A WISP1 egy újszerű adipokin, amely az elhízás gyulladásához kapcsolódik

V.M. és O. P. egyformán járultak hozzá ehhez a cikkhez.

Absztrakt

Bevezetés

Az elhízási járvány világszerte egyre növekvő egészségügyi, társadalmi és gazdasági problémát jelent (1). A központi elhízás és a metabolikus szindróma a 2-es típusú cukorbetegség, a rák, az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) és az inzulinrezisztens állapot független kockázati tényezője (1,2). Az elmúlt évtizedben az elhízással összefüggő betegségek patogenezisének mögött álló egységesítő mechanizmus szülte a „meta-gyulladás” fogalmát, amely leírja az elhízásra adott krónikus alacsony fokú gyulladásos választ (3). A zsírszövet korlátozott tágulása további meghatározó tényező az elhízással összefüggő betegségek patogenezisében (4). Ezenkívül bőséges bizonyítékok, amelyek többnyire egérvizsgálatokból származnak, összekapcsolják a Wingless típusú (WNT) jelátviteli utat az adipogenezis (5,6) és a gyulladás (7) szabályozásával az elhízásban.

Jelenleg nem állnak rendelkezésre adatok a WISP1 inzulin célszövetekre, ideértve a májat és a zsírt is. A jelenlegi vizsgálatban in vitro kísérleteket kombináltunk négy független klinikai vizsgálattal, hogy a WISP1-et új adipokinként érvényesítsük, és hogy jellemezzük a WISP1 és a metabolikus szindróma paramétereinek összefüggését. Megmutatjuk, hogy 1) a WISP1 egy újfajta adipokin, amelyet differenciált humán adipocitákból szabadítanak fel; 2) WISP1 expresszió lényegesen megemelkedik a zsigeri zsírszövetben (VAT), nem pedig a szubkután zsírszövetben (SAT) glükóz-toleráns alanyokban; 3) A WISP1 expresszió korrelál az inzulinérzékenységgel, az adiponektinnel és a zsírszövet gyulladásának markereivel; 4) a súlycsökkenés csökkenti a WISP1 expresszióját a SAT-ban, valamint a keringő WISP1 szintjét a plazmában; és 5) a máj WISP1 expressziója nem mutat összefüggést az elhízás méhen kívüli zsírfelhalmozódásával.

Kutatási tervezés és módszerek

I. kohorsz

Az VAT és a SAT párosított mintáit 75 kaukázusi férfitól (n = 40) és nőtől (n = 35) kaptuk, akik hasi műtéten estek át, és metabolikusan jellemezték őket a korábban leírtak szerint (19). A testzsír százalékát a DEXA-val mértük. Egy alcsoportban (n = 52) a hasi zsigeri zsírtartalmat mágneses rezonancia képalkotással (MRI) mértük a korábban leírtak szerint (20). Az inzulinérzékenységet a korábban leírt euglikémiás-hiperinsulinémiás clamp módszerrel értékeltük (21). A VAT- és SAT-minták makrofágtartalmát a zsírszövet-metszetekben (hematoxilin-eozinnal festve) vizualizáltuk a CD68 (1: 200; DAKO) elleni további festéssel, a korábban leírtak szerint (19). Minden egyes tárgylemezről száz sejtet vizsgáltunk, és megszámoltuk a CD68 + sejteket. Az adipocita sejtek VAT és SAT méretét a zsírszövet metszeteiben elemeztük a korábban leírtak szerint (19).

Kohorta II

A súlycsökkentés hatásait 49 alanyon vizsgálták, akiket 8 hetes alacsony kalóriatartalmú étrenden tartottak (Modifast; Nutrition et Santé, Revel, Franciaország), amely 800 kcal/nap plusz 200 g/nap zöldségfélét tartalmazott. A vizsgálatba azokat a résztvevőket választották, akik 8 hét után legalább 8% -os súlycsökkenést értek el. A tanulmány tervezésének részletes leírását korábban közzétették (22). A testzsír százalékát a DEXA-val mértük. A plazmamintákat és a SAT biopsziás mintákat egy éjszakai éhgyomri után vettük le súlycsökkenés előtt és után.

Kohorta III

Az I. és a III. Kohorszban a VAT és a SAT páros mintáit kaptuk ugyanazon helyekről hasi műtét során késhúzással. A II. És a IV. Kohorszban a SAT biopsziás mintákat tűszívással vettük a köldök szintjén lévő kontralaterális helyekről. Az összes mintát azonnal gyorsfagyasztottuk folyékony nitrogénben, és -80 ° C-on tároltuk az mRNS extrahálásához.

Az I. vizsgálatot a németországi Lipcsei Egyetem etikai bizottsága, a II – IV. Tanulmányokat pedig az 1) Potsdami Egyetem, Potsdam, Németország; 2) Brandenburgi Állami Orvosi Egyesület, Németország; és 3) Charité Egyetem Orvostudomány, Berlin, Németország. Valamennyi alany írásos tájékozott beleegyezést adott, mielőtt részt vett a tanulmányban.

