A súlycsökkenés zárt fejsérülésének egérmodellje: hangsúly a kognitív és neurológiai hiányosságokra

Igor Khalin

1 Malajziai Nemzetvédelmi Egyetem Orvostudományi és Védelmi Kar, Kem Sungai Besi, Kuala Lumpur, Malajzia

Laili Azua Jamari sem

2 Kémiai Tanszék, Védelmi Alapítvány Tanulmányi Központ, Malajziai Nemzetvédelmi Egyetem, Kem Sungai Besi, Kuala Lumpur, Malajzia

Nadiawati Bt Abdul Razak

1 Malajziai Nemzetvédelmi Egyetem Orvostudományi és Védelmi Kar, Kem Sungai Besi, Kuala Lumpur, Malajzia

Zubaidah Bt Hasain

1 Malajziai Nemzetvédelmi Egyetem Orvostudományi és Védelmi Kar, Kem Sungai Besi, Kuala Lumpur, Malajzia

Mohd Asri bin Mohd Nor

3 Építőmérnöki tanszék, Mérnöki Kar, Malajziai Nemzetvédelmi Egyetem, Kem Sungai Besi, Kuala Lumpur, Malajzia

Mohd Hakimi bin Ahmad Zainudin

4 Kutatási és Innovációs Menedzsment Központ, Malajzia Nemzetvédelmi Egyetem, Kem Sungai Besi, Kuala Lumpur, Malajzia

Ainsah Bt Omar

1 Malajziai Nemzetvédelmi Egyetem Orvostudományi és Védelmi Kar, Kem Sungai Besi, Kuala Lumpur, Malajzia

Renad Alyautdin

5 Orvosi alkalmazással foglalkozó tudományos központ, Petrovsky Blvd, Moszkva, Oroszország

Szerző hozzájárulások: Az IK, az RA és az AO megalkotta és megtervezte ezt a vizsgálatot, kísérleteket végzett és megírta az írást. Az NLAJ, a MAMN és a ZH segítséget nyújtott a készülékek összeállításában és alkalmazásában, és részt vettek a papírírásban. A NAR és az MHAZ kísérleteket hajtott végre, és részt vett a papírírásban is. Minden szerző jóváhagyta a cikk végleges változatát.

Absztrakt

A traumás agysérülés (TBI) a halálozás és a fogyatékosság egyik fő oka világszerte. Klinikailag releváns TBI-modell előállítása kis méretű állatokban továbbra is meglehetősen kihívást jelent. A TBI kezelésében hatékony terápiás szerek jó szűrése érdekében létre kell hozni és standardizálni kell a TBI állatmodelljeit. Ebben a tanulmányban Shohami súlycsökkenéses módszerrel hoztuk létre a zárt fejsérülés egérmodelljeit, a kognitív hiány értékelésének néhány módosításával, és részletes leírást adtunk a súlyos TBI állatmodellről. Megállapítottuk, hogy 2 g magasságból 250 g zuhanó súly súlyos zárt fejsérülést okozott C57BL/6 hím egereknél. Súlyos zárt fejsérüléssel rendelkező egerek kognitív rendellenességei a sérülés utáni 7. napon passzív elkerülő teszt segítségével detektálhatók. E tanulmány eredményei azt mutatják, hogy a súlycsökkenést okozó állatmodellek alkalmasak az agyi neuroprotektánsok további szűrésére, és potenciálisan hasonlóak az emberi TBI-ben megfigyeltekhez.

Bevezetés

Malajziában a traumás agysérülés (TBI) volt az egyik fő halálok (Moppett, 2007). Bár a TBI globális nagysága ismeretlen a TBI-re vonatkozó szabványosított adatgyűjtés hiánya miatt (Peeters et al., 2015), a rendelkezésre álló adatok arra utalnak, hogy a TBI áldozatainak száma globálisan meredeken növekszik (Alves, 2014). Például Európában a TBI előfordulása az elmúlt évtizedben nőtt: évente 235-ről 326-ra nőtt 100 000 lakosra számítva (Peeters et al., 2015). Sőt, az Egészségügyi Világszervezet szerint a TBI állítólag a halálozás fő oka 2020-ban (Szervezet, 2006). Annak ellenére, hogy a TBI-áldozatok prognózisa javult az elmúlt években, a TBI-t túlélők közül sok szenved érzelmi, kognitív és motoros zavaroktól és az életminőség romlásától.

