A táplálékfelvétel metabolikus rugalmatlanságának jelzése spontán túlsúlyos labrador retriever kutyáknál

Absztrakt

Háttér

A kutyák elhízása egyre nagyobb problémát jelent a morbiditással, az élettartam rövidülésével és a rossz életminőséggel. A túlsúlyos kutyák étkezés utáni hiperlipidémiát mutatnak, kiemelve a lipid anyagcsere potenciális diszregulációinak azonosításának szükségességét. Ez a tanulmány a lipid anyagcserével kapcsolatos metabolitokat (azaz az acilkarnitint és a taurint) és a foszfolipideket vizsgálta takarmány-provokációs tesztben, és a spontán túlsúlyos kutyák metabolikus variációinak azonosítására irányult. Huszonnyolc egészséges hím labrador retriever kutyát vontak be, közülük 12-t soványnak (testállapot-pontszám (BCS) 4–5 egy 9-es skálán) és 16-ot túlsúlyosnak (BCS 6–8) soroltak. Egynapos böjt (14–17 óra) után böjt vérmintákat gyűjtöttek, és a kutyákat magas zsírtartalmú étellel etették, majd étkezés utáni vérmintát óránként 4 órán át. A plazma metabolitok és foszfolipidek azonosítására folyadékkromatográfia és a repülési tömegspektrometria idejét (LC-TOFMS) alkalmaztuk. Az adatok értelmezéséhez többváltozós modelleket, vegyes modell ismételt méréseket és lineáris regressziós elemzéseket alkalmaztunk.

Eredmények

Minden kutyában a propionilkarnitin, a sztearoil-karnitin és a kilenc foszfolipid emelkedett a táplálékfelvétel hatására, míg a vakcinil-karnitin csökkent (P ≤ 0,005). Összességében a takarmány-provokációs tesztben a karnitin és az acetilkarnitin szignálterülete alacsonyabb volt a túlsúlyos kutyáknál (P ≤ 0,004). Nevezetesen, az éhomi plazma-acetilkarnitin alacsonyabb volt a túlsúlyos kutyáknál, mint a sovány kutyáknál (P = 0,001), és ez nem változott az etetésre adott válaszként. Ez utóbbi megállapítás ellentétben volt a sovány kutyáknál az étkezés utáni egy órában talált csökkent acetilkarnitin szignálterülettel (P 6), mint sovány kutyáknál (P

Háttér

Világszerte gyorsan növekedett a túlsúlyos és elhízott emberek száma. Az elhízott emberek gyakran súlyos egészségügyi komplikációkban szenvednek, és az elhízást napjainkban betegségnek minősítik [1]. A kutyák nagyrészt közös életmódot folytatnak gazdáikkal [2, 3], és a túlsúly is növekvő probléma a kutyáknál [4, 5], ami együtt jár a morbiditással, a rossz életminőséggel [6, 7] és a rövidebb várható élettartammal [8, 9]. Kimutatták, hogy a túlsúlyos kutyák inzulinrezisztenciát és étkezés utáni hipertrigliceridémiát mutatnak [10,11,12], valamint a lipid anyagcseréhez kapcsolódó metabolitok variációit [13,14,15] a sovány kutyákhoz képest.

Emberekben azt javasolták, hogy az anyagcsere rugalmatlansága összekapcsolódhat az elhízás és az inzulinrezisztencia között [16, 17]. Ilyen kapcsolat fennállhat a túlsúlyos inzulinrezisztens kutyáknál is. A rugalmas anyagcsere fontossága egyre nagyobb figyelmet kapott az anyagcsere-egészségügy és az elhízás kutatásában, mivel a mitokondriális oxidációs sebességet és az üzemanyag-kapcsoló kapacitását írja le [18,19,20]. A karnitin fontos metabolitnak számít az anyagcsere rugalmasságának szabályozásában és a lipid anyagcserében, mivel közvetíti a hosszú és közepes láncú zsírsavak behozatalát a mitokondriális mátrixba a béta-oxidáció érdekében, és pufferként működik az acilcsoportok számára a karnitin képződésével. észterek, azaz acilkarnitinek [17, 21]. Emberben a tömegspektrometriával elemzett acilkarnitin mintákat szokták használni a lipid anyagcsere veleszületett rendellenességeinek szűrésére és diagnosztizálására [22]. Ezenkívül kimutatták, hogy a karnitin szerepet játszik a bonyolult, 2-es típusú diabetes mellitusban az embereknél [23], és az elhízottaknál magas, közepes vagy hosszú láncú acilkarnitin-koncentrációt találtak a sovány alanyokhoz képest [24, 25]. A táplálékfelvétel utáni acilkarnitin-mintákat emberen vizsgálták [26], de a kutyákra vonatkozó megfelelő vizsgálatok jelenleg hiányoznak.

