A terhesség alatti magas fehérjetartalmú étrend sertésmodellben befolyásolja az ontogenezis mentén az energiaérzékelő utak májgén expresszióját

Hovatartozás-kutatási egység Molekuláris Biológia, Leibniz Farm Animal Biology Institute (FBN), Dummerstorf, Németország

Társadalmi kutatási egység táplálkozási élettana, Leibniz Farm Animal Biology Institute (FBN), Dummerstorf, Németország

Hovatartozás-kutatócsoport Funkcionális genomika, Leibniz haszonállat-biológiai intézet (FBN), Dummerstorf, Németország

Hovatartozás-kutató egység Molekuláris Biológia, Leibniz Farm Animal Biology Institute (FBN), Dummerstorf, Németország

Michael Oster,
Eduard Murani,
Cornelia C. Metges,
Siriluck Ponsuksili,
Klaus Wimmers

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Oster M, Murani E, Metges CC, Ponsuksili S, Wimmers K (2011) A terhesség alatti magas fehérjetartalmú étrend sertésmodellben befolyásolja az ontogenezis mentén az energiaérzékelő utak májgén expresszióját. PLoS ONE 6 (7): e21691. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0021691

Szerkesztő: Vincent Laudet, Ecole Normale Supérieure de Lyon, Franciaország

Fogadott: 2010. december 6 .; Elfogadott: 2011. május 26 .; Közzétett: 2011. július 18

Finanszírozás: A tanulmány a FEPROeXPRESS (FUGATOplus (http://www.fugato-forschung.de/), FKZ 0315132A) projekt része, amelyet a német szövetségi oktatási és kutatási minisztérium finanszíroz. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Eredmények

A HP és az AP összehasonlítása szakaszon belül

A vízszintes nyilak számai a szomszédos ontogenetikai szakaszok között szignifikánsan szabályozott próbakészletek mennyiségét mutatják AP vagy HP utódokban, míg a kereszteződésekben lévő számok az AP és HP utódok szakaszai között általában szabályozott próbakészletek mennyiségét jelzik. A függőleges nyilak számai az AP és a HP utódok között azonos ontogenetikai stádiumban differenciáltan kifejezett szondakészletek száma (a négyzetek közötti nyilak mutatják az összehasonlítás irányát; kis nyilak felfelé = felfelé szabályozott, kicsi nyilak alulra = lefelé szabályozott szondakészletek).

A hosszanti ontogenetikai szabályozás különbségei a HP és AP utódok között

Az AP utódok szakaszai között felsorolt útvonalak (fehér dobozok) jelzik a megfelelő ontogenetikai fejlődést, amely a HP utódaiban (fekete dobozok) nem fordul elő a megfelelő fejlődési periódusban. A HP-szakaszok közötti utak jelzik azokat a folyamatokat és anyagcsere-szabályozásokat, amelyek a HP-utódokban fordulnak elő, az AP-utódokban azonban nem a megfelelő fejlődési periódusban. Az étrendtől és az ontogenetikus stádiumtól függő génszabályozásbeli különbségek a magzat programozását jelzik a fejlődési és anyagcserezavarok szempontjából (a négyzetek közötti nyilak mutatják az összehasonlítás irányát; kis nyilak felfelé = felfelé szabályozott, kicsi nyilak alul = lefelé szabályozott utak; mTOR, a rapamicin emlős célpontja; RAN, Ras-rokon nukleáris fehérje; IGF-1, inzulinszerű növekedési faktor; PPAR, peroxiszóma proliferátor receptor; AMPK, AMP-aktivált kináz).

Az utódok különböző fejlődési stádiumaiban az anyai terhességi étrend miatt szabályozott génekhez kapcsolódó TF-ek közül 40 megtalálható feleslegesen a 10 legfontosabb TF között, amelyeket a DiRE kiemelt a különböző összehasonlításokhoz. Csak maguk a HNF4A, DR1, STAT6 és TCF4 találtak eltérő szabályozásúnak az étrend és a stádium miatt.

