A székletátültetés módosítja a vizelet kémiai kockázati tényezőit a vizelet kőbetegségében

Joshua M. Stern

1 Urológiai Osztály, Albert Einstein Orvostudományi Főiskola, Bronx, New York,

Marcia Urban ‐ Maldonado

1 Urológiai Osztály, Albert Einstein Orvostudományi Főiskola, Bronx, New York,

Mykhaylo Usyk

2 Mikrobiológiai Tanszék, Albert Einstein Orvostudományi Főiskola, Bronx, New York,

Ignacio Granja

3 Litholink Corporation, Chicago, Illinois,

Daniel Schoenfeld

1 Urológiai Osztály, Albert Einstein Orvostudományi Főiskola, Bronx, New York,

Kelvin P. Davies

1 Urológiai Osztály, Albert Einstein Orvostudományi Főiskola, Bronx, New York,

Ilir Agalliu

4 Epidemiológiai Tanszék, Albert Einstein Orvostudományi Főiskola, Bronx, New York,

John Asplin

3 Litholink Corporation, Chicago, Illinois,

Robert Burk

2 Mikrobiológiai Tanszék, Albert Einstein Orvostudományi Főiskola, Bronx, New York,

Sylvia O. Suadicani

1 Urológiai Osztály, Albert Einstein Orvostudományi Főiskola, Bronx, New York,

Absztrakt

A húgyúti kőbetegség (USD) komoly egészségügyi problémát jelent. Új kezelési módokra van szükség. Nemrégiben csoportunk bizonyítékokat szolgáltatott a GMB összetétele és az USD közötti összefüggésről. A Gut Microbiome (GMB) hozzáférhetősége vonzó célponttá teszi a vizsgálat számára, ezért ezekben a tanulmányokban azt értékeltük, hogy az egész bélmikrobiális közösség a széklettranszplantációkban milyen mértékben képes befolyásolni a vizeletkő kockázati paramétereit egy állatmodellben. A friss székletpelletet Zucker sovány patkányokból gyűjtöttük, PBS-ben (100 mg/ml) homogenizáltuk, 70 μm-es szűrőn átszűrtük, majd orálisan C57 BL/6 NT ac csíra nélküli egerekbe szoptattuk. Huszonnégy órás vizeletgyűjtést és GMB-elemzést végeztek idővel 1 hónapig. A transzplantált egerekből vese- és bélszövetet gyűjtöttünk az oxalátegyensúlyban részt vevő Slc26a6 transzporter expressziós szintjének Western blot elemzéséhez. A vizelet kalciumja 55% -kal csökkent a székletátültetés után (P pH 5,85-ről (SE ± 0,028) 6,49 (SE ± 0,04) (P USD; a GMB hozzáférhetősége potenciálisan kihasználható terápiás beavatkozásokhoz).

Bevezetés

A húgyúti kőbetegség (USD) növekvő közegészségügyi teher az Egyesült Államokban, amely a vesefunkció csökkenésének (Alexander és mtsai 2012), a szívbetegségek (Ferraro és mtsai 2013) és a csonttörés (Melton és mtsai) megnövekedett kockázatával jár. 1998), amelynek eredményeként az éves egészségügyi költségek meghaladják a 10 milliárd dollárt (Litwin és Saigal 2012). Az emberi bélmikrobiomák (GMB) szekvenálásának legújabb fejleményei innovatív áttörésekhez vezettek, amelyek leírják annak kapcsolatát az emberi egészség olyan fontos eredményeivel, mint az asztma, a gyulladásos bélbetegség és a szív- és érrendszeri betegségek (Black és mtsai 2015; Knoll és mtsai 2016; Butto és Haller 2017). Nemrégiben csoportunk bizonyítékokat szolgáltatott a GMB összetétele és az USD közötti összefüggésről (Stern et al. 2016).

Mód

Széklettranszplantáció

Mikrobiom elemzések

A 16S rRNS gén amplifikálásának és szekvenálásának módszereit a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (Smith és mtsai 2012, 2016; Ghartey és mtsai 2014; Zhang és mtsai 2015; Stern és mtsai 2016; Usyk és mtsai 2017). Röviden, a székletmintákat a teljes DNS-hez extraháltuk a MoBio PowerSoil DNS-izoláló készlet gyöngyverési eljárásával (Qiagen laboratóriumok, USA). A mikrobiomot minden egyes mintához egyedi vonalkódolt primerek alkalmazásával jellemeztük, amelyek amplifikálták a 16S rRNS V4 régiót. A PCR termékeket gélanalízissel megerősítettük, egyesítettük, elkülönítettük, és könyvtárat készítettünk a KAPA könyvtár előkészítő készlet (Kapabiosystems, Wilmington MA) felhasználásával, TruSeq adapterekkel. A vonalkódolt DNS-amplikonokat tartalmazó DNS-könyvtárat egy Illumina MiSeq-en (Illumina Inc., San Diego, Kalifornia) szekvenáltuk az Epinomics and Genomics Core Facility-nél (Einstein), 300 bp páros végű kémia alkalmazásával.

