A terhességi cukorbetegség inzulinterápiája nem védi meg teljesen az utódokat az étrend okozta anyagcserezavaroktól

H.Z. és B.C. hozzájárult ehhez a tanulmányhoz.

Absztrakt

A terhességi cukorbetegség (GDM) a későbbi életben az utódok metabolikus rendellenességeinek fokozott kockázatával jár. Bár egyre növekvő bizonyítékok arra utalnak, hogy a GDM terápiája javíthatja az újszülöttek egészségét, nem ismert, hogy a terápia hosszú távú metabolikus előnyökkel jár-e az utódoknak későbbi felnőtt életükben. Itt, a terhesség második felében a cukorbetegség egérmodelljének felhasználásával az emberi GDM utánzására azt találtuk, hogy a GDM hatékony inzulinterápiája jelentős védelmet nyújt a normál chow-étrendet tápláló utódok glükóz-intoleranciája és elhízása ellen. A terápia azonban nem képes megvédeni az utódokat, ha magas zsírtartalmú étrenddel küzdenek, különösen a hím utódok esetében. A hím utódok hasnyálmirigy-szigeteinek genomszintű DNS-metilációs profilja számos inzulin szekréciót szabályozó génben azonosított hipermetilezett régiókat, köztük az Abcc8, Cav1.2 és Cav2.3, amelyek KATP vagy Ca 2+ csatornákat kódolnak, amelyek csökkent gén expresszióval társulnak és károsodott inzulinszekréció. Ez a megállapítás metiláció által közvetített epigenetikus mechanizmust sugall a GDM által kiváltott generációk közötti glükóz intolerancia esetén. Kiemeli, hogy a GDM hatékony inzulinterápiája sem elegendő a felnőtt utódok teljes védelméhez az étrend okozta anyagcserezavaroktól.

Bevezetés

A terhesség alatt először diagnosztizált glükóz intoleranciaként definiált terhességi cukorbetegség (GDM) a világon a terhességek akár 15% -át is érinti (1). A GDM nemcsak a magzati fejlődés során, például a halva születés, a viszceromegalia és a makrosomia miatt, hanem a későbbi életszakaszban is káros következményekkel jár (2,3). A felhalmozódó bizonyítékok azt sugallják, hogy a GDM az anyák elhízásától és genetikai hátterétől függetlenül hajlamosítja az utódokat a későbbi életkorban bekövetkező anyagcserezavarokra, például elhízásra, csökkent glükóz toleranciára és cukorbetegségre (4–6). A GDM utódok longitudinális vizsgálata azt mutatja, hogy az anyai glükózszint erős előrejelzője a megváltozott szénhidrát-anyagcserének gyermekkorban, amely felnőttkorra is kiterjeszthető (7,8).

A GDM terápiás kezelése kritikus fontosságú e komplikációk minimalizálása érdekében. A glikémiás kontroll a GDM kezelésének sarokköve (9). Véletlenszerű vizsgálatok megerősítették, hogy a GDM terápiája azonnali előnyökkel jár, mint például a perinatális szövődmények csökkentése és a makrosomia előfordulása (10, 11). Mindazonáltal nem világos, hogy a GDM terápiája hosszú távú anyagcsere-előnyöket nyújt-e az utódoknak (12,13). Fontos, hogy a GDM-terápia hatásainak értékeléséhez a megfelelő utódkövetési időszak még vitatható. A legtöbb utóvizsgálatba beiratkozott utódok még pubertás korúak voltak (5–10 évesek), de a GDM hosszú távú hatása az utódok anyagcserezavaraira vagy terápiás úton történő csökkentésére csak kamaszkorban vagy felnőttkorban lehet nyilvánvaló (12,14).

Ezenkívül az utódnemzésnek is mély hatása van. A méhen belüli sértésre adott válaszban a szexuális dimorfizmus egyenlőtlen betegség-fogékonyságot mutat: bár mindkét nem érintett lehet, az egyik érzékenyebb (15). Anyagcsere-különbségek vannak a férfi és a női magzatok között (15), és az anyai hiperglikémia iránti eltérő érzékenység későbbi életszakaszban nemspecifikus betegségkockázatokat eredményezhet (6,16). Az epidemiológiai vizsgálatokból származó bizonyítékok azt mutatják, hogy a terápia GDM-re gyakorolt hatása a csecsemő- és gyermekkorban is különbözik a magzati nemtől (11,16). Ezért a magzati szex befolyásolhatja azt a hatást, amelyet a GDM terápiája gyakorol az utódok hosszú távú egészségére. Sőt, társadalmi és környezeti tényezők is megzavarhatják a nyomon követési eredményeket. Így továbbra sem tudni, hogy a GDM terápiája módosítható-e az utódok anyagcserezavarainak kockázati tényezője.

