kísérletet bejegyezték. Minden beteg esetében a követés időtartama 30 nap. Minden résztvevő írásos beleegyezését adta.

Betegek

Harminc CHC betegnek és 30 NAFLD/NASH betegnek diagnosztizáltak ultrahangvizsgálattal [29] [7% -uk biopsziával bizonyított NASH volt] az étrenden (1. ábra). Egyetlen beteg sem kapott semmilyen farmakológiai kezelést legalább 6 hónappal a vizsgálatba való belépés előtt, különös tekintettel a koleszterin anyagcserét potenciálisan befolyásoló gyógyszerekre (pl. Sztatinok, fitoszterolok stb.). Kizártuk a cirrhotikus betegeket. Egyéb kizárási kritériumok a következők voltak: hepatitis B vírus társfertőzése vagy emberi immunhiányos vírus fertőzések, autoimmun betegségek és egyéb kapcsolódó társbetegségek, például dekompenzált cukorbetegség, vesebetegségek, tüdőbetegségek, daganatok.

A betegeket arra utasították, hogy 30 napig normokaloros alacsony koleszterinszintű étrendet kövessenek (1400 Kcal nőknél és 1800 Kcal férfiaknál). Az étrendi vegyületeket a következőképpen osztottuk el: lipidek 23% (koleszterin 185 mg/nap), szénhidrátok 50% és fehérjék 27%. A sóbevitelt úgy tartották fenn, mint a betegek korábban, hogy ne befolyásolják a Th17 sejtek gyakoriságát a sótartalom alapján [30].

Az étkezési szokásokat a vizsgálat előtt minden beiratkozott beteg esetében rögzítették, nem találtak jelentős különbségeket a tápanyagbevitelben a CHC betegek és a kontroll csoport között (NAFLD/NASH alanyok).

A betegeket arra utasították, hogy ugyanazt az étel receptet kövessék az étkezés elkészítéséhez. Az étrendet szakértő táplálkozási szakember biztosította. A diéta betartását telefonos interjúval ellenőriztük, heti gyakorisággal. Az alanyoknak azt javasolták, hogy a beavatkozási időszak alatt tartsák fenn normális életmódjukat és alvási szokásaikat. Az alanyokat arra utasították, hogy a kiindulási méréseket követő napon (1. napon) kövessék az étrendet. A diéta kezdetén (0. nap, nevezetesen T0) és végén (30. nap, nevezetesen T30) a vérmintákat elemezték az általános paraméterek szempontjából, beleértve a biokémiai paramétereket, a hematológiát és a koagulációs értékeket (1. táblázat). Az NLCD nem a beteg súlyának csökkentésére szolgál, hanem a vírus aktivitásának befolyásolására, amelyről ismert, hogy a koleszterin függ.

Sejtek izolálása és stimulálása

A 0. és a 30. napon a perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC) heparinizált vérmintákból izoláltuk Ficoll-Hypaque (Eurobio, Les UlisCedex, Franciaország) sűrűség-gradiens centrifugálással. A mononukleáris sejteket újraszuszpendáltuk RPMI-ben (Cambrex BioScience, Verviers, Belgium), 10% hő-inaktivált borjúmagzati szérummal (FCS, HyClone, South Logan, UT) és 1% glutaminnal kiegészítve (mindezt az Euroclone-tól, Milánó, Olaszország), és otthagytuk. stimulálva 50 ng/ml Phorbol Myristate Acetate (PMA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO), 1 ug/ml jonomicin (Iono, Sigma-Aldrich). A stimulációt 37 ° C-on 5 órán át végeztük, a Brefeldin A intracelluláris forgalom-gátló inhibitor (10 µg/ml BFA; Sigma-Aldrich) jelenlétében, az intracelluláris festés és a citofluorimetriás elemzés előtt.

Intracelluláris festés és többparaméteres citofluorimetriás elemzés

Stimulálás után a sejteket kétszer mossuk Ca ++/Mg ++ -mentes foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS, Cambrex BioScience), majd a Fix és Perm sejt permeabilizáló készlet használatával (Caltag Laboratories, Burlingame, CA) kezeljük. a gyártó utasításait. A Th17-sejtes vizsgálathoz a PBMC-ket először fluorokróm-konjugált anti-CD161, CD3, CD4-vel festettük fel, és izotípusnak megfelelő kontroll mAb-t vásároltunk a BD Biosciences-től (San Jose, CA, USA) 20 percig 4 ° C-on. C. Ezután a sejteket rögzítettük és permeabilizáltuk, és intracellulárisan festettük phikoeritrinnel (PE) konjugált anti-IL-17A és anti-IL-22 PE-vel (all eBioscience, San Diego, CA, USA).

