A szívizom átalakulása a kalibráció által kiváltott bal kamrai atrófiában

Carina Gruber

1 Anatómiai és Sejtbiológiai Intézet, Justus-Liebig-University Giessen, Aulweg, Giessen, Németország

Nadine Nink

1 Anatómiai és Sejtbiológiai Intézet, Justus-Liebig-University Giessen, Aulweg, Giessen, Németország

Sandeep Nikam

2 Tüdőfejlesztési és átalakítási osztály, Max-Planck-Szív- és Tüdőkutató Intézet, Parkstrasse, Bad Nauheim, Németország

Gerd Magdowski

1 Anatómiai és Sejtbiológiai Intézet, Justus-Liebig-University Giessen, Aulweg, Giessen, Németország

Gerhard Kripp

1 Anatómiai és Sejtbiológiai Intézet, Justus-Liebig-University Giessen, Aulweg, Giessen, Németország

Robert Voswinckel

2 Tüdőfejlesztési és átalakítási osztály, Max-Planck-Szív- és Tüdőkutató Intézet, Parkstrasse, Bad Nauheim, Németország

Christian Mühlfeld

1 Anatómiai és Sejtbiológiai Intézet, Justus-Liebig-University Giessen, Aulweg, Giessen, Németország

3 Funkcionális és Alkalmazott Anatómiai Intézet, Hannoveri Orvostudományi Kar, Hannover, Németország

Absztrakt

Bevezetés

A szív atrófiája a hosszan tartó ágynyugalom, a mechanikus kirakodás vagy a katabolizmus időszakaiban következik be, például rákos cachexia vagy alultápláltság (Vandewoude & Buyssens, 1992a; Hill & Olson, 2008; Brinks és mtsai 2009; Tian és mtsai 2010; Baskin és Taegtmeyer, 2011). Az éhezés során a mitokondriális és a miofibril térfogat arányának csökkenését, valamint a kardiomiocita T-rendszer tágulását figyelték meg (Vandewoude & Buyssens, 1992a). A nyulak szívének biokémiai elemzése 0, 3 vagy 7 napig éhezett, és kiderült, hogy az új fehérjék, különösen a miofibrillák szintézisének csökkenése és a fehérjék csökkent felezési ideje jelentősen hozzájárul a szív atrófiájához (Samarel és mtsai 1987). Érdekes módon a mechanikusan terheletlen szívekben a szív atrófia mind a fehérjeszintézis, mind a lebontás útját magában foglalja, ami aktív atrófiás átalakulási folyamatot jelez (Razeghi et al. 2003). Egy nemrégiben végzett tanulmányban a rákos cachexia egéren hatásairól beszámoltunk arról, hogy a miofibrilláris térfogat csökken, bár a bal kamra teljes tömege és a kardiomiociták össztérfogata ugyanaz marad. Ezenkívül beszámoltunk arról, hogy a rákos cachexia a szívizom beidegződésének csökkenésével jár, a kontrollértékek körülbelül 50% -áig (Mühlfeld et al. 2011). Hogy ez a hatás összefügg a testsúly csökkenésével vagy más patogén tényezőkkel, például a megnövekedett citokinszinttel, nem világos.

A kalória-korlátozás vagy az éhezés által kiváltott szív-átalakítással kapcsolatos legtöbb tanulmány a kardiomiociták atrófiás válaszára összpontosított, míg a kardiomiocita mikrokörnyezet, nevezetesen a kapillárisok és az innerváció átalakulását nem vizsgálták. Valójában csak egy tanulmány foglalkozott a szívizom kapillárisainak alultápláltsági változásaival. A paraméterek többsége relatív érték, például térfogat vagy felületi sűrűség, ezért nehezen kapcsolhatók össze a kardiomiocita rekesz változásával (Vandewoude & Buyssens, 1992b). Különösen a kalória-korlátozás által kiváltott változások kapcsolata és időbeli lefutása a szívizom különböző területeiben jelenleg nem ismert. A rekeszek közötti aránytalan átalakítás klinikai jelentőségű lehet, különösen azoknál a betegeknél, akik szívbetegségben szenvednek, és önként vagy önkéntelenül kezdenek fogyni.