Túlsúlyos embereknél a lipoprotein-frakciók magasabbnak bizonyultak, mint sovány alanyoknál, kivéve a nagy sűrűségű lipoproteineket, amelyek általában alacsonyabbak az elhízásban [27]. Nem világos, hogy az összes vagy a specifikus lipoprotein frakciók növekednek-e a túlsúlyos kutyákban, mivel a korábbi vizsgálatok eltérő eredményeket mutatnak [28,29,30,31]. Ezenkívül a kutyák extra nagy sűrűségű lipoprotein frakcióval rendelkeznek az emberhez képest [28]. A foszfolipidek képezik a kutyák lipoproteinjeinek fő összetevőjét [32], ezért különleges érdeklődésre tartanak számot. A lipidomika analitikai megközelítés, amely felhasználható a plazma foszfolipidek mintázatának jellemzésére [33], de kutyáknál ez a megközelítés eddig főként akut túlsúlyos egyéneknél volt alkalmazható [14]. Elhízott embereknél megváltozott lipidutakat, például a lizofoszfatidilkolin növekedését azonosították a lipidomikával [34]. Ezért érdekes összehasonlítani a foszfolipid profilokat a sovány és a túlsúlyos kutyák között folyadékkromatográfia és a repülési tömegspektrometria (LC-TOFMS) lipidomika segítségével.

Kiinduló hipotézisünk az volt, hogy az étkezés előtt és után az acilkarnitin metabolitjai és a potenciálisan bizonyos foszfolipidek hasonlóan változnak a túlsúlyos kutyáknál, mint a túlsúlyos embereknél. A jelen vizsgálat célja tehát a lipid anyagcseréhez kapcsolódó metabolitok (azaz az acilkarnitinek és a taurin), valamint a foszfolipidek vizsgálata volt a takarmány-provokációs tesztben, és a spontán túlsúlyhoz kapcsolódó metabolikus variációk azonosítása kutyákban.

Mód

Kutyák és általános tanulmányterv

A magántulajdonban lévő ép hím labrador retriever kutyákat személyes levelekkel toborozták kutyatulajdonosokhoz a Svéd Kennel Klub nyilvántartása alapján. A szelekciós folyamat egy on-line felmérésből és egy klinikai egészségügyi vizsgálatból állt (amelyet JS végzett), beleértve a vér- és vizeletanalízist is, annak biztosítására, hogy a kutyák megfeleljenek a felvételi és kizárási kritériumoknak [35]. Huszonnyolc egészséges labrador retriever kutyát vontak be a vizsgálatba. Az egészségügyi vizsgálat mellett az összes kutyát testállapot-besoroláson (BCS) vetették át, lemérték és lefényképezték [35].

A részvételt megelőzően a kutyák szokásos házi étrendjében vagy csemegéiben nem történt módosítás. A vizsgálatot megelőző két hét alatt az étrend előzményeit napi étkezési naplók gyűjtötték. Ezek szerint minden kutya fő energiaellátása száraz vagy nedves, teljes kereskedelmi étrend volt, és a leggyakoribb fehérjeforrás a csirke volt. Korlátozott számban sovány és túlsúlyos kutyákat tápláltak alacsony zsírtartalmú kalóriatartalmú étrenddel, a metabolizálható energia fő részét zsírból nyerték, vagy teljes táplálékot kaptak, amelyek L-karnitin adalékokat tartalmaznak. A karcsú és túlsúlyos kutyáknak asztali maradványokkal, csemegékkel vagy rágókkal való megosztás gyakorisága nem különbözött (1. kiegészítő fájl).