Treg-sejtes vizsgálat céljából a PBMC-ket először fluoreszcein-izotiocianát (FITC) -konjugált anti-humán CD4 antitestekkel, Alex Fluor 647-konjugált anti-humán CD127 antitestekkel, peridinin-klorofill fehérje (PerCP) -konjugált anti-humán CD3 antitestekkel festették fel és allofikocianinnal (APC) konjugált anti-humán CD25 antitesteket 30 percig, majd FACSTM lizáló oldattal (BD PharMingen, San Jose, Kalifornia) lizáltuk és fix/perm keverékkel kezeltük a gyártó utasításainak megfelelően. Végül a sejteket egy éjszakán át PE-konjugált anti-humán Foxp3 antitestekkel inkubáltuk. Izotópkontrollokat használtunk az antitest-specifitás biztosítására.

A festett sejteket LSR Fortessa áramlási citométerrel (Becton Dickinson) szereztük be, és elemeztük FACSDiva szoftverrel (BD Biosciences) vagy FlowJo szoftverrel (Treestar, Ashland, OR). A limfocita régiót az elülső és az oldalsó szórás fizikai paraméterei alapján határoztuk meg; A T helper és a Treg sejt alcsoportokat anti-CD3 és anti-CD4 festéssel azonosítottuk. A mintákat élő, egyetlen CD3 + T limfocitákon kaptuk.

Valós idejű qPCR

A teljes RNS-t izoláltuk a betegek PBMC-jeiből Trizol reagenssel (Invitrogen, Life Technologies), és 2 µg komplementer DNS-t készítettünk Random Primers és a Reverse Transcription System AMV Reverse Transcriptase (A3500, Promega) felhasználásával a gyártó szerint. jegyzőkönyv. A PCR-primereket az AmplifX 1.5.4 szoftver és az NCBI Primer-BLAST felhasználásával terveztük meg, és a következők voltak: humán LXRα, előre 5'-TGCCGAGTTTGCCTTGCTCATT-3 'és fordított 5'-GGAGGCTCACCAGTTTCATTAGCA-3'; humán LXRβ előre 5'-AAGAAGGGCCCAGCCCCGG-3 'és fordított 5'-ACACTGCGCCGGAAGAAGCC-3'; emberi SREBP-1c, előre 5'-TTCCGCCCTTGAGCTGCGTG-3 'és hátramenet 5'-CCGGAAGCTCTGTGCCAGCC-3'; humán ABCA-1, előre 5'-CTGGGCCACAATGGAGCG-3 'és hátramenet 5'-ATGTAGGCGGTGCCCGAGGT-3'. A β-aktin primereit használták háztartási kontrollként: humán β-aktint, előre 5′-GCACTCTTCCAGCCTTCC-3 ′ és fordított 5′-AGGTCTTTGCGGATGTCCAC-3 ′. A QRT-PCR-t 7500 Fast Real-Time PCR rendszerrel (Applied Biosystems, CA, USA) végeztük, fluoroforként a Power SYBR Green PCR Master Mix alkalmazását, beleértve a passzív referenciaként alkalmazott ROX-ot (Applied Biosystems). Az összes PCR-körülményt és primereket optimalizáltuk, hogy egyetlen várt bázispár-méretű terméket állítsunk elő. Az összes kísérletet három példányban hajtottuk végre.

Enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA)

Az IL-17, IL-22, IL-23 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) és a TGF-β (eBioscience) szérumkoncentrációját a kereskedelemben kapható ELISA készletekkel mértük, a gyártó protokolljainak megfelelően. A hialuronsav (HA) szérumszintjének meghatározásához kvantitatív tesztkészletet használtunk (Corgenix, Denver, CO). Az összes mintát három példányban értékeltük.

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlagként ± standard deviációként (SD) fejezzük ki a nyers adatokhoz, és százalékokban ± SD-t adunk meg. Párosított Student t-tesztet hajtottunk végre, összehasonlítva a T30 és a T0 időpontot ugyanazon elemzett betegcsoporton belül. A korrelációs elemzést Pearson-korrelációs teszttel végeztük. A minta nagyságát a legújabb tanulmányok [7], [14], [15] alapján határozták meg, amelyek alátámasztják azt a hipotézist, miszerint a betegcsoportunkban változó Th17 sejtsűrűség valószínűleg átlagosan 3,2% ± 2,0. Feltételeztük, hogy az étrend segítségével a Th17 sejtek gyakorisága 2,0% ± 0,15, teljesítmény = 90%, szignifikancia szint = 0,05; ezért a vizsgálat elvégzéséhez csoportonként legalább 24 betegre van szükség. Így csoportonként 30 beteget vontunk be, figyelembe véve a lehetséges 20% -os lemorzsolódást. Az összes statisztikai elemzést a PRISM v.5 szoftver (GraphPad Software, San Diego, CA) alkalmazásával végeztük; p-érték + CD4 + T-sejtek, Th17 sejtekként definiálva

Először megvizsgáltuk a Th17 sejtek százalékos arányát a CHC és a NAFLD/NASH betegek perifériás vérében. Kísérleteink kimutatták és megerősítették az IL-17- és IL-22-szekretáló Th17 sejtek gyakoriságának szignifikáns növekedését CHC és NAFLD/NASH betegeknél az egészséges donorral összehasonlítva [13] - [15] (az adatokat nem mutatjuk be).

