Journal of Biomedical Sciences

Astha Nigam 1 *, Avnish Kumar 2, Madhusudan HV 1 és Neelam Bhola 1

1 Mikrobiológiai Tanszék, CloneGen (P) Ltd. NOIDA, India.

2 Biotechnológiai Tanszék, Élettudományi Kar, Dr. B. R. Ambedkar Egyetem, Agra, India.

* Levelező szerző: Astha Nigam
Stanley Browne laboratórium
TLM Közösségi Kórház
Nand Nagri, Shahdara, Delhi-110093
Email: [e-mail védett]

Absztrakt

Kulcsszavak

potenciális probiotikus tulajdonságok; gram-negatív baktériumok; in vitro; tisztítás és szűrés.

Bevezetés

Az emberi bélben jelenlévő mikrobiális csoportok közötti egyensúly kulcsfontosságú az egészség megőrzése szempontjából. Ha ez az egyensúly megszakad, a gazdaszervezet és a mikroba kapcsolata előrehaladhat a betegség állapota felé. Ezen túlmenően leírták, hogy a mikro-bióta-eltérések a specifikus betegségek fokozott kockázatával járnak, ideértve a gyulladásos bélbetegségeket, az irritábilis bélbetegségeket és az antibiotikumokkal járó hasmenést, valamint allergiával, elhízással és cukorbetegséggel [1]. A mikro-bióta egyensúly fenntartása tehát fontos az egészség megőrzése és elősegítése érdekében. Az élő baktériumokat tartalmazó élelmiszerek fogyasztása a legrégebbi és a legszélesebb körben alkalmazott módszer a bélrendszerben az úgynevezett „probiotikumoknak” nevezett előnyös baktériumok számának növelésére [2]. Figyelemre méltó, hogy számos ókori időkre visszanyúló probiotikus étel található, amelyek többnyire erjesztett élelmiszerekből és tenyésztett tejtermékekből származnak [3-10]. Az értékes bioaktív tulajdonságokkal rendelkező élelmiszer-összetevők megkeresése ösztönözte a tejsavbaktériumok (LAB) iránti érdeklődést probiotikus tulajdonságokkal, például patogén mikroorganizmusok elleni antibakteriális aktivitással [11], vírusellenes aktivitással [12], élesztőgátló tulajdonsággal [13], anti- mutagén [14], anti-thrombocyta aggregáció [15] és antioxidáns tulajdonságok [16] stb.

Általánosságban úgy gondolják, hogy a probiotikumok segítenek fenntartani az egyensúlyt a bélben található káros és jótékony baktériumok között, ezáltal fenntartva az egészséges emésztőrendszert [10]. A probiotikumok egészségre vonatkozó állításai a bélaktivitás és a közérzet szabályozásától a specifikusabb akciókig terjednek, mint például a gasztrointesztinális kórokozókra, mint például a Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori és Rotavirus stb., Antagonista hatásra [17]. Néhány köztudott, hogy semlegesíti a vastagbélben termelődő élelmiszer-mutagéneket, az immunválaszt a Th2 válasz felé tereli, enyhíti az allergiás reakciókat és csökkenti a szérum koleszterinszintjét [18].

Az antibakteriális tulajdonságú probiotikumok hatásmechanizmusa talán annak köszönhető, hogy bakteriocinokat termelnek, például nikotint [19], vagy csökkentik a pH-t savas vegyületek, például tejsav előállításával [20]. A probiotikus törzsek más fertőző baktériumokkal versenyeznek a tápanyagokért és a sejtfelszínért, és segítenek eltávolítani őket a gyarmatosítás gátlásával [21]. Néhány törzsről ismert, hogy aktív enzimeket termel, amelyek gátolják a többi patogén baktériumot [22]. A probiotikumok egészségügyi előnyeit mindig megvizsgálták, tekintettel arra, hogy képesek-e fenntartani elérhetőségüket, életképességüket [23], emészthetőségüket, és egészségügyi előnyeiket a gazda számára nyújtják-e anélkül, hogy megváltoztatnák az élelmiszer biztonságosságát [24] és az érzékszervi tulajdonságait amelyet beépítettek [25]. Ma életképes, jó funkcionális tulajdonságokkal rendelkező probiotikus törzsek kaphatók a piacon élelmiszerek és italok összetevőiként, erjesztett tejtermékekben, például joghurtban [26] vagy probiotikus dúsított élelmiszerekként, valamint élelmiszer-tartósítószerként [27].