Anyagok és metódusok

Állatok

Hatvankét hím C57BL/6N hím egeret (Vivos®-ban, Szingapúr), 11–13 hetes, 25–28 g súlyúakat vontak be ebbe a vizsgálatba. Ezeket az állatokat egyedileg szellőztetett ketrecekben (Techniplast®, Olaszország; n = 3/ketrec) tartottuk 20–23 ° C-on, 12 órás világos/sötét ciklus alatt, szabad hozzáféréssel a vízhez és az ételekhez (Teklad Global Diets®, USA) . A laboratóriumi állatokon végzett összes eljárást a Malajziai Nemzetvédelmi Egyetem állatgondozási és használati bizottsági irányelveinek megfelelően hajtották végre.

Készülék TBI előállítására

TBI készüléket a Malajziai Nemzetvédelmi Egyetem Műszaki Karán terveztek és állítottak össze a nemrégiben létrehozott protokollnak megfelelően (Flierl et al., 2009). A berendezés három párhuzamos vízszintes síkból áll, amelyeket négy párhuzamos függőleges fémrúd ( 1A. Ábra ). A felső és a középső felület akrilüvegből készül, és kerek műanyag heggyel ellátott fémrúd rögzítésére szolgál ( 1B. Ábra ), amelyek áthatolnak rajtuk, és hatással vannak az állat koponyájára. Az alsó emelvény vasból készült, és az egér feje rögzíthető rajta, hogy csökkenő súlyt juttasson a koponya bizonyos területére ( 1C. Ábra ). A készüléket kőfelületre kell helyezni az energiaeloszlás csökkentése érdekében.

A traumatikus agysérülést (TBI) okozó készülék kis méretű rágcsálóknál.

(A) A TBI eszköz, amely súlycsökkenési módszert hajt végre zárt fej trauma előidézésére egerekben; (B) 3 mm átmérőjű műanyag kerek hegy; (C) az egerek helyzete a peronon; D) az ütközési terület helye; (E) a pedált kézzel vagy lábbal lehet lenyomni, elengedve a rudat, és a kitett egér koponyájába ütközést okozva; (F) a beállítást, azaz a bizonyos súly bizonyos magasságon egy vonalzó és egy elektromágneses zár segítségével lehet beállítani.

TBI eljárás

60 mg/kg nátrium-pentobarbitál (Dorminal, Alfasan, Hollandia) intraperitoneális injekcióval végzett általános érzéstelenítés után a koponya felett középvonalas bemetszést hajtottak végre, a bőrt visszahúzták, és a koponyát kitették az ütközési terület meghatározására ( 1D. Ábra ). Az egereket véletlenszerűen osztottuk színlelt módon, 200 g súlycsökkenéssel, 250 g súlycsökkenéssel és 300 g súlycsökkenés csoportokra.

A fejet kézzel rögzítették a súlycsökkentő készülék alsó platformjára. A 200 g, 250 g vagy 300 g súlyú fémrúd 3 mm átmérőjű műanyag csúcsát óvatosan a bal féltekén, a középvonaltól 2 mm-re, a koronális varrattól pedig 2 mm-re visszahelyeztük a kitett egérkoponyára. A fejet kézzel rögzítették, miközben a rudat 2 cm magasságban felemelték és egy mágnes tartotta ( 1F. Ábra ). A traumát a pedál megnyomásával hajtották végre ( 1E. Ábra ), amely kikapcsolta a mágnest és a botot nemezzel az egér koponyáján. Azonnal oxigént (4 liter O2/perc) juttattunk nyomás alatt lévő henger segítségével az egerekhez 2 perc alatt, a légzési depresszió elkerülése érdekében. 0,05 mg/kg fentanil (Talgesil, Duopharma (M), Malajzia) intraperitoneális injekciója után az egereket visszatették ketreceikbe. Az álkontrollok csak altatást és bőrmetszést kaptak.