Biokémiai mérések

A biokémiai méréseket rutin módszerekkel végeztük. A plazma- és tápközegmintákban a WISP1-et kereskedelmi vizsgálattal (WISP1 ELISA; RayBiotech, Inc., Norcross, GA) detektáltuk. Ehhez a táptalaj mintákat Vivaspin 2 koncentrátorokkal (Sartorius, Goettingen, Németország) koncentráltuk. A sejttenyésztő tápközegben a citokinek felszabadulását ProcartaPlex Multiplex Immunassay (eBioscience, Frankfurt am Main, Németország) alkalmazásával számszerűsítettük.

Állattanulmány

Az állatprotokollokat a helyi kormányzati állatetikai felülvizsgálati testület (Brandenburg tartomány, Németország) hagyta jóvá. Tizenkét hetes C57BL/6J hím egereket vagy kontroll étrenden (10 kcal-% zsír, 20 kcal-% fehérje, 70 kcal-% szénhidrát, 3,85 kcal/g) vagy magas zsírtartalmú étrenden (HFD) tartottak. (60 kcal-% zsír, 20 kcal-% fehérje, 20 kcal-% szénhidrát, 5,24 kcal/g) (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ) 6 hétig. A WISP1 mRNS expresszióját epididymális fehér zsírszövetben, májban és gastrocnemius izomban mértük.

Sejtkultúra

A humán monocita eredetű makrofágokat 10% HyClone FCS (Thermo Scientific, Waltham, MA) és 50 ng/ml humán granulocita makrofág kolóniastimuláló faktorral (Peprotech, Hamburg, Németország) kiegészítve RPMI 1640 táptalajon különböztettük meg az izolált vér monocitáktól. napig, és rekombináns humán WISP1-gyel stimuláltuk (Escherichia coli endotoxin d -biotin, 15 mmol/L d-pantotenát, 100 nmol/L hidrokortizon, 20 nmol/L inzulin, 0,01 mg/ml transzferrin (mindezt Sigma-Aldrich-től, Seelze, Németország) ) és 2 μmol/L rosiglitazont (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) 14 napig. Az adipocita morfológiáját olajvörös O festéssel igazoltuk (1A. kiegészítő ábra). A differenciálódott adipocitákat 100 nmol/l inzulinnal (Sigma Aldrich) 4 órán át vagy 0,5 μg/ml WISP1 (Peprotech) alkalmazásával 24 órán át.

A 3T3-L1 adipocitákat 10% HyClone FCS-sel, 1 μg/L inzulinnal, 0,5 mmol/L 3-izobutil-1-metilxantinnal és 0,25 μmol/L dexametazonnal kiegészített DMEM-ben differenciáltuk 7 napig, és LY294002-vel vagy anélkül kezeltük (25 μmol/L, Sigma-Aldrich), PD098059 (30 μmol/L, Sigma-Aldrich) és NVP-AEW541 (0,1 μmol/L, Cayman Chemicals) 30 perccel, mielőtt 100 nmol/l inzulinnal stimulálnánk 4 órán át.

Olajvörös O festés

A differenciált adipocitákat PBS-ben mostuk, és 10% -os formaldehiddel rögzítettük 60 percig szobahőmérsékleten. Ezután az egyes üregeket óvatosan vízzel mossuk, és 60% izopropanolt adunk mindegyik üreghez 5 percig. Olaj Red O munkaoldatot készítettünk három rész Oil Red O törzsoldat (Sigma-Aldrich) összekeverésével két rész ioncserélt vízzel. A tenyészeteket Oil Red O munkaoldattal inkubáltuk 5 percig szobahőmérsékleten. Olajvörös O oldatot eltávolítottunk, és a tenyészeteket csapvízzel mostuk, amíg az öblítés tiszta nem lett.

Kvantitatív valós idejű PCR

A teljes RNS-t a NucleoSpin RNS II Kit (Macherey-Nagel, Düren, Németország) vagy az RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Németország) segítségével extraháltuk. A cDNS szintézisét nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlet alkalmazásával (Applied Biosystems, Foster City, CA) végeztük. A valós idejű kvantitatív PCR-t (qRT-PCR) Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) és az 1. kiegészítő táblázatban bemutatott primerek felhasználásával végeztük.

Western Blotting

A semidry immunblotokat foszfo-p44/42 mitogénnel aktivált protein kinázra (MAPK) (foszforilezett extracelluláris szignálhoz kapcsolódó kináz [ERK]), p44/42 MAPK (ERK), foszfo-Akt és Akt (Life Technologies/Cell Signaling, Boston, MA), WISP1 (ab10737, Abcam, Cambridge, MA), α-tubulin (Life Technologies/Cell Signaling) és IRDye 800CW Goat Anti-Rabbit IgM (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) és számszerűsítve az Odyssey infravörös képalkotó rendszerrel (LI-COR Biosciences, Bad Homburg, Németország).

Statisztikai analízis

Az összes statisztikai elemzéshez az SPSS 20.0 verziójú szoftvert (IBM Corporation, Chicago, IL) használtuk. Ha másként nem jelezzük, az adatok átlag ± SEM. A normális eloszlás meglétét vagy hiányát a Kolmogorov-Smirnov-teszt igazolta. Az adatok megoszlásától függően Pearson egyszerű együtthatót vagy Spearman rang korrelációs együtthatót alkalmaztunk a korreláció elemzéséhez, és a csoportok közötti különbségek megbecsülésére Mann-Whitney U tesztet vagy Student t tesztet alkalmaztunk. P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

A vizsgált kohorszok klinikai jellemzői