Bioinformatika

Vizeletgyűjtés

Két 24 órás vizeletgyűjtést hajtottunk végre donor patkányonként és recipiens egérenként a vizsgálat minden egyes időpontjában. Az ürített vizeletet folyamatosan gyűjtötték a metabolikus kamra tartályába, amely ásványi olajat (0,5 ml a párolgás minimalizálása érdekében) és timolt (1. forduló; savasítatlan minták) vagy ásványi olajat és 4 N HCl-ot (2. forduló; 5/100 μL vizelet; savanyított minta) tartalmazott. Az elemzett vizeletparaméterek közé tartozott a kalcium, oxalát, húgysav, citrát, NH4, szulfát, pH, kreatinin, foszfát, nátrium, kálium, magnézium, karbamid-nitrogén, túltelítettség (SS) CaOx, SSUA, SSCaP. A vizeletkémiát a Litholink Corporation végezte. A titrálható sav kiválasztását a vizelet pH-jából, a foszforból és a kreatininből számítottuk ki Lennon és mtsai. (1966). Becslések szerint a GI lúgabszorpciója: (Na + K + Ca + Mg) - (Cl + 1,8 P) (Oh 1989).

Western blottolás

A székletbeültetett és az életkornak megfelelő csíramentes kontroll egereket CO2-kamrában eutanizáltuk (a hatás érdekében) a kísérlet végén (4 hetes időponttal). A veséket, a vékonybéleket és a vastagbéleket összegyűjtöttük, hideg 1XPBS-be helyeztük, és a kötőszöveteket eltávolítottuk. Szegmensek az ileumból (

Statisztikai analízis

Nem volt különbség a súlygyarapodásban a 4 hetes FT (n = 9) és a 4 hetes korú, csíramentes kontrollcsoport (n = 9) között (2. ábra). Ezenkívül a 24 órás vizelet kreatinin (Cr) a kísérlet folyamán hasonló szinten maradt, az alapszint és az FT után 4 héttel nem volt statisztikai különbség (1,42 ± 0,06 mg/nap és 1,39 ± 0,12 mg/nap); P = 0,31). Az összes 24 órás vizeletparamétert ennek megfelelően korrigáltuk a 24 órás kreatinin szintjére (3. ábra).

A csíra nélküli egerek testtömege a kiinduláskor és a székletátültetés után 4 héttel. A kontroll (CTR) és a székletbeültetett (FT) csoportokban lévő állatok szignifikáns súlyt nyertek a kísérlet 4 hete alatt, összehasonlítva az alapértékekkel. A testtömeg-gyarapodás nem különbözött a CTR és az FT csíra nélküli egerek között. Az adatok megfelelnek az átlag ± SEM értéknek; n = 9 csoportonként; Student t-teszt: ** P 3 A és B). Ezeket a változásokat már egy héttel az FT után észlelték, és a vizsgálat 4 hetes időtartama alatt stabilak maradtak. Amint a 3. A ábra mutatja, a vizelet Ca-értéke az FT után csökkent, és elérte azokat az értékeket, amelyek átlagosan 55% -kal alacsonyabbak voltak az FT után 4 héttel, mint a kiinduláskor mértek (P 3 B). Az ismételt mérési elemzés szintén nem mutatott különbséget a vizelet oxigénjében 2 és 3 hét (P = 0,62), 2 és 4 hét (P = 0,94), valamint 3 és 4 hét (P = 0,96) között FT után. A CaOx túltelítettsége (SS) 68% -kal esett vissza a transzplantációt követő 4 héten (a vese, a vakbél és a vastagbél P4, A6 fehérje expresszióját a GMB szignifikánsan és differenciáltan befolyásolta. A vizelet oxigénjének 24% -os csökkenésével összefüggésben az FT után 4 héttel megfigyelt A6-szint a vesében (ahol részt vesz az Ox proximális tubuláris szekréciójában) 40,25% -kal alacsonyabb volt, mint a kontrollokban (P = 0,013). Nem volt szignifikáns különbség az expresszióban az ileumban, míg a vakbél A6 1,9-szeresére nőtt (P = 0,0005), a vastagbél A6 pedig 38,50% -kal (P = 0,005) csökkent (4. ábra A). Mivel tisztában vagyunk azzal, hogy az OF befolyásolhatja az A6 expresszióját (Hatch et al. .) Fókuszált fajszintű elemzést hajtottunk végre, és nem azonosítottuk az OF-t, azonban megértjük, hogy a metagenomika hozzáadásával az OF-t gyakrabban azonosítják, még mindig nagyon kicsi a bőség.

