A féregféregellenes tevékenység ford-fahéjaldehid, valamint a fahéjból származó A- és B-típusú proantocianidinek (Cinnamomum verum)

Tárgyak

Absztrakt

Bevezetés

A gyomor-bél traktus parazita férgei (helminták) globális jelentőségű kórokozók. A helminták az egész világon az állattenyésztésben jelentős termelési korlátot jelentenek; a fertőzések alacsonyabb növekedési rátát és csökkenő kérődzők és sertések 1,2,3-es tej- és hústermelését, valamint súlyosbítják a másodlagos bakteriális fertőzéseket4, ami az élelmezésbiztonság és a gazdasági fejlődés csökkenéséhez vezet. A becslések szerint ráadásul több mint egymilliárd ember - főként a fejlődő országokban - fertőzött talaj által terjedő helmintákkal, ami jelentős morbiditást okoz 5 .

Jelenleg nem állnak rendelkezésre oltások, ezért a helmintek elleni védekezés szinte kizárólag a szintetikus féreghajtó szerekkel végzett tömeges kezelésen alapul. Ez a korlátozott számú kémiai vegyületre való túlzott támaszkodás végül nem fenntartható 6. Az anthelmintikumokkal szembeni ellenálló képesség széles körben elterjedt az állattenyésztési rendszerekben, különösen a kis kérődzőknél, ahol elérte a kritikus szintet 7, de a szarvasmarhák 8 és a 9 sertés paraziták között is észlelték, és folyamatos aggodalmak vannak az embereken történő tömeges gyógyszeradagolás fenntarthatóságával kapcsolatban. 10. Ezenkívül egyre nagyobb a fogyasztói kereslet az organikusan vagy minimálisan szintetikus vegyi anyagokkal előállított állati termékek iránt. Ezért sürgősen meg kell vizsgálni a helmint elleni védekezés újszerű megközelítéseit.

Számos növény gazdag bioaktív vegyületek forrása, amelyek antimikrobiális és parazitaellenes hatást fejthetnek ki, beleértve az illóolajokat és a másodlagos metabolitokat is. A parazitaellenes vegyületek előfordulása a növényekben lehetővé teszi a vegyületek célzott azonosítását a gyógyszer felfedezéséhez, valamint a növények táplálékként történő alkalmazását. Ily módon vagy teljes növényi anyag, vagy kivonatok kerülnek az étrendbe, ami alternatív vagy kiegészítő megközelítést jelent a parazita elleni védekezéshez, különösen az állatállományban 12. Ennek a megközelítésnek számos előnye van, például a mezőgazdasági termékekben előforduló gyógyszermaradványok elkerülése, a paraziták alacsonyabb kockázata a rezisztencia kialakulásában és a könnyű beilleszkedés az erőforrásokkal korlátozott közösségekbe a fejlődő világban, ha és ahol a növények helyben elérhetőek 13 .

Példák A-típusú és B-típusú procianidin-dimerre.

Eredmények

A fahéj kéreg kivonat erőteljes aktivitással rendelkezik Ascaris suum in vitro

Annak tesztelésére, hogy a fahéj kérge tartalmaz-e féreghajtó hatású vegyületeket, elkészítettünk egy kivonatot egy olyan eljárás alkalmazásával, amelyről korábban bebizonyosodott, hogy hatékony a polifenolos vegyületek extrakciójában sokféle növényi forrásból 22. A kapott kivonatot ezután teszteltük in vitro lárvák elleni aktivitás Ascaris suum, a sertések fontos fonálféreg-parazitája, amely a szorosan rokon emberi parazita modelljeként is szolgál A. lumbricoides 23 .