A kutyákat a klinikai mintavétel előtti napon 18 órától böjtölték, a vizsgálati nap reggelén pedig visszatartották a vizet, és ürített vizeletmintát vettek. 8 és 9:30 óra között, 14–17 órás koplalás után a kutyák megérkeztek a klinikára, egészségügyi vizsgálatnak vetették alá őket és éhomi vérmintákat vettek. Ezt követően egy próbaétkezést alkalmaztunk, és étkezés utáni vérmintákat négyszer óránként gyűjtöttünk. A vizsgálatot a svédországi Uppsalában, a Svéd Agrártudományi Egyetemen végezték, és azt a svéd Uppsala Állatkísérletekkel foglalkozó Etikai Bizottság hagyta jóvá (C180/12). Ez a prospektív tanulmány követte az epidemiológiai megfigyelési tanulmányok jelentésének irányelveit [36], és minden kutyához megkapta a tulajdonos írásbeli beleegyezését.

A test állapotának értékelése

Az éhomi vérmintákat vénás katéterrel gyűjtöttük 15 perccel a teszt étkezés előtt, majd óránként legfeljebb négy órán át étkezés után. A vérminta-eljárás és a szérumgyűjtés részleteit korábban leírták [39]. A plazmacsöveket (Hettich Vacuette Lithium Heparin, Greiner bio-one) centrifugáltuk (1500 ×g 10 percig) közvetlenül a mintavétel után, és a plazmát polipropilén csövekbe vittük (SC Micro Tube PCR-PT, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Németország), és azonnal lefagyasztottuk - 70 ° C-on.

LC-TOFMS alapú metabolomikai elemzés

A minta előkészítése

Az LC-TOFMS esetében a plazmamintákat jégen felolvasztottuk, és 5 μl-t extraháltunk 495 μl metanolban (LC-MS fokozat, VWR Chemicals, Radnor, PA) foszfolipid standardokkal kiegészítve (4. kiegészítő fájl). A fehérje csapadékot 10000x-es centrifugálással választottuk elg 10 percig 4 ° C-on, és 450 μl felülúszót vittünk át kromatográfiás fiolákba.

LC-TOFMS elemzés

Adatfeldolgozás

Az adatokat a Compass DataAnalysis 4.1 (Bruker Daltonics, Bremen, Németország) alkalmazásával dolgoztuk fel, és a kromatogramokat a Gauss-féle simítás egy ciklusával, 2 s szélességgel elsimítottuk a terület kiszámítása előtt. Az egyes metabolitok kromatográfiás csúcsát annak pontos tömegével és retenciós idejével detektáltuk, beleértve a ± 0,01 tömegablakot m/z és a retenciós idő ablaka ± 30 s. A karnitin esetében meghatároztuk a relatív intenzitást. A foszfolipidek esetében az abszolút koncentrációt a plazmában négy különböző foszfolipid belső standarddal határozták meg, amelyeket a mintákhoz adtak.

statisztikai elemzések

Metabolitok

A túlsúlyos kutyák lipidanyagcseréjének variációira vonatkozó korábbi megállapítások alapján [14, 35] elkészítették a lipidanyagcseréhez kapcsolódó potenciálisan érdekes metabolitok (azaz az acilkarnitinek és a taurin) listáját (n = 61) és ezeket a plazmában kerestük a vegyület pontos tömegei alapján a létrehozott LC-TOFMS spektrumok alapján. Megállapították, hogy a megcélzott metabolitok közül hat meghaladja a számszerűsítési határértéket (szignál/zaj arány; S /N > 10) és statisztikai elemzésekben használtuk (1. ábra és 5. kiegészítő fájl). A takarmány-provokációs teszt e hat metabolitjának plazmaválaszát vegyes modell ismételt mérések analízisével értékeltük SAS-ban [41,42,43] szignifikancia szinttel P 1. ábra

Foszfolipidek

A 317 foszfolipid jelenlétét a plazmában LC-TOFMS analízissel határoztuk meg, és ezeknek a foszfolipideknek a mennyiségét négy foszfolipid belső standard alkalmazásával határoztuk meg. A foszfolipideket, amelyek értéke a megfigyelések több mint 50% -ában nulla volt, kizártunk. A fennmaradó nulla értékek kezelése érdekében az adatállomány összes megfigyelésében a maradék 118 foszfolipidet (6. kiegészítő fájl) 0,01 nM adták a mért koncentrációhoz. Többváltozós statisztikákat (SIMCA-P + 13,0 Umetrics, Umeå, Svédország) használtunk a foszfolipidek (nM) azonosítására, amelyek az adagolással történő teszt során idővel változtak, vagy túlsúlyosak voltak (n = 118 x-változóként). A nyers adatok véletlenszerűségét és legfeljebb három kiugró érték lépésenkénti eltávolítását alkalmaztuk (főkomponens-elemzés segítségével) minden egyes összehasonlításban.