Az összes példánként elemzett gén esetében a qRT-PCR megerősítette a differenciálszabályozás irányát, amelyet a mikroarray elemzéssel nyertünk. A qRT-PCR-rel validált gének 80% -ában a kezelési csoportok között szignifikáns expressziós különbségeket azonosítottunk az mRNS-szintekben mind a qRT-PCR, mind a microarray analízissel. A mikroarray és a qRT-PCR expressziós értékei közötti korrelációk 0,43 és 0,84 között mozogtak, és nagyon szignifikánsak voltak (3. táblázat). Ez azt sugallja, hogy a mikrosarka-adatok megbízhatóak.

Vita

Az adatok pillanatfelvételt nyújtanak a transzkriptómról, így nem világos, hogy a kísérleti csoportok között a pre- és perinatalis szakaszban megfigyelt transzkriptikus különbségek mennyiben következnek be krónikus hosszú távú hatásokból vagy az életben fellépő akut stimuláló eseményekből, például a születésből vagy az elválasztásból. Érdekes módon a 28 dpn utódok csökkenten mutatják a differenciálisan expresszált mRNS-eket az 1. stádiumú dpn-hez képest. Szintén ebben az időpontban a HP utódok adaptálhatják expressziós profiljaikat az elválasztási idő korai posztnatális táplálkozási körülményeihez. Azonban a differenciálisan expresszált próbakészletek száma ismét felnőtt korban nőtt. Modellünk azt jelzi, hogy a terhességi HP diéták rövid távon és hosszú távon is befolyásolták az expressziós profilokat a HP utódokban. A hatást a genom elköteleződése jellemzi, amely a génexpressziós mechanizmus krónikus és akut környezeti ingerekhez való különböző reakciókészségéhez és alkalmazkodóképességéhez vezet. A HP diéta miatt ezekben a folyamatokban számos energia érzékelése, előállítása és felhasználása fontos.

Oxidatív foszforiláció és mitokondriális anyagcsere útvonalak

Az intracelluláris anyagcsere jelzése

Az mTOR jelátvitel fontos tápanyag-érzékelő útként működik, amely transzláció szintjén ellenőrzi az emlős sejtek fehérjeszintézisét [46]. Az mTOR szignalizáció upstream jelátviteli eseményei magukban foglalják az aminosavak elérhetőségének, a hormonok bőségének, az AMP-nek és a növekedési faktoroknak a változását [47]. Így az mTOR jelátvitel részt vesz az egyes sejtek növekedésének, a növekedési teljesítmény és a fejlődési folyamatok szabályozásában [48], [49]. Az AP utódoknál az mTOR szignalizációjának növekedését figyelték meg a magzatból az újszülött stádiumba, a HP csoportban nem történt változás. Ez a HP utódok csökkent fehérjeszintézisének adódhat, és így hozzájárulhat a megfigyelt növekedési retardációhoz és megváltozott anyagcsere-státuszhoz, ahogy azt Inoki és mtsai javasolják. [50]. Ezenkívül az mTOR jelátvitel is részt vehet a kompenzációs növekedési folyamatokban. Ezért az mTOR jelzéssel kapcsolatos gének étrendfüggő diametrális szabályozása a fiatal és felnőtt sertések között sikeres kompenzációként értelmezhető a növekedési teljesítmény szempontjából. A kompenzációs folyamatok sikere a HP utódokban nyilvánvalóvá válik, hogy súlyuk a 94 dpc és 1 dpn szakaszban csökkent az AP csoporthoz képest, de hasonló a 188 dpn stádiumban.

