A vad típusú és az interleukin-10 hiányos szabályozó T-sejtek csökkentik az effektor T-sejt által közvetített gastroduodenitist a Rag2 -/- egerekben, de csak a vad típusú szabályozó T-sejtek elnyomják a Helicobacter pylori gyomorhurutot

ABSZTRAKT

A Helicobacter pylori megfertőzi az emberi gyomrot és gyomorhurutot okoz, a betegek egy részével peptikus fekélybetegség, gyomor karcinóma és gyomornyálkahártyához társuló nyirokszöveti limfóma alakul ki (20, 32). A C57BL/6 egerek H. pylori vagy Helicobacter felis fertőzése krónikus aktív gyomorhurutot eredményez (26, 27), és a H. pylori által kiváltott gastritis immun alapjának tanulmányozására használták. Emberekben és egerekben a helicobacter-fertőzések a Th1-domináns immunválaszt indukálják a CD4 + T-limfociták aktiválásával és a gyulladásgátló citokinek, például a gamma-interferon (IFN-y) expressziójával (24, 30). Ez a sejtközvetített immunitás gyomorhurutot eredményez, amelyet mononukleáris sejtinfiltrátumok, nyálkahártya hiperplázia és bélmetaplázia jellemez. Ezzel szemben az immunhiányos B6.129S7-Rag1 tm1Mom egerek, amelyekben nincsenek érett B- és T-sejtek, nagy sűrűségben kolonizálódtak H. felissel, de csak minimális gyomorhurut alakultak ki (37), jelezve a helicobacter-asszociált gyomorbetegségre adott adaptív immunválasz fontosságát.

A legfrissebb adatok azt igazolták, hogy a CD4 + T limfociták különböző alcsoportjai eltérő szerepet játszanak a H. pylori által kiváltott gastritis közvetítésében és szabályozásában. A B6.CB17-Prkdc scid egerekben a vad típusú (wt) CD4 + CD45RB hi effektor T (TE) sejtek örökbefogadó transzferje naiv donorokból súlyos gyomorhurutot okozott H. pylori-fertőzött recipiensekben, míg a wt CD4 + CD45RB lo szabályozó T (TR) sejtek védettek a gasztritisz kialakulása ellen (11). A TR-sejteket az interleukin-2 (IL-2) receptor a-láncának és Foxp3 (4) expressziójának, a villafej transzkripciós faktornak a CD4 + CD25 + TR sejtek thymás szelekciójához való kritikus meghatározása révén is meghatároztuk (21). A CD25 + Foxp3 + TR sejtek kimerülése H. pylori-fertőzött C57BL/6 egerekben az immunszabályozás elvesztéséhez és súlyosabb gyomorhuruthoz vezetett (34), valamint a CD4 + CD25 + sejtekből kimerült limfociták adoptív transzferje a H. pylori- fertőzött B6.Cg-Foxn1 nu (nu/nu) címzettek (35). A sok T-sejt részhalmaz közül, amelyeknek szabályozott funkciója van (22), a sejtrendezési kísérletek általában CD4 + CD25 + CD45RB lo-t használnak, mint természetesen előforduló TR-sejteket. Az ilyen típusú TR-sejtek általi szabályozás mechanizmusa (i) azonban nem teljesen ismert.

A wt TE-sejtek és a wt vagy IL-10-hiányos (IL-10 -/-) TR sejtek együttes alkalmazásával végzett adoptív transzfer modellekben az IL-10 elengedhetetlennek bizonyult a TR sejtek gyulladásos bélbetegség elnyomásában való működéséhez, dysplasia és a vastagbél rákja (3, 13). Ezen bizonyítékok alapján megvizsgáltuk a H. pylori gastritist B6.129S6-Rag2 tm1Fwa (Rag2 -/-) egerekben, amelyek wt CD4 + CD25 - CD45RB hi TE sejteket és CD4 + CD25 + CD45RB lo TR sejteket kaptak bármelyik wt C57BL-ből/6 vagy kongén IL-10 -/- egerek. Az eredmények azt mutatják, hogy a TE-sejtek gasztroduodenitist közvetítettek a Rag2 -/- egerekben, a H. pylori fertőzéstől függetlenül, és hogy a wt TR sejtek nagyobb mértékben elnyomták ezt az elváltozást, mint az IL-10 -/- TR sejtek. Csak a wt TR sejtek szuppresszálták a H. pylori fertőzésnek tulajdonítható additív corpus gastritist. Az adatok alátámasztják a TE és a H. pylori által közvetített gyomor gyulladásának kompartmentális különbségeit, valamint a wt és az IL-10 -/- TR sejtek közötti szabályozási hatások különbségeit, ami arra utal, hogy a wt TR sejtek által az IL-10 expresszió fontos a gyomorgyulladás.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