Egy párosított többváltozós modellt, az ortogonális részleges legkisebb négyzetes effektus vetületelemzést (OPLS-EP) alkalmaztunk, hogy összehasonlítsuk az étkezés utáni idõpontokat az éhezéssel. Ez a modell összehasonlítja a válaszokat (itt az étkezés utáni időpontról kivont éhomi koncentrációval) x-változókkal az y = 1 célértékkel [40]. Az OPLS-EP modell kifejezi az adatok struktúráját, és azonosíthatja azokat az egyéneket, akiknek egy beavatkozás esetén eltérõ metabolikus válasza van, itt a takarmány-kihívás teszt. Négy OPLS-EP modellt állítottak elő az egységváltozó skálázás (UVN) alkalmazásával az x-változókra, és nem skáláztak az y-változóra, a modellalkotók ajánlása szerint [40]. Az OPLS-EP modellek jelentőségét kereszt-validált varianciaanalízissel (CV-ANOVA) [44] ellenőriztük, ahol a P 1,5 és amelyek esetében a megfelelő jackknife-alapú 95% -os konfidencia-intervallumok (CI) nem voltak nullához közeliek vagy sem, diszkriminatívnak és szignifikánsnak tekintették a megfigyelt elválasztásokat. A jelentős VIP-kkel rendelkező foszfolipideket kevert modell ismételt mérési elemzéssel teszteltük a fent leírtak szerint. Bonferroni többszörös összehasonlítás után végzett korrekciója után a szignifikancia szintje α volt

Eredmények

Metabolitok

Foszfolipid válaszok az étel bevitelére. A vetítési (VIP) értékek változó jelentősége a foszfolipid adathalmaz ortogonális parciális legkisebb négyzetes effektus-vetítés (OPLS-EP) elemzésén (4 óra időpont mínusz koplalás) alapul. Az értékek VIP és konfidencia intervallumként (CI) jelennek meg. Megjelennek azok a diszkrimináns foszfolipidek, amelyek jelentős szerkezetet adnak a modellnek (VIP> 1,5), és amelyek esetében a megfelelő jackknife-alapú 95% -os CI-k nem voltak nullához közeliek vagy sem.

A többváltozós OPLS-DA modellek minden egyes időpontban nem azonosítottak többváltozós különbséget a foszfolipid profilokban a sovány és a túlsúlyos kutyák között. A hipotézis-vezérelt lineáris regressziós elemzések pozitív kapcsolatot mutattak egy éhomi foszfatidilkolin (PCaa C38: 4) és BCS (R 2 0,31 és P = 0,002). Bár a lineáris regresszióanalízis szignifikáns volt, a diagram nem mutatott különbséget a PCaa C38-ban: 4 koncentráció a sovány (BCS 4–5) és kissé túlsúlyos kutyák (BCS 6) között. Ennek további vizsgálatához a kutyákat sovány (BCS 4–5, n = 12), kissé túlsúlyos (BCS 6) csoportokra osztottuk., n = 10) és jól láthatóan túlsúlyos kutyák (BCS> 6, n = 6) ehhez az összehasonlításhoz és egyirányú ANOVA-t használtak Tukey-Kramer beállítással. A túlsúlyos kutyáknál (BCS> 6) szignifikánsan magasabb volt a PCaa C38: 4 koncentráció (P 4. ábra

Vita

Ebben a tanulmányban spontán túlsúlyos Labrador Retriever kutyáknál azonosítottak egy acetil-karnitin mintát, amely jelzi az anyagcsere rugalmatlanságát a táplálékfelvétellel szemben, bár a túlsúlyos kutyák egyike sem mutatta mély inzulinrezisztencia jeleit [39]. A karnitin szignálterületei összességében alacsonyabbnak bizonyultak a túlsúlyos kutyáknál, mint a sovány kutyáknál. Érdekes módon az alacsonyabb karnitin-státus elméletileg lelassíthatja a zsírsav-oxidációt, mivel a karnitin a béta-oxidáció érdekében a mitokondrium belsejébe szállítja a zsírsavakat [46].