A széklettranszplantációt követően csíra mentes egereknél megfigyelt változások a vizeletkémiában (3. ábra) széles körben elismert tényezők a vizeletkő kockázatának meghatározó tényezői (Sakhaee et al. 2012; Cheungpasitporn et al. 2016). A vizelet kalcium- és oxaláttartalmának a transzplantáció után 4 héttel megfigyelt jelentős csökkenése arra utal, hogy a GMB befolyásolhatja a CaOx egyensúlyt. Tekintettel arra a jelenlegi nézetre, hogy az OF-kolonizáció szerves részét képezheti az oxalát GMB-metabolizmusának, felkeltettük érdeklődésünket, hogy a széklettranszplantáció egy standard egészséges állatból, amelynek 16S szekvenciáján nem volt azonosítva az OF, szignifikánsan csökkentette a vizelet oxalátját, 3,6-szoros csökkenést okozva a CaOx szuper telítettségében. Számos szokásos közösségi organizmus azonban összefüggésben van a vizelet oxalátjával. Mi, másokhoz hasonlóan (Suryavanshi et al. 2016), azt találtuk, hogy a Sutterella nemzetség negatív korrelációt mutat az oxaláttal. A Clostridiaceae család számos olyan nemzetséget tartalmaz, amelyekről ismert, hogy aktív oxalát-lebontók (Miller és mtsai 2014), és szintén negatívan korrelált a vizelet oxalátjával a 4. héten.

Tekintettel arra, hogy a béllúg felszívódása bevett és fontos fiziológiai folyamat (Tang et al. 2015), valószínűnek tűnik, hogy a mikrobiom befolyásolhatja egyensúlyát. A számított GI lúgabszorpció az FT után 4 héttel szignifikánsan növekedett. A GMB tényleges szerepe az alkáli mennyiség növelésében ebben a modellben nem világos, de mindenképpen provokatív. Mindazonáltal a GMB rövid láncú zsírsavtermeléssel vagy más szekréciós funkcióval kulcsfontosságú a bél nyálkahártya-gátjának fenntartásában (Corfield 2018). A bél mikrobiota szintén közreműködik a purin metabolizmusában. Figyelemre méltó, hogy a Clostridia kimutatták, hogy képes a húgysav anyagcseréjére, és képes a purinokat egyedüli szén-, nitrogén- és energiaforrásként használni (Durre és Andreesen 1982; Hartwich és mtsai 2012). A korrelációs elemzés kimutatta, hogy a Clostridium nemzetség fordítottan korrelált a vizelet ammóniumával és a vizelet húgysavjával az FT után 4 héttel.

A vesekövek növekvõ prevalenciája (Litwin és Saigal 2012) és a magas kõ megismétlõdési arány (Scales és mtsai 2012; Tasian és mtsai 2016), az étrendi tanácsadás és a farmakológiai beavatkozás ellenére, motiválta a kutatást a vesekõ új kezelési paradigmáinak azonosítására. betegek. Az étrendet az USD egyik fő tényezőjének tekintik (Pak 1998; Borghi és mtsai 2002; Taylor és mtsai 2004; Tracy és mtsai 2014), de a diéta és az USD közötti összefüggés alapjául szolgáló mechanizmusokat nemigen értik. Valószínű, hogy a GMB befolyásolja az étrend által vezérelt anyagcserét, és mint ilyen, számos betegséghez kapcsolódott, beleértve a veseköveket is (Hesse et al. 1999; Hatch et al. 2006; Barnett et al. 2016; Stern et al. 2016). Bizonyíték van arra, hogy az USD, hasonlóan a DM-hez és az elhízáshoz, egyedi GMB-profillal társulhat (Turnbaugh et al. 2006; Larsen et al. 2010; Stern et al. 2016). Továbbá annak tudatában, hogy mind a DM, mind az elhízás befolyásolható a széklettranszplantációval, kombinálva adataink arra utaló jelzéseivel, hogy a GMB-transzfer megváltoztatja a vizeletkémiát, további indoklás adódik ahhoz, hogy tovább tanulhassuk a mikrobiom manipulálását az USD-kockázat csökkentése érdekében.

Összeférhetetlenség

Megjegyzések

Stern JM, Urban ‐ Maldonado M., Usyk M., Granja I., Schoenfeld D., Davies KP, Agalliu I., Asplin J., Burk R., Suadicani SO. A széklettranszplantáció módosítja a vizelet kémiai rizikófaktorait a vizeletkő betegségben . Physiol Rep, 7 (4), 2019, e14012, 10.14814/phy2.14012 [CrossRef] [Google Tudós]

Finanszírozási információk

NIH R21 DK108097‐02 Amerikai Nefrológiai Társaság Karrierfejlesztési Díj.