Ezen megfontolások és a rákos cachexiával kapcsolatos korábbi munkánk fényében feltételeztük, hogy a kalória-korlátozás által kiváltott bal kamrai remodelláció egy arányos atrófiás folyamat, amely egyszerre és hasonló mértékben vesz részt kapillárisokban, idegrostokban és kardiomiocitákban. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez az egereket 0, 3 és 7 napig 50% -os kalória-korlátozásnak vetettük alá, és a tervezésen alapuló sztereológiai módszerekkel vizsgáltuk a bal kamrát. Meghatároztuk a kardiomiociták és azok organelláinak teljes térfogatát, valamint a kapillárisok és axonok teljes hosszát. Hipotézisünkkel ellentétben a kalóriakorlátozás által kiváltott bal kamra átalakítása csak a kardiomiocita és a kapilláris rekeszet foglalja magában, nem pedig az innervációt, és azt javasoljuk, hogy az atrófiás átalakulás jövőbeli tanulmányai során figyelembe vegyék a különböző szívizom komponensek kölcsönhatásának változásait.

Anyagok és metódusok

Állatok

Összesen 15 felnőtt, hím 8 hetes C57BL/6J egeret vásároltunk a Charles River Laboratories-tól (Franciaország), és véletlenszerűen egy kontroll, 3 napos kalóriabetét és 7 napos kalóriabeszélő csoportba soroltuk (n = 5 mindegyik). Az egereket egyedi gyártású anyagcsere-ketrecekben tartották (egy egér ketrecenként) 4 napig, hogy hozzászokjanak az új környezethez, ad libitum táplálékhoz és vízhez, szabályozott hőmérsékleten és világítással (12 órás világos-sötét ciklus). Ez alatt a 4 nap alatt kiszámolták az egérenkénti átlagos táplálékfelvételt, majd a 3 és 7 napos csoportba tartozó egereket a spontán bevitel 50% -ának megfelelő kalória-korlátozásnak vetették alá. Minden kísérletet a nemzeti és nemzetközi előírásoknak megfelelő intézményi irányelvek szerint hajtottak végre, és a helyi hatóságok jóváhagyták.

Az állatokat izoflurán inhalációval és az azt követő exsanguinnal leöltük a hasi cava vénájának levágásával. Ezt követően a mellkast kinyitották, a szívet gyorsan kivágták, és 4% paraformaldehidet tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldatban 4 ° C-os hideg fixálóba merítették. A szívet legalább 24 órán át 4 ° C-on fixálóban tartottuk. A szívet lemértük, a pitvarokat és a jobb kamrát eltávolítottuk a bal kamrákból. Ez utóbbit lemértük, hosszirányban és háromszor keresztben vágtuk. A kapott nyolc darabot szisztematikusan, egységesen, véletlenszerűen vettük mintába, hogy négy szövetdarabot kapjunk a paraffin beágyazásához. A fennmaradó négy darab közül egyet véletlenszerűen választottak ki, gondosan lemérve és külön paraffinba ágyazva, míg a másik három mintát epoxigyantába. A parafin beágyazást a szokásos protokollok szerint hajtottuk végre. Az epoxigyanta beágyazásához a mintákat 1% -os ozmium-tetroxidban utólag rögzítettük a víztartályban, tömbben félig telített vizes uranil-acetátban festettük, növekvő etanol-sorozatban dehidratáltuk és végül Eponba ágyaztuk.

Sztereológia

Az ebben a tanulmányban alkalmazott sztereológiai módszerek jól megalapozottak, és egy nemrégiben készült felülvizsgálat tárgyát képezték (Mühlfeld et al. 2010a). A fénymikroszkópos sztereológiához egy Olympus BX51 mikroszkópot (Olympus, Hamburg, Németország) használtunk, digitális fényképezőgéppel (Olympus DP72) és az újCAST sztereológia szoftverrel (Visiopharm, Horsholm, Dánia). A transzmissziós elektronmikroszkópiát LEO 902 elektronmikroszkóppal (Zeiss, Oberkochen, Németország) végeztük. A sztereológiai elemzéshez szükséges összes látómezőt (FOV) szisztematikus, egységes véletlenszerű mintavétellel nyertük (Gundersen & Jensen, 1987).