Mechanikailag az epigenetikus módosítások, például a DNS-metiláció, a hiszton-módosítás és a nem kódoló RNS-ek, elfogadható kapcsolatot biztosítanak a fejlődés korai szakaszában fellépő környezeti expozíció és a későbbi életben a betegségekre való hajlam között (17). A DNS-metiláció, a legjobban vizsgált epigenetikai módosítás, megváltoztathatja a génexpresszió állapotát, és mitotikusan öröklődik a szomatikus sejtekben (17, 18), amely potenciális mechanizmust biztosít, amely révén az epigenomra gyakorolt környezeti hatások hosszú távon hatással lehetnek a génexpresszióra. . Állat- és emberkutatások eredményei alátámasztják, hogy az intrauterin hiperglikémia megváltozott magzati DNS-metilációs mintákat és későbbi változásokat okozhat a betegség kialakulásának kockázatában (6,19). Epidemiológiai és kísérleti vizsgálatokban a glikémiás kontroll javította az újszülöttek GDM kimenetelét. Ugyanakkor egyetlen tanulmány sem vizsgálta, hogy ezek a pozitív hatások együtt jártak-e a DNS-metiláció kedvező helyreállításával (20), ami kritikus fontosságú lehet a későbbi életben a betegségekre való hajlam szempontjából. Így továbbra is megkérdőjelezhető annak lehetősége, hogy a magzati metabolikus programozás a GDM-ben hosszú távon hatással lehet az egészségre, amelyet a GDM terápiája módosíthat.

Mivel a zavaró tényezők kizárása és az emberek mögöttes mechanizmusainak elemzése nehéz, a terhesség második felében létrehoztuk a cukorbetegség egérmodelljét, hogy a terhesség harmadik trimeszterében magas gyakorisággal utánozzuk az emberi GDM-t (21). Az anyai hiperglikémiát inzulinnal kezeltük, és utódoknál értékeltük a hasnyálmirigy-szigetecske β-sejt funkcióját. Arra is kitértünk, hogy a felnőttkori életmódbeli tényezők, például a magas zsírtartalmú étrend (HFD) növelhetik-e az anyagcserezavarok kialakulásának kockázatát az utódokban. Végül genomszintű DNS-metilációs szekvenálást végeztünk az utódok hasnyálmirigy-szigetein, és értékeltük a jelölt gének azon változásait, amelyek hozzájárulhatnak az utódok metabolikus fenotípusaihoz.

Kutatási tervezés és módszerek

Állatgondozás

A Zhejiang Egyetem Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága jóváhagyta az összes állati protokollt. Minden kísérletet a Rákkutató Intézet (ICR) egereivel (22) végeztünk, amelyeket a Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.-tól (Shanghai, Kína) vásároltunk. A szűz ICR nőstényeket (életkor, 6–8 hét; súly, 26–28 g) normál ICR hímekkel pározták. A terhességet hüvelyi dugó jelenlétével dátumozták (0.5. Nap). A terhes nőstényeket véletlenszerűen a kontroll (Ctrl), a GDM vagy a GDM + inzulinkezelés (INS) csoportokba sorolták. A terhesség 6. és 12. napján a GDM és INS anyákat 8 órán át éheztettük, és streptozotocin (STZ) injekciót kaptunk (100 mg/kg ip) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (23,24). 1A). A kontroll vemhes egerek azonos térfogatú citrátpuffert kaptak. A vércukorszintet a farokvénán keresztül mértük a második STZ injekció után 48–72 órával, és a cukorbetegséget 14 és 19 mmol/l közötti vércukorszintként határoztuk meg (6).