Anyagok és metódusok

Minták a LAB izolálásához

A LAB nyers tejből, túróból, paradicsomból és dosa tésztából történő izolálására szolgáló mintákat környezeti hőmérsékleten (32 ° C ± 2) hagytuk fermentálni.

Táptalaj és reagensek

Az izolálást és a LAB tenyésztését a De Man Rogosa Sharpe (MRS) táptalaj felhasználásával végeztük az antibakteriális vizsgálat céljából, a patogén tenyészetet, nevezetesen az E. colit, a S. aureust, a P. aeruginosát és a B. cereust agyi szívinfúzióban növesztettük ( BHI) agar táptalaj. A tápanyag-agar (NA) táptalajt is alkalmaztuk az antibakteriális vizsgálathoz. A vizsgálatban használt reagensek, indikátorok, biokémiai vizsgálatokhoz szükséges szénszubsztrátok stb. Analitikai minőségűek voltak, és a Hi Media Chemicals Ltd.-től (Mumbai, India) szerezték be őket.

A LAB izolálása

A LAB izolálását a kiválasztott mintából mikrobiális öntött lemez módszerrel hajtottuk végre. A sóoldatban előállított minták megfelelő hígításait (0,85% NaCl) MRS táptalajba öntjük, a LAB izolálásához. A lemezeket ezután inkubáltuk 37 ° C ± 2 ° C hőmérsékleten 24-48 órán át. Azokat a gyarmatokat, amelyek morfológiájukban és fenotípusos megjelenésükben különböztek egymástól, agar ferdékben vettük fel és oltottuk be. A felszín alatti telepeket szúrásként oltottuk be.

A feltételezett LAB-fajtákat a megfelelő izoláló közegükkel tisztítottuk, lemezeken újracsíkoltuk, amíg csak egyetlen teleptípus volt jelen. Az így kapott különféle tiszta kultúrákat kolóniájuk morfológiájára jellemeztük, és Gram-festésnek vetettük alá. Csak Gram-pozitív, nem mozgó, rúd alakú baktériumokat választottunk ki a további kísérletekhez, amelyek MRS agar táptalajon a Lactobacillus fajokhoz hasonló fenotípusos karaktereket mutatnak (L. salivarius, L. delbrueckii subsp. Bulgaricus, L. fermentum és L. acidophilus). A tenyészeteket 4 ° C-on tároltuk és MRS agar ferde/szúrásokon tartottuk a további vizsgálatok céljából.

L. salivarius, L. bulgaricus, L. fermentum és L. acidophilus antibakteriális aktivitásának meghatározása

A minta szűrletének elkészítése

A kiválasztott LAB fajokat (L. salivarius, L. delbrueckii subsp. Bulgaricus, L. fermentum és L. acidophilus) ferde ről friss 250 ml-es MRS-táptalajra oltottuk és 37 ° C-on 48 órán át inkubáltuk. Mindegyik izolátum tenyészlevelét külön-külön 10 000xg-n (Sorvall szupergyors RC2-B) centrifugáltuk 30 percig. A felülúszót centrifugálás után összegyűjtöttük, és 0,2 μm steril fecskendőszűrőn (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, NJ) engedtük át. A bakteriocin termelésének igazolásához a sejttől mentes semleges felülúszó táptalajokat gyűjtöttük az antibakteriális vizsgálatokhoz kiválasztott étellel terjedő kórokozók ellen.