A növekedési hormon szignál, egy másik anabolikus növekedési faktor szignál, szabályozza az anyagcsere folyamatokat, beleértve a fehérjeszintézist, és fontos szabályozó hatása van a fehérje, szénhidrát és lipid anyagcserére [59]. A növekedési hormon szignalizációval kapcsolatos átiratok mRNS szintje kétfázisú szabályozást mutatott a HP utódok kifejlődése során. Ezért a növekedési hormon szignalizációval összefüggő gének születéskor megfigyelt lefelé történő szabályozása, valamint a fiatalkorúak és felnőttek felé irányuló felfelé irányuló szabályozása megfelel a növekedés retardációjának a 94 dpc és 1 dpn stádiumokban, valamint a kompenzációs növekedésnek felnőttkorban.

A glükokortikoidok, a szteroid hormonok egyik fő alosztálya számos metabolikus, viselkedési, kardiovaszkuláris és immunfunkciót szabályoznak. Biológiai hatásukat a glükokortikoid receptor modulálja a downstream célgének egymás utáni közvetlen és közvetett kölcsönhatásával a génexpresszió modulálására. A glükokortikoid receptor jelátvitel befejezi a stressz reakciókat és mobilizálja az energiaforrásokat erre a célra. Kimutatták, hogy a glükokortikoid receptor szignalizációval összefüggő gének mRNS-expressziója az anya terhességi fehérje-étrendjétől függ [2], [60], [61]. A glükokortikoid receptor szignalizáció kétfázisú szabályozása a HP prenatális, perinatalis és fiatalkori utódaiban aláhúzza a feltételezett megnövekedett stresszreakciót a HP utódoknál születéskor, amely kumulálódhat a mitokondriális aktivitás megfigyelt zavaraiban. Ezenkívül a glükokortikoid receptor szignalizációjának étrendfüggő szabályozása a fiatalkorú és a felnőtt stádium között, és az ebből eredő fokozott glükokortikoid receptor szignalizáció a HP utódok 188 dpn stádiumában arra utal, hogy a HP utódok egyfajta riasztási (aktivált védelmi) állapotban voltak felnőtt stádiumban.

A sejtek fenntartása és szaporodása

Sejtkarbantartás és szaporodás A RAN, a kis GTPázok Ras családjának tagja, a mitózis pozitív kulcsszabályozója [62], és kritikus szerepet játszik több sejtfunkcióban, ideértve a nukleocitoplazmatikus transzportot, a sejtburok összeállítását és az orsó kialakulását a sejtciklus alatt [63]. Ezért a RAN jelátvitel részt vesz a sejtek növekedési és fejlődési folyamataiban. Az étrend és a RAN szignalizáció stádiumfüggő expressziója részben diametrálisan szabályozott az ontogenetikai fejlődés mentén (a 94 dpc vs. 1 dpn és az 1. dpn stádium között), ami a különböző prenatális állapotokhoz való alkalmazkodást jelenti. A RAN szignalizációban részt vevő gének szabályozásának majdnem hasonló irányát találták a fiatalkorúak és a felnőttek szakaszában (28 dpn vs. 188 dpn stádium között és 188 dpn stádium között), ami kompenzációs folyamatokat jelenthet.

A purin és a pirimidin metabolizmusának útvonala számos folyamathoz kapcsolódik, ideértve a nukleotidok bioszintézisét, lebomlását és megmentését. A purin és a pirimidin metabolizmusával összefüggő gének lefelé irányuló szabályozása valószínűleg a 188 dpn stádiumban csökken a sejtek forgalmában, szemben a HP utódok 28. dpn stádiumával. A GADD45B, egy gén, amelynek transzkripciója számos környezeti és fiziológiai stressztényező hatására indukálódik, részt vesz a DNS-helyreállításban, az apoptózisban, a sejtek túlélésében és a növekedés leállításában [64]. A GADD45B mRNS-expressziója megnőtt a HP utódokban a 188 dpn stádiumban, ami a sejtek túlélésének metabolikus prioritására és a felnőttkori stádiumban véget ért kompenzációs növekedési teljesítményre utal.