Neurológiai súlyossági pontszám (NSS)

Az egerek neurológiai motoros hiányának értékelésének standardizálása a TBI után NSS-t hoztak létre (Chen et al., 1996). Ez a skála utánozza a Glasgow kimeneti skálát, amely egy standard módszer, amelyet klinikailag alkalmaznak a TBI-ben szenvedő betegek funkcionális neurológiai és kognitív eredményeinek értékelésére (King és mtsai, 2005). Kezdetben az NSS 25 teljesítendő feladatot tartalmazott, de ezután a feladatok számát 10-re csökkentették (Chen et al., 1996; Flierl et al., 2009). Az NSS kiértékelésének időpontjait általában a sérülés után 1 órának, 4 órának, 24 órának, 2 napnak, 3 napnak és 7 napnak választották (Flierl et al., 2009), ennek azonban számos módosítása van (Sinson et al. al., 1997; Wu és mtsai, 2014). Az NSS szorosan korrelál a mágneses rezonancia képalkotás és a szövettani vizsgálat során nyert adatokkal (Tsenter és mtsai, 2008), és így tükrözi az agyszövet károsodását. Minden NSS-feladatot az alábbiakban ismertetünk.

1. feladat: Kilépés a körből. Egy egeret tettek a kör közepére ( 2B. Ábra ) és az egérnek a készülékből való kilépéséhez szükséges időt monitoroztuk. Az egészséges egér, mivel belső keresési magatartása van, általában 3 percen belül elhagyja a kört. Ha az egér 3 perc elteltével is a körön belül volt, 1 pontot adtak, különben 0 pontot számoltak.

A neurológiai súlyossági pontszám (NSS) értékeléséhez használt eszközök illusztrációja és példa a feladat értékelésére.

(A) „Sugárjárás”. A feladat teljesítéséhez az egérnek kereszteznie kell a gerendát (3, 2, 1 cm) az ellenkező oldalra; (B) „Kilépési kör”. Az egészséges egérnek 3 percen belül meg kell találnia a körből a kijáratot. (C) Példa a „Sugárút” tesztre; (D) „Kerek botmérleg”. A feladat akkor tekinthető sikeresnek, ha az egér 10 másodperc alatt képes egyensúlyba lépni mind a négy mancsával.

2. feladat: Magatartás keresése. Az egeret ismét a kör közepére helyeztük ( 2B. Ábra ), de a kijáratot le kell zárni. Figyeltük az egér 3 percen belüli felfedezésének képességét és a szippantási viselkedést. Amikor az egér nem hajtott végre keresési magatartást, 1 pontot számoltak, és ha keresési magatartást figyeltek meg, akkor 0 pontot számoltak.

3. feladat: Monoparesis/hemiparesis. Ehhez a feladathoz anatómiai csipeszt használtak. Az egereket a faroknál tartva megérintettük az egér mancsait a csipesszel. Ha az egér megfogja a csipeszt, 0 pontot számoltunk, és ha az egér nem fogott meg, vagy nagyon alacsony intenzitással fogott, akkor 1 pontot adtunk.

4. feladat: Egyenes séta. Az egeret üres felületre helyeztük, hogy értékeljük az egér egyenes járás képességét és éberségét. Ha az egérnek a járásmintája romlott, és nem sikerült aktívan felfedezni a környezetet, akkor 1 pontot számoltunk. Amikor az egér normál járást mutatott, 0 pontot adtak.

5. feladat: Megdöbbentő reflex. Ha egy egér reakciót mutatott a hangos mancson, tapsolt, 0 pontot adtak hozzá, különben 1 pontot adtak.