Először migrációs gátlási vizsgálatot alkalmaztunk a harmadik stádiumú lárvák (L3) elleni aktivitás tesztelésére, amely a parazita azon fázisa, amely az embrionált petesejtekből kerül ki a gazdaszervezet megfertőzésére. Feltűnő, hogy az L3 éjszakai inkubálása a fahéj kivonatban 125 és 1000 μg/ml közötti koncentrációban a lárvák vándorlásának 100% -os gátlását eredményezte (2A. Ábra). Ezzel szemben korábban azt figyeltük meg, hogy számos más bioaktív növényi forrásból készített kivonatok kevésbé hatásos, dózisfüggő migrációs gátlást váltottak ki a kivonatok koncentrációinak vizsgált tartományában 22. A lárvák utólagos megfigyelése a fahéjkivonatban történő inkubálás során azt mutatta, hogy ≥250 μg/ml koncentrációnál az összes lárva az inkubációt követő két-három órán belül elpusztult. Megerősítettük a fahéjkivonat hatékonyságát egy második kísérletben, amelynek negyedik szakaszának lárváit (L4) használtuk A. suum a sertések béléből kísérleti fertőzés után felépült, és a lárvák pusztulását ismételték néhány órán belül in vitro inkubáció (2B ábra).

A fahéj kéreg kivonat féreghajtó hatása ellen Ascaris suum.

(a) Gátlása A. suum harmadik fázisú lárvák vándorlása fahéj kéreg kivonatban történő inkubálás után. A gátlást csak a táptalajban inkubált lárvákhoz viszonyítva fejezzük ki. Az eredmények három független kísérlet átlagát jelentik, mindegyiket három példányban hajtják végre. (b) Gátlása A. suum negyedik stádiumú lárvamotilitás a fahéj kéreg kivonatban történő inkubálás után. Az eredmények egyetlen kísérletből származnak, három példányban.

A fahéj kéreg kivonat fitokémiai elemzése

A feltételezett féreghajtó vegyületek azonosításához az extraktumot LC-MS-sel elemeztük. A fő vegyület a CA volt, amely 7,8 g/100 g extraktumot tett ki (3A. Ábra). Ezenkívül fahéjsavat és számos A-típusú kötéssel rendelkező PAC dimert és trimert detektáltak LC-MS-vel (3A. Ábra). A PAC-összetétel további betekintése érdekében az extraktumot benzil-merkaptánnal tiolízisnek vetjük alá, amely a PAC-polimereket B-típusú kötésekkel megszakítja, és lehetővé teszi 24,25-ös flavan-3-ol-egységeik számszerűsítését. Ez feltárta, hogy ezek a fahéj PAC procianidinek voltak, amelyek katechinből és epikatechinből, mint terminális és hosszabbító egységekből álltak (3B. Ábra; 1. táblázat). A flavan-3-ol alegységek számított arányát az S1-2. Táblázat mutatja. Ezen információk alapján mind a PAC összmennyisége, mind az átlagos polimerizációs fok (mDP - azaz a polimerek átlagos hossza) kiszámítható. Ebből kiderült, hogy az extraktum 24,2 g PAC/100 g extraktumot tartalmazott, az mDP pedig 5,2 volt. Ezenkívül az inter-flavanol kapcsolatok elemzése azt mutatta, hogy 21% A típusú és 79% B típusú kötés volt (1. táblázat).

Fahéj kéreg kivonat HPLC kromatogramjai.

(a) A fahéj kéreg kivonat HPLC kromatogramja: A felső panel a kimutatást mutatja ford-cinnamaldehid. Az alsó panel a felső panelen található piros nyíllal jelölt terület nagyobb változatát mutatja 2, A-típusú procianidin (PC) dimer; 3, A típusú PC trimmer; 5., A típusú PC trimmer; 6., belső szabvány; 7, cisz- fahéjsav; 9., ford—Fahéjsav. (b) Tiolizált fahéj kéreg kivonat (BM = benzil-merkaptán addukt) HPLC-kromatogramja: 1, Katechin; 2, A típusú PC-dimer; 3, A típusú PC trimmer; 4, Epicatechin; 5., A típusú PC trimmer; 6., Belső szabvány; 7, cisz- fahéjsav; 8., A típusú PC — BM trimmer; 9., ford- fahéjsav; 10., cisz Katechin — BM; 11., Epicatechin — BM; 12., A típusú PC - BM dimer.