H. pylori fertőzés. A H. pylori Sydney 1. törzset alkalmaztuk orális oltásra, a korábban leírtak szerint (16, 19). A H. pylori-t 24 órán át 37 ° C-on tenyésztettük mikroaerob körülmények között, brucella táptalajban, 10% marha-magzati szérummal. Az inokulumot foszfáttal pufferolt sóoldatban szuszpendáljuk 600 nm-es optikai sűrűségig, 1000-ig, majd Gram-festéssel és fázismikroszkóppal megvizsgáljuk a tisztaságot, a morfológiát és a mozgékonyságot, valamint az ureáz-, kataláz- és oxidáz-aktivitást. Az egereket 0,2 ml-rel kaptuk minden második napon három adagban. A kontrollcsoportoknak 0,2 ml foszfáttal pufferolt sóoldatot adtunk.

Sejtválogatás és örökbefogadó transzfer. A wt vagy IL-10 -/- egerek lépéből és mesenterialis nyirokcsomóiból származó egysejtű szuszpenziókat a korábban leírtak szerint állítottuk elő (12). Röviden, a CD4 + sejteket CD4 Dynabeads és CD4 DETACHaBEAD (Dynal, Oslo, Norvégia) alkalmazásával izoláltuk. A sejteket ezután anti-CD4-Cy, anti-CD45RB-fluoreszcein-izotiocianáttal és anti-CD25-phikoeritrin antitestekkel (Pharmingen, La Jolla, CA) jelöltük, majd áramlási citometriával rendeztük (Mo-flo modell; Cytomation Inc., Fort. Collins, CO)> 95% -os tisztaságig tömeg% TE sejtek (CD4 + CD25 - CD45RB hi) és tömeg vagy IL-10 -/- TR sejtek (CD4 + CD25 + CD45RB lo) esetében. Az érzéstelenített Rag2 -/- egereket a retro-orbitális sinusba 3 × 105 TE sejtekkel injektáltuk önmagukban vagy 3 × 105 tömeg/IL-10 -/- TR sejtekkel kombinálva 200 μl Hanks-kiegyensúlyozott sóoldatban.

Szövettani értékelés. Boncoláskor a gyomrot és a proximális duodenumot eltávolítottuk és a nagyobb görbület mentén levágtuk. A kisebb görbületből származó lineáris gyomorcsíkokat egy éjszakán át 10% semleges pufferelt formalinban rögzítettük, beágyazottuk, 4 μm-re vágtuk és hematoxilinnel és eozinnal (H-E) festettük. A sérüléseket egy állatorvosi patológus értékelte, akit megvakítottak a minta azonosságára, a korábban leírtak szerint (36). A teljes elváltozás indexét úgy számoltuk ki, hogy az 1. táblázatban leírt értékelések mindegyikéhez egyedi pontszámokat adtunk, kivéve a nyálkahártya metapláziát és a hyalinosist, amelyekről megfigyelték, hogy spontán fejlődnek ki egerekben (23), valamint H. felis fertőzésben (15, 43).

Gyomorelváltozások 16 és 20 WPI-nál H. pylori-val

Speciális foltok és immunhisztokémia. A szelektív szöveteket speciális foltok és immunhisztokémia segítségével jellemeztük. A savas (bél típusú) mukineket 2,5 pH-értékű alcian-kék alkalmazásával, majd periodikus sav-Schiff alkalmazásával igazoltuk a megmaradt semleges (gyomor típusú) nyálkahártyák megfestésére (36). A makrofágokat F4/80 monoklonális antitesttel (1: 150; Caltag Laboratories, Burlingame, CA) és avidin-biotin-peroxidáz komplex készlettel (Vector Laboratories, Burlingame, CA) festettük a gyártó utasításainak megfelelően.

A H. pylori mennyiségi tenyészete. A H. pylori gyomorban való kolonizációját kvantitatív tenyésztéssel értékeltük, a korábban leírtak szerint (16). Röviden, a korpuszból és az antrumból származó szöveteket lemértük és steril üvegszöveti darálóval homogenizáltuk 250 μl brucella táptalajban. A homogenizátumot 10 és 100-szorosan hígítottuk brucella táptalajban, és 5% lóvért, 250 μg/ml amfotericin B-t, 7 μg/ml bacitracint, 10,7 μg/ml nalidixinsavat, 3,3 μg/ml polimixint tartalmazó szelekciós lemezekre szélesztettük. és 100 μg/ml vankomicin. A lemezeket mikroaerob módon inkubáltuk 37 ° C-on 7 napig. Megszámoltuk a baktériumtelepeket, és kiszámítottuk a szövet grammjára jutó CFU számát.