A kardiomiociták sztereológiai elemzéséhez az Epon-beágyazott szövetblokkokból szemitint és ultravékony metszeteket vágtunk ki, majd toluidinkékkel és ólom-citrát/uranil-acetáttal festettük. Vizsgálati pontokkal rendelkező rácsokat vetítettünk az FOV-ra, és megszámoltuk az érdekes struktúrákat eltaláló pontok számát. A fénymikroszkópos szinten (objektívlencse nagyítás: 40 ×) megszámoltuk a kardiomiocitákat és az interstitiumot elütő pontok számát, és e rekeszek térfogat-részének kiszámításához használtuk a VV (str/ref) = P (str)/P (ref), ahol VV (str/ref) az érdeklődő szerkezet térfogat-hányada a referencia térfogathoz viszonyítva, P (str) az érdeklődő struktúrát eltaláló pontok száma, P (ref) pedig az összes a referencia térfogatot elért pontok száma. Elektronmikroszkópos szinten (elsődleges nagyítás: 7000 ×) a miofibrillákat, a mitokondriumokat, a szabad szarkoplazmát és a magot elütő pontok számát megszámoltuk, hogy kiszámítsuk ezeknek a rekeszeknek a kardiomiocitával, mint referenciatérfogattal kapcsolatos térfogatrészét a fent leírtak szerint. A térfogatsűrűségeket megszoroztuk a megfelelő referencia térfogattal, hogy megkapjuk a rekeszek teljes térfogatát.

A kardiomiociták között elágazó axonok teljes hosszát egy nemrégiben kialakított módszerrel becsültük meg (Mühlfeld et al. 2010b). Az idegrostprofilokat immunhisztokémiai módszerrel tettük láthatóvá a 9.5 fehérjegén termék (PGP9.5; Gulbenkian et al. 1987). 40x objektív lencse nagyításnál megszámoltuk a PGP9.5-pozitív idegrostprofilok számát, ha véletlenszerűen mintavételezett FOV-ra vetített, elfogulatlan számláló keret területén fekszenek. A kapillárisok hosszsűrűségével megegyező egyenletet használva kiszámítottuk az idegrostok hosszsűrűségét. Elektronmikroszkópos szinten (elsődleges nagyítás: 20 000 ×) szisztematikusan egységes véletlenszerű mintavételt alkalmaztunk FOV-t tartalmazó idegrostok előállítására. Ezekből a képekből megszámoltuk az axonprofilok átlagos számát idegrostprofilonként, és megszoroztuk az idegrostok teljes hosszával, hogy megkapjuk a kamrában lévő axonok teljes hosszát. Ezenkívül az axonok átlagos átmérőjét mértük a legnagyobb átmérővel, amely a leghosszabb axon profilátmérővel merőleges.

A paraffin beágyazása során nagy és kiszámíthatatlan mértékű szöveti zsugorodás lép fel, és hamis becslésekhez vezet, ha a metszetekből kapott sűrűségeket a beágyazás előtt egyszerűen megszorozzuk a referencia térfogattal (Dorph-Petersen és mtsai 2001). Ezért minden állatból azt az egy szövetblokkot, amelyet külön-külön beágyaztak a paraffinba, teljesen 7 μm vastag szakaszokra vágták. A Cavalieri-elv (Howard & Reed, 2005) alkalmazásával megbecsültük ezeknek a szakaszoknak a területét, szorozva őket a szakasz vastagságával és a szakaszok teljes számával. Ezt a mikroszkóposan meghatározott térfogatot a beágyazás után és a beágyazás előtt mért térfogatot használtuk a beágyazás miatti szöveti zsugorodás kiszámításához. A szövetek zsugorodását korrigáló tényezőt felvették az idegrostok hosszsűrűségének korrigálására. Az Eponba ágyazott mintákon nem végeztek ilyen korrekciót, mert korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy az epoxigyantában a szövetek zsugorodása elhanyagolható (Dorph-Petersen és mtsai 2001; Eisele és mtsai 2008).