Média a kórokozók szaporodásához

Élelmiszer által hordozott kórokozók, nevezetesen az E. coli, az S. aureus, a P. aeruginosa és a B. cereus tiszta kultúráit ferdétől az agyi szív infúziós táptalajáig (BHIB) oltottuk. 24 órán át 37 ° C-on végzett inkubálás után a tenyészlevet centrifugáljuk, és a kapott pelletet 9 ml sóoldatban szuszpendáljuk. Ezt a szuszpenziót használtuk a patogén törzs tápanyag-agar lemezekre történő beoltására a minta szűrlet antibakteriális aktivitásának meghatározására.

Antibakteriális aktivitás teszt agar kút diffúziós módszerrel

Az agar kút diffúziós módszert alkalmaztuk a LAB izolátumok antibakteriális tulajdonságának meghatározására. A kórokozók (E. coli, S. aureus, P. aeruginosa és B. cereus) 24 órás tenyészetét BHIB-ben 37 ° C-on tenyésztettük sóoldatban. A indikátor törzs gyepét úgy készítették el, hogy a sejt szuszpenziót steril vattapamaccsal terítették a tápanyag agar lemezek felületére. A lemezeket hagytuk megszáradni, és steril, 5 mm átmérőjű parafa-furatot használtunk az egyenletes üregek kivágására az agarban. Mindegyik üregbe 60 ± 1 tenyészetmentes szűrletet töltöttünk, amelyet a LAB izolátumokból nyertünk. 48 órán át 37 ° C-on végzett inkubálás után a lemezeket megfigyeltük a kút körüli gátlási zónában (ZOI). Az eredményeket pozitívnak tekintettük, ha a ZOI átmérője (mm) nagyobb volt, mint 1 mm. A kísérletet három példányban hajtottuk végre, és az aktivitást a ZOI ± SD átmérőjeként adtuk meg.

A LAB izolátumok azonosítása

A potenciális izolátumok fajszintig történő azonosítását a Lactobacillus jellemzői alapján végeztük, amint azt Bergey szisztematikus bakteriológiai kézikönyvében [28] leírják, valamint egy leíró táblázatot, amelyet Nair és Surendran adott [29]. A tenyészeteket egy sor biokémiai tesztnek vetették alá, amely magában foglalta a különböző szénforrások fermentálását, sav- és gáztermelést glükózból, kataláz tesztet, különböző hőmérsékleteken (15 ° C, 45 ° C és mindkettő) történő növekedést és arginin hidrolízisét.

Eredmények és vita

Tejsavbaktériumok (LAB) izolálása nyerstejből, túróból, paradicsomból és dosa tésztából

A tejsavbaktériumokat (LAB) először nyers tejből, túróból, paradicsomból és dosa tésztából izolálták MRS agarra. Az összes kapott izolátumot morfológiailag a kapott izolátumok telepjellemzői, Gram reakciójuk és mikroszkópos vizsgálatuk jellemezte. Csak a Gract pozitív, nem mozgékony, rúd alakú baktériumokat választottuk ki a további kísérletekhez, amelyek fajspecifikus MRS agar táptalajokon (L. salivarius, L. delbrueckii subsp. Bulgaricus, L. fermentum és L. acidophilus) hasonlóak a Lactobacillus fajokhoz hasonló fenotípusos karakterekkel. (a közeg összetétele itt nincs megadva). A szelekció alapja az volt, hogy ezek az izolátumok valószínűleg a Lactobacillus nemzetséghez tartozhatnak, amelynek bizonyítottan probiotikus tulajdonságai vannak [30].

A kiválasztott LAB antibakteriális aktivitásának meghatározása agar kútdiffúziós módszerrel

Asztal 1: -A LAB fajok antibakteriális aktivitása a ZOI szempontjából agarkút-diffúziós módszerrel.