Statisztikai analízis. A csoportok közötti megbetegedéseket a log rang teszt segítségével hasonlítottuk össze. A sérülési pontszámokat Mann-Whitney U teszttel vagy Kruskal-Wallis egyirányú varianciaanalízissel hasonlítottuk össze Dunnett tesztjével. A citokin és Foxp3 expressziós szinteket és a H. pylori kolonizációs adatokat (log transzformáció után) Newman-Keuls teszttel hasonlítottuk össze. A statisztikai elemzést kereskedelmi szoftver (Graphpad Prism 4.0; San Diego, CA) alkalmazásával végeztük, szignifikancia mellett a Rag2 -/- TE-sejt-befogadó egerek P-értékénél morbiditás és gastroduodenitis alakult ki, függetlenül a H. pylori-fertőzéstől. H. pylori-fertőzött és helicobacter-mentes kontroll A sejttranszfert nem kapott Rag2 -/- egerek klinikailag normálisak voltak a 20 hetes vizsgálati periódus alatt. Ezzel szemben a 10 nem fertőzött TE-sejt-recipiensből 7 és a 12 H. pylori-fertőzött TE-sejt-recipiens Rag2 -/- egérből 3 hirtelen halt meg, vagy hasmenése és csökkenő testállapota alakult ki, ami korai eutanáziát tett szükségessé a transzfer utáni 4. és 12. hét között. T-sejtek (1. táblázat). Az összes megmaradt, nem fertőzött és H. pylori-fertőzött Rag2 -/- egeret, amelyek csak TE-sejteket kaptak, a T-sejtek transzferjét követő 12. héten boncoltuk el, amely szintén 16 héttel volt utólag fertőzve (wpi) H. pylori-val.

A wt TE sejtek Rag2 -/- egerekbe történő átvitele immun-mediált pangastritist és gastroduodenitist eredményezett. a) A Rag2 -/- egér normál pikkelyes gyomor rekesze, amely nem kapott TE sejteket. (b) A TE-sejt transzfer a laphám gyulladását eredményezte, reaktív hámsejt hipertrófiával és a felszíni nyálkahártya plikációjával. (c) A TE-sejt transzfer gyulladást is okozott a cardiában és a corpusban. (d) A mirigy és az oxyntikus nyálkahártya TE-sejtek által közvetített gyomorhurutja oxyntikus atrófiát eredményezett, amelyet a parietális és a fő sejtek elvesztése jellemzett. e) Normál Brunner mirigyek (nyíl) a proximális duodenumban. (f) A TE-sejt transzfer duodenitist eredményezett, a Brunner mirigyek majdnem teljes elvesztésével atrófia és tubuloductularis metaplasia miatt (nyíl). H-E festést használtunk ezekhez a mintákhoz. Rúd, 200 μm.

Adaptív immunitás szükséges a H. pylori-val társult gastritis kialakulásához. 20 wpi-nél értékelve a H. pylori-fertőzött Rag2 -/- egerek gyomor- és bélrendszere durván normálisnak tűnt, és hasonló volt a nem fertőzött Rag2 -/- egerekéhez. Szövettanilag a H. pylori-fertőzött Rag2 -/- egereknél csak minimális corpus gastritis alakult ki szétszórt neutrofilekkel (1. táblázat és 2. ábra) és F4/80 + makrofágokkal a submucosában (nem látható). A H. pylori-vel fertőzött wt egereket értékelték, hogy megerősítsék a H. pylori Sydney 1. törzs által okozott fertőzés robusztus gyomorhurutját. Ezeknek az egereknek a gyomor mérsékelt durva megvastagodása volt, szövettani elváltozások kísérték, amelyek jelentős mononukleáris sejtekkel és neutrofilekkel történő beszivárgásból, hámhibákból, oxyntikus atrófia, bélmetaplázia és hiperplázia (1. táblázat) (P -/- egerek a donor TE sejtek gyulladásos aktivitásának tulajdoníthatók.

H. pylori fertőzés Rag2 -/- egerekben, a wt TE sejtek későbbi átvitelével vagy anélkül, önmagában, vagy wt vagy IL-10 -/- TR sejtekkel kombinálva. a) T-sejtek hiányában a H. pylori fertőzés minimális vagy egyáltalán nem okozott gyomorhurutot. (b) H. pylori fertőzés, majd a TE sejtek átadása közepes vagy súlyos gyomorhurutot eredményezett. (c) A wt TR sejtek együttes transzferje javította a gyomorgyulladás súlyosságát H. pylori-fertőzött, TE-sejt-befogadó egerekben, de ismeretlen okokból a parietális sejtek markáns nyálkahártya-metapláziája alakult ki (nyíl). (d) Az IL-10 -/- TR sejtek együtttranszferje H. pylori-fertőzött TE-sejt-befogadó egerekbe csökkentette a TE-sejtek által közvetített antrális gasztritist, a Brunner-sejtek veszteségét és az epitheliális diszpláziát, de nem csökkentette a H. pylori-indukálta corpus gastritis. H-E festést használtunk ezekhez a mintákhoz. Rúd, 200 μm.