Annak megállapításához, hogy a PAC főként felelős-e a fahéjkivonat erőteljes aktivitásáért, két PAC-val dúsított frakciót izoláltunk a kivonatból Sephadex LH-20 kromatográfiával, amelyek méretük alapján elválasztották az extraktumot, és így két PAC-val dúsított frakciót kaptak. (F1 és F2). Az első frakció (F1) 52,4 g PAC/100 g frakciót tartalmazott, és ezek alacsonyabb molekulatömegű PAC-t jelentettek (tiolízissel meghatározva; mDP 3,7), míg az F2 55,0 g PAC/100 g nagyobb molekulatömegű PAC-ból álló frakciót tartalmazott (mDP 7; 1. táblázat). Az F1 frakció csak nyomokban tartalmazott CA-t, míg a CA nem volt kimutatható az F2 frakcióban (az adatokat nem közöljük).

A fahéj kéreg eredetű proantocianidinek aktivitása az ellen Ascaris suum

Az izolált proantocianidin (PAC) frakciók féreghajtó hatása.

(a) Gátlása Ascaris suum harmadik stádiumú lárvák (L3) vándorlása az F1 és F2 PAC frakciókban végzett inkubálás után. A gátlást csak a táptalajban inkubált lárvákhoz viszonyítva fejezzük ki. Az eredmények két független kísérlet átlagát jelentik, mindegyiket három példányban hajtják végre. A hibasávok jelzik a SEM replikációját. (b) Gátlása A. suum negyedik stádiumú lárvák (L4) mozgékonysága az F2 PAC frakcióban történő inkubálás után. Az eredmények egyetlen kísérletből származnak, három példányban. A hibasávok jelzik a SEM replikációt. (c) A PVPP-ben történő inkubálás nem távolítja el a fahéj kéreg kivonat féreghajtó hatásait. Az eredmények két független kísérlet átlagát jelentik, mindegyiket három példányban hajtják végre.

A féregféregellenes tevékenység ford-cinnamaldehid in vitro

A tiszta féreghajtó hatása ford-cinnamaldehyd (CA).

(a) A CA féreghajtó hatása a Ascaris suum harmadik szakasz (L3) és negyedik szakasz (L4) lárvák. A halálozás A. suum 12 órás L3 és 6 óra L4 inkubálás után értékeltük. Az L3 eredmények három független kísérlet átlaga, mindegyiket három példányban hajtják végre, az L4 eredmények pedig egyetlen, három példányban végzett kísérletből származnak. A hibasávok jelzik a SEM replikációt. (b) A CA féreghajtó hatása a Oesophagostomum dentatum L3 és Trichuris suis első stádiumú lárvák (L1). A halálozás O. dentatum agar-alapú migrációs gátlási vizsgálattal mértük egy éjszakán át tartó CA-ban végzett inkubálás után T. suis mortalitás a motilitás megfigyelésével 2 órás inkubálás után. O. dentatum Az eredmények két független kísérlet átlagát jelentik, mindegyiket három példányban és T. suis egyetlen, három példányban végzett kísérlet eredményei. A hibasávok jelzik a SEM replikációját.

Ultrastrukturális károsodás Ascaris suum kitett ford-cinnamaldehid

Betekintést nyerni a CA lehetséges féreghajtó mechanizmusaiba, A. suum A magas CA koncentrációnak kitett L4-et (236 μM) transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgáltuk. A kutikula és a hypodermis vizsgálata nem mutatott ki jelentős változásokat a CA-nak kitett lárvákban, azonban néhány lokalizált szövetkárosodást és elváltozást észleltek a hypodermis mögött álló izomrétegben (6A. Ábra). A CA-nak kitett lárvák legszembetűnőbb károsodása az emésztőszövetekben történt (6B. Ábra). Míg a kontrolllárváknak szabályos, ép bélük volt, sérülésmentes mikrovillusokkal, ugyanazok a szövetek teljesen elpusztultak a CA-nak kitett lárvákban, a mikrovillák elvesztették minden integritását, és masszív elváltozások és vakuolák is jelen voltak. Így úgy tűnik, hogy a belső emésztőszövetek károsodása legalább részben felelős lehet a CA féreghajtó aktivitásáért.

Ultrastrukturális változások Ascaris suum kitett ford-cinnamaldehid.