Ezenkívül a jelen vizsgálat sovány kutyái szignifikánsan csökkent acetil-karnitin szignálterületet jelentettek az éhezéstől az étkezés után egy óráig, míg a túlsúlyos kutyák nem reagáltak az etetésre. Ezek a megállapítások azt mutatják, hogy a sovány kutyák rugalmas anyagcserét mutatnak, amelyet nem láttak túlsúlyos kutyáknál. A sovány kutyák étkezés utáni csökkent acetil-karnitin szignálterülete jelentheti az üzemanyag-váltást az endogén tárolt lipidek használatáról a közelmúltban felszívódott glükóz felhasználására a tesztétkezés során, amint ezt az embereknél korábban bemutatták [26]. Így a katabolikus állapotból az anabolikus állapotba való átmenet sovány, de túlsúlyos kutyáknál nem. A sovány (BCS 4–5) és kissé túlsúlyos kutyák (BCS 6) összehasonlítható leptin-koncentrációt mutattak (2. kiegészítő fájl). Az anyagcsere rugalmatlanságának jelei azonban már kissé túlsúlyos kutyáknál jelentkeztek (BCS 6), amit acetilkarnitin-válaszuk mutat (2. kiegészítő fájl). Érdekes módon az acetilkarnitin-válasz nem különbözött kissé túlsúlyos (BCS 6) és kiemelkedően túlsúlyos kutyák (BCS> 6) között, ami a metabolikus rugalmatlanságot jelzi ebben a két csoportban a táplálékfelvétellel. Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a kutyák metabolikus rugalmatlanságát az adipozitáson kívül más tényezők is befolyásolhatják (7. kiegészítő fájl).

A nagy erőfeszítések ellenére végül viszonylag alacsony számú kutya vonható be. Azonban a párosított többváltozós modellek és a vegyes modell ismételt mérési elemzései, amelyeket a jelen tanulmányban alkalmaztunk, robusztusnak bizonyultak, és az idő előtti egyértelmű válaszokat, valamint a takarmány-kihívás teszt csoportos különbségeit tudták kimutatni. Kívánatos lett volna több elhízott (BCS 8–9), de mégis egészséges kutyát bevonni, de az ilyen kutyák beírása rendkívül nehéznek bizonyult. A klinikailag értékelt BCS objektív megerősítése (pl. Kettős energiájú röntgenabszorpciós módszer) megerősíthette a BCS eredményeit, de ez a módszer a vizsgálat idején nem állt rendelkezésre. Az a tény, hogy ebben a vizsgálatban csak egy fajtából és nemből származó kutyákat alkalmaztak, feltehetően csökkentette az egyedi variációkat, és lehetővé tette a finom anyagcsere-változások kimutatását a viszonylag kis mintaméret ellenére. A kutyák túlsúlyának metabolikus rugalmatlanságának további vizsgálatához azonban különféle fajták nagyobb kohorszainak és a testállapot-skálák szélesebb skálájának tanulmányozására van szükség. Továbbá meg kell vizsgálni a különböző háttér-etetési rendek lehetséges hatásait, és indokoltak a szubsztrát-oxidációs vizsgálatok.

Következtetések

Ez a spontán túlsúlyos, egészséges labrador retrievereken végzett tanulmány kimutatta, hogy kutyákban még mérsékelt túlsúly is befolyásolhatja a lipid anyagcsere paramétereit. A túlsúlyos kutyáknál a karnitin státusza kompromittálódott, ami potenciális karnitin-elégtelenséget jelent. A túlsúlyos kutyák acetil-karnitin-reakciója csökkent éhgyomri zsírsav-oxidációt és az anyagcsere rugalmatlanságát jelzi az étel bevitelével szemben. További vizsgálatok szükségesek az anyagcsere rugalmatlanságáról és annak lehetséges szerepéről a túlsúlyos kutyák anyagcseréjében.