A tatár hajdina kivonat csillapította az elhízás okozta gyulladást és az izmok fokozott PGC-1a/SIRT1 expresszióját magas zsírtartalmú étrend okozta elhízott patkányokban

Seog-Young Kim

Mak-Soon Lee

Eugene Chang

Sunyoon Jung

Hyunmi Ko

Eunyoung Lee

Soojin Lee

Csong-Tai Kim

In-Hwan Kim

3 Integrált Orvostudományi és Élettudományi Tanszék, Koreai Egyetem, Szöul 02841, Korea; rk.ca.aerok@ni016k

Yangha Kim

Társított adatok

Absztrakt

1. Bemutatkozás

Az elhízás a krónikus pozitív energiamérleg miatt a zsírszövetben történő túlzott zsírfelhalmozódásra utal [1]. Az elhízás állapota szerepet játszhat a gyulladásos reakcióban, amelyet metabolikus betegségek, például cukorbetegség és szív- és érrendszeri betegségek kísérnek. Kimutatták, hogy a zsír felhalmozódásának növekedése hozzájárul a gyulladásos mechanizmushoz, a gyulladásgátló citokinek szekréciójának változásával [2,3,4].

A citokinek kiválasztódnak a zsírszöveti makrofágokból (ATM), amelyek klasszikusan két különböző formát tartalmaznak: gyulladásgátló M1 makrofág és gyulladásgátló M2 makrofág. Az ATM-ek hajlamosak M2-ről M1-re váltani a zsír hipertrófia előrehaladása során, és ezt követően gyulladásgátló citokinek, például tumor nekrózis-faktor α (TNF-α), interleukin 6 (IL-6) és monocita kemoattraktáns fehérje 1 (MCP) szabadulnak fel. -1) [5,6]. A zsírszövetben rezidens makrofágok ilyen átalakulását makrofág polarizációnak nevezik.

Tápanyagokkal túlterhelt környezetben a mitokondriális biogenezis és a diszfunkcionális mitokondrium diszregulációja hiányos mitokondriális zsírsav-oxidációt, megnövekedett reaktív oxigénfajok (ROS) képződést, valamint a glükóz metabolizmus és az inzulinrezisztencia károsodását eredményezheti [7,8,9]. Ezeket számos klinikai tanulmány is alátámasztja, amelyek kimutatták az enzimek csökkent aktivitását, az izom mitokondriális tartalmának biomarkereit és az elhízott emberi vázizmok mitokondriális számát [10,11,12]. Tekintettel az elhízás és a vázizom mitokondriális diszfunkciója közötti pozitív kapcsolatra, meg kell akadályozni az elhízás okozta mitokondriális változásokat a vázizomzatban.

A hajdina a délnyugat-kínai Yunnam tartományból származik, és sok országban lisztként vagy teaként fogyasztják [13]. A hajdina sok bioaktív komponenst tartalmaz, és flavonoidokban gazdag, beleértve az orientint, a vitexunt, a kvercetint és a rutint. Különösen a fogkő hajdina (Fagopyrum tataricum) körülbelül 80-szor magasabb rutint tartalmaz, mint a közönséges hajdina (Fagopyrum esculentum) [14]. Ebből a szempontból széles körben tanulmányozták a fogkő hajdina bioaktív funkcióit, például antioxidációt, hipokoleszterinémiát és gyulladáscsökkentőket. A tartár hajdina csíra etanol kivonata elnyomta a gyulladásgátló mediátor termelést az NF-KB p65 transzlokáció gátlásán keresztül az LPS által stimulált Raw 264.7 sejtekben [15]. A 3T3-L1 sejtekben a borkás hajdina-etanol-kivonat szintén gyengítette a gyulladásos reakciót moduláló nitrogén-oxid (NO) termeléssel, valamint a TNF-α és az IL-6 gén expressziójával [16]. Ezért ez a tanulmány megvizsgálta a fogkő hajdina kivonat (TB) hatásait az adipogenezis szabályozására, valamint a gyulladás és az izom mitokondriális biogenezisére magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott elhízott patkány modellben.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Tartár hajdina kivonatok készítése

A tuberkulózist az SKBioland Co. (Ansan, Gyeonggi, Korea) szívesen szállította. Az extrakciót a korábban leírt módon hajtottuk végre [16]. Röviden, a TB-t 70% etanollal (1:15 (w/v)) extraháltuk 80 ° C-on 3 órán át, majd leszűrtük. A szűrletet vákuumban bepároljuk, és a tömény folyadékot por alakú porlasztva szárítjuk (Dongjin ENG Inc., Siheung, Korea).