Kísérleti tervezés, utódnövekedési görbék és glükóz tolerancia. V: Kísérleti tervezés. B: Az anya vércukorszintje terhesség alatt (n = 6 egér csoportonként). C: Szülés utáni növekedési görbék hím utódoknál (nCtrl-F1_NCD = 8, nINS-F1_NCD = 10, nGDM-F1_NCD = 10, nCtrl-F1_HFD = 8, nINS-F1_HFD = 8, nGDM-F1_HFD = 10). AUC, a görbe alatti terület; más néven önkényes egységek. D: Szülés utáni növekedési görbék női utódoknál (nCtrl-F1_NCD = 7, nINS-F1_NCD = 7, nGDM-F1_NCD = 8, nCtrl-F1_HFD = 6, nINS-F1_HFD = 9, nGDM-F1_HFD = 7). E: 20 hetes F1 hím utódok glükóz tolerancia tesztje és AUC értéke (nCtrl-F1_NCD = 6, nINS-F1_NCD = 7, nGDM-F1_NCD = 7, nCtrl-F1_HFD = 6, nINS-F1_HFD = 7, nGDM-F1_H = 6). F: 20 hetes F1 nőstény utódok glükóztűrési tesztje és AUC-értéke (nCtrl-F1_NCD = 5, nINS-F1_NCD = 5, nGDM-F1_NCD = 6, nCtrl-F1_HFD = 5, nINS-F1_HFD = 6, nGDM-F1_H = 6). G: ITT 20 hetes F1 hím utódokban (nCtrl-F1_NCD = 6, nINS-F1_NCD = 8, nGDM-F1_NCD = 6, nCtrl-F1_HFD = 8, nINS-F1_HFD = 9, nGDM-F1_HFD = 10). H: ITT 20 hetes F1 nőstény utódokban (nCtrl-F1_NCD = 5, nINS-F1_NCD = 6, nGDM-F1_NCD = 5, nCtrl-F1_HFD = 6, nINS-F1_HFD = 7, nGDM-F1_HFD = 8). Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. * P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

Metabolikus paraméterek az F1 utódokban

Az inzulinterápia által közvetített védelmet a glükóz intolerancia ellen utódokban megszüntette a felnőttkori HFD-expozíció

A GDM inzulinterápiája a glükóz intolerancia egyértelmű megmentését eredményezte az INS-F1 hím utódokban, az injekció beadása után 60 perccel csak a glükózszint növekedése következett be (1E. Ábra). De meglepő módon a HFD megszüntette ezt a védelmet (1E. Ábra). Az ITT eredményei azt mutatták, hogy csak a GDM-F1 hím egereknél mutatkozott szignifikánsan csökkent inzulinérzékenység az öregedéssel az NCD csoportban (2B. És 1G. Ábra). A HFD-vel való kihívás során azonban nemcsak a GDM-F1 hímeknél sokkal súlyosabb inzulin intolerancia alakult ki, hanem az INS-F1 hímeknél az inzulin tolerancia kifejezett romlása is megfigyelhető volt a kontrollokhoz képest (1G ábra). Nőstény utódokban csak a GDM-F1 nőstények mutatták a glükózszint emelkedését az inzulininjekció után 30 és 120 perccel (1H ábra).

Az inzulin szekréció hibái szintén hozzájárulhatnak a glükóz intoleranciához. Értékeltük a glükózstimulált inzulin szekréciót (GSIS) in vivo és in vitro. In vivo a GSIS mind a hím, mind a nőstény GDM-F1 utódokban csökkent (2A – D. Ábra). Az INS-F1 csoportban csak a férfiaknál mutatkozott alacsonyabb inzulinszint a glükózinjekcióra reagálva (2A. És B. Ábra). In vitro az inzulin szekréciós válasz az 5,6 mmol/l glükózra minden csoportban hasonló volt (2E. És F ábra); a GDM-F1 hímek vagy nőstények szigetei azonban csökkent inzulin szekréciót mutattak, amikor 16,7 mmol/l glükóznak voltak kitéve (2E és F ábra). Az INS-F1 hímeknél szintén észlelték a magas glükózszintre (16,7 mmol/l) adott inzulinhiányt (2E. Ábra). Nem találtak szignifikáns különbséget az INS-F1 nőstényeknél a glükóz toleranciában, az inzulinérzékenységben vagy a GSIS-ben (1F. És H. Ábra és 2C., D. És F. Ábra).

DNS-metilációs minták hím utódok hasnyálmirigy-szigetein. V: A Ctrl-F1 (C) és a GDM-F1 (G), a Ctrl-F1 (C) és az INS-F1 (I) közötti differenciálisan metilezett régiók hőtérképe. B: Differenciálisan metilált csúcsok megoszlása a genomban G vs. C és I vs. C. C: A hipermetilezett gének Venn-diagramja átfedésben G és C és I és C között. D: A hipometilezett gének Venn-diagramja átfedésben G között vs. C és I vs. C. E: A 2-es típusú cukorbetegséghez kapcsolódó differenciálisan metilezett gének KEGG-elemzése.

A KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) elemzés kimutatta, hogy a GDM-F1 és az INS-F1 differenciálisan metilezett génjei főként a sziget-β-sejt ioncsatornáit kódolták, és részt vesznek az inzulin szekréciójában. Ezek az érvényesítésre kiválasztott gének az Abcc8 voltak (az 1-es szulfonilurea-receptort kódoló Sur1, a transzporterek ATP-kötő kazettás szupercsaládjához tartozott), Cacna1c (Cav1.2, az L-típusú Ca 2+ csatornák egyik alegységét kódolva, széles körű expresszióval egérben, patkányban) és humán szigetek β-sejtjei), a Cacna1e (Cav2.3, az R-típusú Ca 2+ csatornát kódolja, rágcsálókban és az emberben expresszálódik), és a Cacna1g (Cav3.1, a T-típusú Ca 2+ áramot kódolja és főleg expresszálódik). NOD egérben, patkányban és emberben) (3E. ábra). A MeDIP-seq adatok azt mutatták, hogy ezek a jelölt gének hipermetilációs státuszt mutattak a GDM és az INS utód szigeteken a kontrollokhoz képest.

A GDM inzulinkezelése nem állította helyre az ioncsatornák megváltozott expresszióját és a hibás inzulinszekréciót az utódok hasnyálmirigy-szigetein.

Az Abcc8, a Cav1.2 és a Cav2.3 mRNS és fehérje szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a GDM-F1 és az INS-F1 hímeknél (4A – G. Ábra). Ezenkívül a HFD-expozíció minden csoportban csökkentette a Cav1.2 expressziót, de a GDM-F1 és INS-F1 hímeknél a Cav1.2 expressziója drámai mértékben csökkent a HFD táplálás után (4B, D és F ábra). A génexpresszió hasonló változását a GDM-F1 nőstényeknél is megfigyelték (3A – C. Kiegészítő ábra). Az INS-F1 nőstényekben azonban csak a Cav2.3 mutatott csökkent expressziót (3C. Kiegészítő ábra). Nem volt szignifikáns különbség a Cav3.1 expresszióban a csoportok között (az adatokat nem mutatjuk be).

A GDM inzulinkezelése nem fordította meg a megváltozott DNS-metilációs státust az utódok hasnyálmirigy-szigeteiben az Abcc8, Cav1.2 és Cav2.3

20 hetes utódok hasnyálmirigy-szigeteit izoláltuk, és piroszekvenálást használtunk az Abcc8 promoter 10 citozin-foszfát-guanin (CpGs), a Cav 1.2 promoter CpG-i és a Cav 2.3 promoter 11 CpG metilációs állapotának elemzésére. Az Abcc8, Cav1.2 és Cav2.3 CpG-i szignifikánsan magasabb DNS-metilációs státuszt mutattak a GDM-F1 és INS-F1 hím szigetein (5A – C. Ábra). A GDM-F1 hímekkel összehasonlítva a Cav1.2 és a Cav2.3 DNS-metilációs állapota az INS-F1 hímeknél eltérő mértékben javult (5B. És C. Ábra). Megállapítottuk továbbá, hogy a GDM-kezelés hatása a DNS-metilációra a három célgénben, nemre jellemző különbséggel (5. ábra és 3. kiegészítő ábra). Nevezetesen az anyai glikémiás kontroll a DNS metilációs szintjének egyértelmű helyreállításával társult az INS-F1 nőstényekben az Abcc8 és a Cav1.2 szinteken (3D és E kiegészítő ábra) és a Cav2.3 promoter régiókban mérsékelt hipermetilezett szinttel (3F kiegészítő ábra). ). Ezenkívül a HFD-táplálás szignifikánsan magasabb DNS-metilált szintet okozott a Cav1.2 promóter régiókban a GDM és az INS utódokban (4B. Ábra és kiegészítő 3E. Ábra), de a HFD DNS-metilációra gyakorolt hatását az Abcc8 és a Cav2 nem mutatta ki. .3.

A magzati szigetek in vitro kísérleteznek. V: A kísérleti tervezés sematikus ábrázolása. B: A magzati szigeteket ex vivo egy éjszakán át tenyésztettük, és az inzulin immunfluoreszcenciás detektálásával azonosítottuk. Fekete skála, 200 μm; fehér skála oszlopok, 50 μm. C – E: A célgének, a DNS-metil-transzferáz-gének és a demetil-transzferáz-gének expressziós szintje a magzati szigeteken (n = 3 replikátum csoportonként és három független izoláció). F – H: Abcc8, Cav1.2 és Cav2.3 metilációs állapota jelzett glükózt tartalmazó táptalajban tenyésztett magzati szigeteken (n = 3 ismétlés csoportonként és két független izoláció). Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. * Az inzulin szekréciót közvetítő P 2+ csatornákat figyeltek meg. A nőstény utódok azonban csak magasabb DNS-metilációt és alacsonyabb Cav2.3-expressziót mutattak, ami arra utal, hogy legalább a három célgén promóter régiójában a férfi magzat epigenetikai módosítása érzékenyebb lehet az intrauterin hiperglikémiára, mint a nőstény magzat.