6. feladat: Sugármérleg. Ha egy egér 10 másodperc alatt képes volt egyensúlyozni a gerendán (0,5 × 0,5 mm 2), 0 pontot számoltunk, és ha az egér nem sikerült, akkor 1 pontot kaptunk.

7., 8., 9. feladat: Sugárjárás. Egy egeret tettünk a 3-, 2-, 1 cm széles, 30 cm hosszú gerenda végére (Ábra: 2A, 2A, CC ábra ). Az egészséges egér a belső keresési reflex miatt könnyen átmehet az összes gerendán. Ha egy egér 3 percen belül nem lépte át a gerendát, vagy nem érkezett meg a szemközti oldalra, 1 pontot adtak, sikeres érkezés esetén 0 pontot számoltak. Ha az egérnek nem sikerült átlépnie a 3 cm (vagy 2 cm) széles sugárzást, akkor további feladatokat nem végeztek el 2 cm (vagy 1 cm) széles sugárral, és 3 vagy 2 pontot adtak.

10. feladat: Kerek botmérleg. Ha az egér 10 másodperc alatt nem tudott egyensúlyozni az 5 mm átmérőjű kerek boton, 1 pontot adtunk hozzá, és ha az egérnek sikerült egyensúlyoznia, akkor 0 pontot számoltunk ( 2D. Ábra ).

A 10 feladat összes pontját összegezni kell az összes NSS pont megszerzéséhez.

Passzív elkerülés teszt

A passzív elkerülés teszt.

(A) Guillotine-szerű ajtó egy láthatóan rögzíthető sötét kamrába. (B) A téglalap alakú kamra két részre oszlik: egy felső ingerrel megvilágított és sötétre. (C) Sokk beállítások (0,3 mA, 2 másodperces időtartam) és időértékelés (kikapcsolási idő 180 másodperc).

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzést a GraphPadPrizm® (La Jolla, Kalifornia, USA) segítségével végeztük. Kétirányú varianciaanalízist, majd Bonferroni post-hoc teszteket alkalmaztunk. Valamennyi eredményt átlag ± SD-ként fejezzük ki. A P szintje 4. ábra ). A 200 g eső tömegű csoportban hasonló tendenciát figyeltünk meg: a kezdeti NSS 3,83 ± 0,68 volt, ami enyhe agyi traumát jelzett, javulás nélkül a sérülés után 4 órával (3,67 ± 0,47). Ezután fokozatos spontán gyógyulást tapasztaltunk, amikor az NSS 0,83 ± 0,68 pontra csökkent a sérülés utáni 7. napon.

Neurológiai súlyossági pontszámok (NSS) azoknál az egereknél, akiknek traumás agysérülése 250 g és 200 g súlycsökkenés okozta.

Az alsó NSS jobb neurológiai funkciót képvisel. Az értékeket átlag ± SD-ként fejezzük ki (n = 6). A statisztikai elemzést kétnapos varianciaanalízissel végeztük Bonferroni post-hoc teszttel. * P 5. ábra . Az álműtött állatok jó képességet tanultak a feladat elsajátítására, mivel nem kerültek be abba a kamrába, amelyben előző nap sokkot kaptak. Az átlagos késleltetési idő egyenlő volt; a vágási idő 180 másodperc volt, amint azt a módszerek megfogalmazták. Érdekes módon ugyanazokat az eredményeket érték el TBI egerekben mindkét kísérleti csoportból az 1. és a 4. napon. Ugyanakkor a 7. napon az átlagos latencia szignifikánsan rövidebb volt a TBI-s egerekben, amelyeket 250 g súlycsökkenés okozott, mint ál-operált egerek és TBI egerek, amelyeket 200 g esés okoz. Ez azt jelzi, hogy a sérülés után 1 héttel a 250 g-os súlycsökkenés okozta TBI-s egereknél kognitív deficit alakult ki.

A traumatikus agysérüléssel (TBI) szenvedő egerek kognitív funkciója a passzív elkerülés teszt segítségével.