2.2. Teljes fenol-, teljes flavonoid- és rutinmeghatározás

A teljes fenoltartalmat a Folin-Denis módszerrel határoztuk meg [17]. Röviden: 1 ml TB-t összekevertünk 0,5 ml 2 N Folin-Ciocalteau reagenssel (Korean Food Standards Codex, 2011) és 2 ml 10% -os nátrium-karbonáttal. Az összekevert oldatot 90 percig szobahőmérsékleten sötét szobában helyeztük el, majd az abszorbanciát 765 nm-en mértük spektrofotométerrel (V-550, Jasco, Tokió, Japán). Az adatokat standard gallus savval (GAE) számítottuk, és 1 g száraz tömegre számított GAE ekvivalens mg-ban fejeztük ki.

Az összes flavonoidot alumínium-klorid módszerrel határoztuk meg [18]. Összesen 0,5 ml vizes hajdina kivonatot összekevertünk 0,5 ml alumínium-kloriddal (AlCl3), és 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az abszorbanciát 420 nm-en mértük spektrofotométerrel (V-550, Jasco, Tokió, Japán). Az összes flavonoid koncentrációját kvercetin-standard görbével határoztuk meg, és mg kvercetin-ekvivalensként fejeztük ki 1 g száraz tömegre számítva.

A TB rutintartalmát nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) elemeztük, és rutin standarddal határoztuk meg a korábban leírtak szerint [16].

2.3. Állatok és kísérleti tervezés

Asztal 1

Kísérleti étrendek összetétele (g/kg étrend).

HFDTB-LTB-H komponens

Kazein	238,79	238,79	238,79
Kukoricakeményítő	185.11	180.11	175.11
Dextróz	157.60	157.60	157.60
Szacharóz	59.70	59.70	59.70
Cellulóz	59.70	59,70	59.70
Szójabab olaj	29.85	29.85	29.85
Disznózsír	208.94	208.94	208.94
terc-butil-hidrokinon (TBHQ)	0,02	0,02	0,02
Ásványi keverék 1	41.79	41.79	41.79
2. vitamin keverék	11.94	11.94	11.94
L-cisztin	3.58	3.58	3.58
Kolin bitartarát	2.98	2.98	2.98
TB 3	-	5.00	10.00
Teljes	1000	1000	1000
Energiasűrűség (kcal/g)	4.8	4.8	4.8
Szénhidrát% (kalória)	35	35	35
Zsír% (kalória)	45	45	45
Fehérje% (kalória)	20	20	20

1 AIN-93G ásványi keverék; 2 AIN 93G vitaminkeverék; 3 TB, a tartárka hajdina kivonat rövidítése. HFD: 45% magas zsírtartalmú étrend; TB-L: HFD + 0,5% TB; TB-H: HFD + 1,0% TB.

2.4. Szérum kémiai mérés

Az aszpartát-transzamináz (AST), az alanin-transzamináz (ALT), a trigliceridek (TG), az összkoleszterin (TC) és a nagy sűrűségű lipoprotein-koleszterin (HDL-C) szérumszintjét enzimatikus kolorimetriás módszerekkel mértük kereskedelmi készletekkel (Asan Pharmaceutical Co ., Ltd., Szöul, Korea). Az alacsony sűrűségű lipoprotein-koleszterint (LDL-C) a Friedewald-képlettel számítottuk: [LDL-C = TC - HDL-C - (TG/5)] [19].

2.5. A zsírszövet szövettani elemzése

Az epididymális WAT-ot 10-szeres térfogatú 10% -os formalinnal rögzítettük egy éjszakán át. Rögzítés után a szöveteket paraffinba ágyazottuk, szekcionáltuk és hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük meg egy kereskedelmi forgalomban lévő festő készlet segítségével (ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA). A mintákat mikroszkóp alatt (Olympus, Tokió, Japán) figyeltük meg, és 200x-os nagyítással rögzítettük.

2.6. A zsírszövet immunhisztokémiája

A szövettani metszeteket a fent leírtak szerint dolgoztuk fel, paraffinoztuk és rehidratáltuk. A szöveti metszeteket nyúl poliklonális anti-F4/80 (EGF-szerű modul-tartalmú, mucinszerű, hormonreceptor-szerű 1) (C2C3) antitest oldattal (GeneTex Inc., CA, USA) inkubáltuk, majd a Polink-2 Plus HRP patkányellenes DAB detektáló készlet (Golden Bridge International Inc. Irvine, Kalifornia, USA). A metszeteket diaminobenzidinnel (Golden Bridge International, Inc.) festettük és Mayer hematoxilinnel (ScyTek) ellenfestettük.