A H. pylori fertőzés súlyosbította a corpus gastritist Rag2 -/- TE-sejt-befogadó egerekben. A H. pylori-fertőzött Rag2 -/- egereket, amelyek 4 wpi-nél TE-sejteket kaptak, és 16 wpi-nél boncolták, klinikailag hasonló mértékben befolyásolták, mint a nem TE-sejteket önmagukban kapott Rag2 -/- egerek. Váratlanul a H. pylori-fertőzött TE-sejt-befogadó Rag2 -/- egerek mortalitása kisebb volt, mint a nem fertőzött TE-sejteké, 12 egérből 9-en éltek túl 16 wpi-ig (P -/- egerek, ami arra utal, hogy A TE-sejtek közvetítették a Brunner-mirigyek antrális gyomorhurutját, duodenitiszét és megsemmisülését. Ezek az eredmények azt is jelzik, hogy a H. pylori fertőzés tovább mozdította a corpus gastritist, amely a H. pylori-független gastroduodenitisre került.

A H. pylori kolonizációs szinteket TE sejtek csökkentették és fenntartották, amikor a tömeg tömegű TR sejteket együtt transzferálták. Beszámoltak arról, hogy a H. pylori kolonizációs szintje fordítottan összefügg a társult krónikus gyomorhurut súlyosságával egerekben (38). Gyulladásos válasz hiányában a H. pylori-fertőzött Rag2 -/- egereket, amelyek nem kaptak T-sejteket, a corpusban és az antrumban 3–5 log-tal magasabb magasságban kolonizálták, mint a fertőzött TE-sejtekben. a befogadó Rag2 -/- egerek (4. ábra) (a P -/- TR sejteknél csökkent a korpusz kolonizációja, hasonlóan a fertőzött egerekhez, amelyek csak TE-sejteket kaptak (P = 0,43), ami arra utal, hogy az IL-10 -/- TR sejtek nem befolyásolták TE-sejtek által közvetített H. pylori gátlás Az antrumban a wt TR sejtek magasabb kolonizációs szintet tartottak fenn, mint a kizárólag TE sejteket kapó fertőzött egereknél (a P -/- TR sejtek hasonlóak voltak a kizárólag TE sejteket kapó fertőzött egerekhez (P = 0,19) (4b. Ábra).

Összefoglalva, adataink bemutatják a TE-sejtek szerepét az adaptív immunitás egyik összetevőjeként, amely TR-sejtek hiányában kiválthatja és fenntarthatja a gyomor-nyombél gyulladását. A H. pylori fertőzés TE-sejt transzferrel párosulva súlyosabb corpus gastritist eredményezett, amely kompartmentálisan megkülönböztetett a TE-sejt által közvetített gastroduodenitistől. Eredményeink azt is mutatják, hogy a TR-sejtek IL-10 kompetenciája szükségesnek tűnt a H. pylori által kiváltott gastritis szuppressziójához, de nem volt olyan kritikus a TE-sejt által közvetített gastroduodenitis enyhítésében vagy a kapcsolódó morbiditással szembeni védelemben. Ezek az eredmények kompatibilisek azzal a korábbi jelentéssel, hogy a H. pylori által kiváltott gastritist egerekben IL-10-függő, Th1-típusú immunválasz szabályozza (5, 44), valószínűleg a CD25 + Foxp3 + TR sejtek funkcióján keresztül (34 ), és összhangban van a megnövekedett Foxp3 expresszióval a wt TR-sejt recipiensekben. A TE-sejtek és a H. pylori által közvetített gyulladások és a wt vagy IL-10 -/- TR sejtek általi differenciális szabályozás területi különbségeinek értékesnek kell lenniük a bakteriális és immun-közvetített gyomorhurut vizsgálatában.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a munkát az R01AI37750, az R01AI50952, a P01CA26T31 és a P30ES02109 (J.G.F.) támogatások támogatták.

Köszönetet mondunk Vivian Ng-nek és Philip Lee-nek az állatgondozásért és a boncolásért, Kathy Cormier-nek a szövettanért és az immunhisztokémiáért, Sandy Xu-nak és Nancy Taylor-nak a kvantitatív tenyésztésért, Kuo-Liong Chien-nek a statisztikai elemzésben nyújtott segítségért, valamint Glenn A. Paradis-nak és Michele Perry-nek szakértőjüknek. segítség a sejtek rendezésében.