Transmissziós elektronmikroszkópos felvételek A. suum negyedik stádiumú lárvákat tenyésztő táptalajnak (Control) vagy 236 μM-nak tettük ki ford-cinnamaldehid (CA) 12 órán át. Az összes panel méretaránya 2 μm-t jelent. (a) Kutikula (cu) és az alatta lévő izomszövet (mu) - vegye figyelembe a CA-nak kitett parazitákban a kutikula és a hypodermis mögött álló izomszövet elváltozásait (piros nyilak). (b) A bél lumenét borító mikrovillusokat (mv) mutató emésztőszövetek - vegye figyelembe a villi pusztulását (piros kör) és a nagy vakuolák (piros nyíl) jelenlétét a CA-nak kitett parazitákban.

Tesztelése ford-cinnamaldehid ellen Ascaris suum in vivo

80%) az SI harmadik negyedévében találtak minden sertésben. A CA-kapszulákkal adagolt sertéseknél több lárva található a negyedik (leghátsó) negyedben (20%) a kontrollhoz (10%) vagy az étrendben CA-val tápláltakhoz (15%) képest, azonban ezek a különbségek szintén nem voltak szignifikánsak (ábra 7B. P = 0,3 egyirányú ANOVA-val). Ezért annak ellenére, hogy erős in vitro tevékenység, a CA-nak nem volt in vivo hatása ebben a modellben A. suum fertőzés.

Teljes Ascaris suum lárvaterhelés és a lárvák eloszlása a beadott sertések belében ford-cinnamaldehid.

(a) A negyedik stádiumú lárvák (L4) száma a vékonybélben (SI) a fertőzés utáni 14. napon (p.i.) bármelyik etetett sertésben ford-cinnamaldehid (CA) az étrendben naponta (‘CA diéta’), kapszulázott CA-val adagolva a 11. és 13. napon p.i. („CA kapszulák”), vagy nem adagolt CA („kontroll”). Jelzi az átlagot és a SEM-et. (b) Az L4 aránya helyreállt az 1. szegmens (az SI proximális fele), a 2. (az SI harmadik negyede) és a 3. (az SI disztális negyede) három csoportjából. További információkért lásd az anyagokat és módszereket.

Vita

Míg a CA gyors felszívódása a gyomorból csökkenti féreghajtó szerként rejlő lehetőségét a bélben élő paraziták ellen, a vegyület stabilitásának növelésére szolgáló formulázása lehetőséget kínálhat e probléma leküzdésére. Nevezetesen Si et al. kimutatták, hogy az illóolajok (köztük a CA) emulgeálása különféle hidrokolloidokban helyreállíthatja in vitro antimikrobiális aktivitás, amely elvész a sertés étkezési vegyületeinek jelenlétében 41. Ezért kísérletek annak meghatározására, hogy az emulgeáló/stabilizáló szerek fokozhatják-e a in vivo A CA féreghajtó aktivitása, valamint a vékonybél elülső régióiban élő parazitákkal szemben végzett vizsgálatok indokoltak. Ezenkívül a mikrokapszulázási eljárások optimalizálása a vegyület védelme és a bélben való lassú felszabadulásának elősegítése céljából szintén megfelelő lehetőség lehet.

Összegzésként először megmutattuk, hogy a fahéj kéreg féreghajtó képességgel rendelkezik in vitro és ez egyaránt származik proantocianidin-cserzőanyagaiból és legfőképpen a ford-cinnamaldehid. Ugyanakkor a ford-cinnamaldehidet féreghajtóként kell megvalósítani a bélférgek ellen in vivo, a vegyület stabilizálásához és védelméhez valószínűleg megfelelő készítményekre lesz szükség.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

Minden állatkísérletet a Koppenhágai Egyetem Kísérleti Állat-egysége hagyott jóvá, és a Dán Állatkísérleti Felügyelőség irányelvei szerint hajtották végre (engedélyszám: 2010/561-1914).

Kísérleti terv

Az anthelmintikus vizsgálat kísérleti tervének vázlatos vázlatát a 8. ábra mutatja be. A fahéj kéreg kivonatot először kivonták és ellen tesztelték A. suum in vitro migrációs és motilitási gátlási tesztek alkalmazásával. Az extraktumból két PAC-frakciót nyertünk, és ellenük is teszteltük A. suum in vitro. Ezután a tiszta CA-t kereskedelmi forgalomban vásárolták, és ellen tesztelték A. suum, O. dentatum és T. suis lárvák in vitro és A. suum lárvák in vivo.