A valin, a leucin és az izoleucin nélkülözhetetlen elágazó láncú aminosavak. Mindhárom aminosav katabolizmusa ugyanazon enzimekkel rendelkezik az első lépések során, ideértve a transzaminálást és a dekarboxilezést is. Végeredményként három különböző CoA-származékot állítanak elő, amelyek a szteroidok vagy keton testek szintézisére és a citrát ciklusra irányulhatnak. A valin, a leucin és az izoleucin lebomlásával járó gének lefelé történő szabályozása HP utódokban az 1 dpn és a 28 dpn szakaszban nagyobb lehet ezen aminosavak iránti igény, mint AP utódoknál. A HP utódok azonban az elválasztás utáni fejlődés során fokozták a valin, a leucin és az izoleucin lebomlásában szerepet játszó gének expresszióját, ami változatlan expressziós szintet eredményezett az étrendi csoportok között a 188 dpn stádiumban.

Következtetés

A terhességi HP diéták a prenatalis és postnatalis szakaszban befolyásolták a máj expressziós profilját. A hatások magukban foglalják a genom elfogultságát, ami az energia- és tápanyag-érzékelési utak megváltozott reakciókészségéhez vezet. A genomok programozása nyilvánvalóan indokolja az alkalmazkodást és a kompenzációs növekedést, de valószínűleg a felnőttkori anyagcserezavarokra való hajlam rovására. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez a sertésmodell alkalmazható egy kísérletben, ahol a különböző terhességi étrenddel táplált kocák utódai a különböző posztnatalis szakaszokban is különböző táplálkozási kihívásokkal szemben kifogásolhatók.

Anyagok és metódusok

Állatok és mintagyűjtemény

RNS izolálás, cél előkészítés és hibridizáció

A gyártó protokollja szerint az egyes májmintákból származó teljes RNS-t Tri-Reagens (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Németország) alkalmazásával izoláltuk. A DNase-kezelés után oszlopon alapuló tisztítást végeztek az RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Németország) alkalmazásával. Az RNS mintákat 1% -os etidium-bromidot tartalmazó agaróz géleken tettük láthatóvá, hogy ellenőrizzük az RNS integritását. Az RNS-t spektrometriával számszerűsítettük NanoDrop ND-1000 spektrofotométerrel (PEQLAB, Erlangen, Németország). A DNS-szennyeződés hiányának biztosítására az izolált RNS-ben PCR-amplifikációt végeztünk a sertés gliceraldehid-3- foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) génnel (Forward primer: AAGCAGGGATGATGTTCTGG; Reverse primer: ATGCCTCCTGTACCACCAAC). Az összes RNS-mintát a későbbi elemzésig tároltuk. A mikroarray kísérletekhez az egyes biotinnal jelölt cRNS-eket a Gene Chip 3 Express Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) szintetizálta. A cRNS-t fragmentáltuk () és hibridizáltuk Affymetrix GeneChip sertés Genom Array-n. Festés és mosási lépések után a tömböket letapogatták (Affymetrix, Santa Clara, Kalifornia, USA).

Adatelemzés

Útelemzés

A mikroszkópos eredményekből származó génlistákat beküldték az „Ingenuity Pathways Analysis” manuálisan kurált adatbázisba, hogy tisztázzák a sertésmájban megváltozott génexpresszióval járó feltételezett útvonalakat. A hangsúly azokon a kanonikus utakon volt, amelyek legalább egyszer felmerültek a tíz szabályozott útvonalon belül egyetlen elemzésen belül. Itt kell megjegyezni, hogy a hálózatokban bemutatott interakciók nem specifikusak a sertés májszövetére, mivel az adatbázis számos különböző kutatási terület irodalmát tartalmazza. A DiRE nevű webszervert (távoli szabályozási elemek előrejelzéséhez; hozzáférés a http://dire.dcode.org címen; [69]) használták az étrendfüggő szabályozott gének közös transzkripciós faktor-kötőhelyeinek (TFBS) meghatározására.