30 napos NLCD után CHC betegeknél statisztikailag szignifikáns csökkenést észleltünk az IL-17- és IL-22-termelő Th17 sejtek gyakoriságában (2A. Ábra). Egyébként a NAFLD/NASH betegeknél nem találtunk szignifikáns különbséget a Th17-sejtek gyakoriságában diéta előtt és után (2B. Ábra). A Th17-rokon citokint diéta előtt és után is megvizsgáltuk mindkét betegcsoport szérumában. Az IL-17 és IL-22 szérumszintje szignifikánsan csak a CHC-ben szenvedő betegeknél csökkent szignifikánsan (2.C ábra). Ugyanez a trend diéta után megfigyeltük a Th17-rokon citokinek szérumszintjét, még akkor is, ha nem értünk el statisztikai szignifikanciát (2C. Ábra).

A) A (T0) és az (T30) NLCD előtt, CHC betegeknél az IL-17- és IL-22-termelő sejtek statisztikailag szignifikáns csökkenését figyeltük meg a megjelölt CD161 + CD4 + T frakciók és a kapu nélküli élő CD4 + CD3 között + limfociták. B) Az IL-17 + és IL-22 + Th17 sejtek gyakoriságának ezek a változásai nem érték el a statisztikai szignifikanciát a NAFLD/NASH betegek (T0) és (T30) NLCD előtt. C) CHC és NAFLD/NASH betegek diétája után ugyanazt a tendenciát figyeltük meg az IL-17 és IL-22 szérum szintjén, még akkor is, ha a NAFLD/NASH betegeknél nem sikerült statisztikai szignifikanciát elérni. Az összes független kísérlet egy reprezentatív ábrája látható. * P + CD3 + T limfocita populáció, alacsony CD127 szint és magas CD25 szint, expresszálva a villásfej/szárnyas hélix P3 transzkripciós faktorral (FoxP3). Így a limfogátumban a CD3 + CD4 + sejteket detektáltuk a Treg sejtekben CD25 + CD127low/- és FOXP3 + kombinációjával [31]. Ennek a keringő sejtes populációnak a százaléka az NLCD után magasabb emelkedést eredményezett a CHC-s betegeknél (3A. Ábra), ami a Treg/Th17 arány jelentős javulását eredményezte (p 3. ábra. A Treg-sejt gyakorisága és a Treg/Th17 arány változása NAFLD/NASH és CHC betegek, NLCD előtt és után.

A Treg sejtek áramlási citometriával történő értékelését a CD127low/-CD25 + FoxP3 + sejtek százalékában határoztuk meg a CD3 + CD4 + rekeszben. Beszámoltunk a reprezentatív kísérletek ponttáblázatairól, a CD25 + CD4 + Treg sejtek százalékos arányával, amelyeknél a CD25 + alacsony vagy negatív CD127, valamint a CD4 + CD25 + CD127low/-FOXP3 + Treg sejtek százalékos arányával az NLCD előtt és után a CHC perifériás vérében (A) és NAFLD/NASH betegek (B). A táblázatban statisztikailag szignifikáns különbséget jelentettünk a T0 és a T30 között a Treg-sejtek gyakoriságában CHC-ben, a NAFLD/NASH betegeknél azonban nem. A C) ábrázoljuk a CD4 + CD25 + CD127low/-FOXP3 + Treg és a Th17 (IL-17 + CD161 + CD4 + T) sejtfrekvenciák arányának változását, amelyeket mindkét csoportból nyertünk az NLCD előtt és után. A vízszintes sávok a jelzett index medián értékeit képviselik. * P 4. ábra NAFLD/NASH és CHC betegek PBMC-ből nyert LXR-ek és rokon gének relatív mRNS-expressziója NLCD után.

CHC-ben szenvedő betegeknél az NLCD után nagyon szignifikáns változásokat figyeltünk meg az LXRα, LXRβ és ABCA-1 mRNS szintekben, szemben az NLCD (A) előtti értékkel. Nem figyeltek meg szignifikáns változást a NAFLD/NASH betegeknél az NLCD (B) után. Az adatokat átlag ± SD-ben fejezzük ki; az összes mintát három példányban értékeltük. A hibasávok szemléltetik az SD-t. * P 5. ábra: NAFLD/NASH és CHC betegekből nyert (A) TGF-β, HA és (B) IL-23 szérumszintje NLCD előtt és után.