2.7. Valós idejű kvantitatív polimeráz láncreakció (RT-qPCR)

A teljes RNS-t epididymális WAT-ból vagy vázizomból izoláltuk Ribo Ex (Geneall Biotechnology Co., Ltd., Daejeon, Korea) alkalmazásával. A cDNS-t 4 μg teljes RNS-ből szintetizáltuk M-MLV reverz transzkriptáz (Bioneer Co., Daejeon, Korea) alkalmazásával. A valós idejű qPCR elemzéshez fluorometrikus termikus ciklert (Rotor GeneTM 2000; Corbett Research, Mortlake, NSW, Ausztrália) és AccuPower 2X Greenstar qPCR Master keveréket (-ROX Dye) (Bioneer Co.) használtunk fel, és az adatokat viszonylag mennyiségileg meghatároztuk. a ΔΔCt módszer [20]. Gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenázt (GAPDH) alkalmaztunk referenciagénként a normalizáláshoz, és az eredményeket a HFD-csoporthoz viszonyított szoros különbségként fejeztük ki. A jelen vizsgálatban használt primereket az S1 kiegészítő táblázat ismerteti.

2.8. Szérum TNF-α mérés

A szérum TNF-α koncentrációt Rat TNF-α ELISA MAX ™ Deluxe (BioLegend, Inc., San Diego, Kalifornia, USA) alkalmazásával mértük a gyártó utasításainak megfelelően. A szérum TNF-α molekulasűrűségét az enzimekkel reagált színarány mértékeként fejezzük ki. A minták abszorbanciáját mikrolemez-olvasóval mértük 450 nm-en. A készlet érzékenysége 2 pg/ml volt

2.9. A nitrogén-oxid (NO) termelésének mérése

A NO-termelést szérum-nitritként mértük egy kereskedelmi készlet segítségével (Griess reagens készlet a nitrát meghatározásához; Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, USA). A szérumba jutó NO-kibocsátást 30 percig reagáltattuk a készlet által biztosított reagenssel, és az abszorbanciát 548 nm-en mértük. A nitritkoncentrációt standardként nátrium-nitrit alkalmazásával határoztuk meg. Az értékeket a HFD-csoport értékeiihez képest hajtáskülönbségként adtuk meg.

2.10. Glicerin-3-foszfát-dehidrogenáz (GPDH) aktivitás elemzése

A GPDH aktivitást GPDH assay kit (Takara, Japán) segítségével WAT-ban mértük. Az elemzéshez használt mintát úgy nyertük, hogy 0,1 g WAT-ot 200 μl enzim-extrakciós pufferrel homogenizáltunk. A gyártó által megadott vizsgálati eljárást követtük. Az eredményeket az összes fehérjekoncentrációra normalizáltuk, amelyet bicinchonininsav (BCA) fehérje-vizsgálati kit (Thermo Scientific) segítségével határoztak meg. A normalizált GPDH-aktivitást a HFD-csoport értékeinek összehasonlításakor a fold-különbségként tüntettük fel.

2.11. Sirtulin (SIRT) és AMP-aktivált protein-kináz (AMPK) Activitivess

A kivont izommagfehérjék SIRT enzimaktivitását kolorimetrikus univerzális SIRT aktivitás vizsgálati készlet alkalmazásával mértük a gyártó utasításainak megfelelően (Abcam, Cambridge, MA, USA). Röviden, a vázizomzatból származó magfrakciót (biceps femoris) kivontuk és megtisztítottuk egy nukleáris extrakciós készlet (Abcam) segítségével. A SIRT aktivitást a SIRT-átalakított dezacetilezett termékek közvetlen kimutatásával mértük, és a BCA protein assay kit (Thermo Scientific) által meghatározott megfelelő fehérjekoncentrációkra normalizáltuk.

Az AMPK aktivitást egy helyszíni, félkvantitatív immunvizsgálati módszerrel értékelték - egy AMPK kináz vizsgálati készletet (MBL Life Science, Woburn, MA, USA) a gyártó utasításainak betartásával. Ami a minta előkészítését illeti, röviden 0,1 g epididymális WAT-ot homogenizáltunk 400 μl RIPA pufferben (ELPIS Biotech., Korea). 10 percig jégen végzett inkubálás után az oldatot centrifugáljuk (4 ° C, 11 463 x g, 20 perc), és a vizes fázist elválasztjuk. Az eredményeket a BCA protein assay készlettel (Thermo Scientific) meghatározott fehérje mennyiségre normalizáltuk. Az AMPK aktivitást fehérjekoncentrációra normalizáltuk, és a HFD csoport értékeihez viszonyított hajtáskülönbségként fejeztük ki.

2.12. Statisztikai analízis

2. táblázat

Bioaktív vegyületek megtalálhatók a hajdina hajdina kivonatokban.

TartalomTartári hajdina kivonat

Összes fenol (mg GAE/g szárított minta)	101,11 ± 5,5
Összes flavonoid (mg QE/g szárított minta)	95,05 ± 3,6
Rutin (mg/g szárított minta)	106,02 ± 1,3

Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. Az összes fenoltartalmat 1 g száraz tömegre vonatkoztatva mg gallinsav (GAE) ekvivalensben fejeztük ki. Az összes fenol, az összes flavonoid és a rutin koncentrációját gallus-sav (GAE), kvercetin (QE) és rutin-ekvivalens 1 mg száraz tömegben fejezzük ki.