Továbbá az in vitro tenyészet megerősítette a rövid, magas glükózszintű expozíció hatását az Abcc8, Cav1.2 és Cav2.3 génexpresszióra és a DNS-metilációra a magzati szigeteken. Állatmodellünk az in vitro tenyésztéssel együtt bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a korai fejlődés érzékeny az extrinsic tényezőkre (41), és hogy az intrauterin hyperglykaemia rövid expozíciója elegendő ahhoz, hogy tartósan befolyásolja az ioncsatorna gén expresszióját és a DNS metilációját. Bár kísérleti eredményeink közvetlen átadása az emberi helyzetre óvatosságot igényel, fontos felismerni, hogy a tünetektől való mentesség az egyik legnagyobb nehézség a GDM esetében, és a terhes nő általában nincs tudatában annak, hogy van GDM-je, amíg a rutin előtti szülés előtt diagnosztizálják. szűrés (42), ami arra utal, hogy a magzat már ki van téve a kedvezőtlen intrauterin környezetnek, és adaptív változásokat mutat az epigenómában (43).

Ezenkívül az in vitro kísérlet kimutatta, hogy a DNS metilíró és metiltörölõ enzimek megváltozott génexpressziója a következõ normál glükóz tenyésztés során is fennmaradt, jelezve, hogy a hiperglikémia által kiváltott egyéb káros tényezõk is hozzájárulhatnak a tartós epigenetikai változásokhoz. Az anyai glükóz szabadon áthatja a placentát, és a glükóz-kirándulások nemcsak magzati hiperglikémiát okoznak, hanem magzati hiperinsulinémiát és oxidatív stresszt is kiváltanak (44,45). Bár a GDM inzulinkezelése normalizálta az anya vércukorszintjét, nem ismert, hogy az inzulinintervenció megfordított-e más káros tényezőket. Ha nem, akkor ezek a tényezők továbbra is befolyásolhatják a magzat fejlődését és az epigenetikai módosításokat (45).

A posztnatális környezet állapotai szintén fontos jelek a felnőttkori anyagcsere-betegségek kiváltásában (46). Vizsgálatunkban a HFD expozíció súlyosbította a glükóz intoleranciát. De fontos, hogy ez a HFD által kiváltott prediabetikus állapot a GDM utódokban, akár inzulinkezeléssel, akár nem, súlyosabb volt, mint a kontroll utódoknál megfigyelhető, ami arra utal, hogy a korai magzati sértés ronthatja a HFD-hez való alkalmazkodás képességét. A külső tényezők postnatálisan is befolyásolhatják az epigenomot (46–48). Állandóan azt tapasztaltuk, hogy a HFD a Cav1.2 magasabb DNS-metilációs szintjét okozta. A kontroll utódokhoz képest azonban a pre- és postnatalis tényezők szinergikusan hatnak, hogy a GDM inzulinkezelésével az utódokban szignifikánsan hipermetilezett Cav1.2-szintet indukáljanak, ami részben hozzájárulhat a HFD-expozíció utáni fokozott glükóz-intoleranciához.

Egy további tényező, amely valószínűleg felelős a fokozott glükóz intoleranciaért, az inzulinrezisztencia. A hiányos inzulinszekréció és -hatás a cukorbetegség két fő eredménye (49,50). Nevezetesen, még a GDM inzulinterápiája mellett is kialakult az inzulinrezisztencia, amikor az utódokat felnőttkorban HFD-vel fertőzték. Bár a mögöttes mechanizmusok még mindig nem ismertek, érdekes megjegyezni, hogy ezek az utódok a HFD csoportban jelentős elhízott fenotípusokat mutattak, ami arra utal, hogy az inzulinrezisztencia összefüggésbe hozható a túlsúlyos és a lipid anyagcsere rendellenességeivel.

Cikk információk

Finanszírozás. Ezt a munkát a Nemzeti Kulcsfontosságú Kutatási és Fejlesztési Terv támogatásának speciális alapja (2017YFC1001300 sz.), A Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (31671569, 81490742, 31471405 és 31571556) támogatta, Önkormányzati humánerőforrás-fejlesztési program kiemelkedő fiatal tehetségek számára az orvostudomány és az egészségtudomány területén Sanghajban (2017YQ047 sz.), Valamint a Központi Egyetemek Alapkutatási Alapjai.

Érdeklődési kettősség. A cikk szempontjából lényeges összeférhetetlenségről nem számoltak be.