A zöld tea és az eperfa levélporok hatása a csirke bél mikrobiotájára

Absztrakt

Háttér

A bél mikrobiota szoros összefüggésben van a gazda egészségével, és az élelmiszer összetétele erősen befolyásolja. A kínai gyógynövényeket általában természetes takarmány-adalékként használják az állattenyésztésben. Ezért a jelen tanulmány a zöld tea és az eperfa levélporral való étrend-kiegészítés hatását értékelte a csirkebél mikrobiotájára. A bél mikrobiota összetételét 16S rDNS szekvenálással határoztuk meg.

Eredmények

Fokozott relatív bősége Bacteroides, Prevotella, és Megamonas találtak a csirkebélben, amikor eperfa levélport adtak az étrendhez. Ezzel szemben a potenciálisan kórokozók nagyobb száma Gallibacterium a csirkebélben találták, amikor az étrendet zöld tea porral egészítették ki. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a zöld tea por és az eperfa levélpor összetételük megváltoztatásával nagyban befolyásolhatja a csirkék bél mikrobiotáját.

Következtetések

Feltétlenül meg kell vizsgálni és ki kell értékelni a kínai gyógynövények állat-egészségre gyakorolt ​​hatásait, mielőtt takarmány-adalékanyagként bevezetnék őket az állattenyésztésben.

Háttér

A bél mikrobiota a gazdaszervezet emésztőrendszerében található rezidens mikroorganizmusokat tartalmazza. A bél mikrobiota szorosan összefügg a gazdaszervezet egészségi állapotával és a betegség állapotával [1,2,3]. Az elmúlt években számos kutatás kimutatta, hogy az étrend befolyásolja az állati bél mikrobiotájának összetételét. A természetes táplálékkal táplált kutyáknak a bél mikrobiotájában változatosabb és bőségesebb mikrobiális összetétele van, mint a kereskedelmi takarmánnyal etetett kutyáknak [4]. A nyers hús alapú étrend egészséges kutyákban befolyásolja a széklet mikrobiomját [5]. Zöld tea por egyetlen törzzsel kombinálva Lactobacillus plantarum képes volt elősegíteni a Lactobacillus a C57BL/6J egerek belében [6]. Az illóolaj-kiegészítés pozitív hatást gyakorol a bél mikrobiotájára a Ross brojlereknél [7].

Az antibiotikumok biztonságos alternatívájaként számos kínai gyógynövényt használnak természetes takarmány-adalékanyagként az állattenyésztésben [8, 9]. Ezen természetes takarmány-adalékanyagok közül a zöld teát és az eperfa leveleket gyakran használják takarmány-adalékként a baromfiban [10,11,12,13,14,15]. A zöld teáról ismert, hogy egészséget elősegítő tulajdonságokkal rendelkezik [16,17,18]. Egyes tanulmányok kimutatták, hogy a zöld tea kivonatok szelektíven gátolják a kórokozó baktériumok szaporodását, miközben semmilyen hatást nem mutatnak a hasznos baktériumok szaporodására [19,20,21]. A zöld tea por, amelyet egyre többször használnak az élelmiszerek kiegészítő összetevőjeként, hatással lehet az egerek bélmikrobiotájára [6]. A zöld tea por takarmány-adalékként kifejtett hatását a bél mikrobiotájára azonban még nem jelentették a baromfik. Az eperfa levelét és kivonatát terápiás tulajdonságaik miatt használják, különösen gyulladáscsökkentő, cukorbetegség elleni és antioxidáns tulajdonságaik miatt [22,23,24]. Az eperfa levélnek a csirkebél mikrobiotára gyakorolt ​​hatását azonban korábban nem értékelték.

A 16S rRNS gének következő generációs szekvenálásának használata nagymértékben javította a különböző állatfajok gyomor-bélrendszeri (GI) traktusában jelen lévő baktériumközösség megértését [25, 26]. Jelen tanulmányban 16S rDNS-szekvenálást végeztünk a zöld tea por és az eperfa levélpor hatásának vizsgálatára a csirke bélmikrobiota összetételein. Eredményeink azt mutatják, hogy a zöld tea por és az eperfa levélpor összetételének megváltoztatásával nagyban befolyásolhatja a csirkék bél mikrobiotáját.

Eredmények

Mikrobiális sokféleség a csirkebélben

A különböző szekvenálási mélységű minták összehasonlításához az egyes mintákat ritkították 8708 szekvenciára. A szekvencia 97% -os azonosságának küszöbén 36243 egyedi OTU-t azonosítottak az összes mintában. Az összes mintában a teljes szekvenciát 41 phylához (3 archaeal phyla és 38 bakteriális phylához) rendeltük. Firmicutes (60,32 ± 21,96%), Proteobaktériumok (18,96 ± 17,99%), Bacteroidetes (11,55 ± 17,84%), Actinobaktériumok (4,50 ± 3,30%), Synergistetes (0,84 ± 1,61%), Cianobaktériumok (0,72 ± 0,85%), Tenericutes (0,63 ± 0,93%), Euryarchaeota (0,41 ± 0,84%), Chloroflexi (0,31 ± 0,87%), Acidobaktériumok (0,28 ± 0,86%), Spirochaetes (0,20 ± 0,42%), Crenarchaeota (0,16 ± 0,49%), és Planctomycetes (0,13 ± 0,36%) volt a domináns phyla az összes mintában. Az egyes minták összetételét a menedékjog szintjén az 1. ábra szemlélteti. Az A, B és C csoportok között szignifikáns változásokat figyeltünk meg a Bacteroidetes és Proteobaktériumok. Ami az alfa sokféleségét illeti Bacteroidetes, a B csoportban szignifikánsan nőtt a C csoporté (Egyirányú ANOVA, P 1. ábra

hatása

Domináns phyla a csirke bél mikrobiotájában. Az összes mintában az összes szekvenciát 41 phylához rendeltük. A százalékos oszlopdiagram mutatja a domináns phyla összetételét a csirkebél mikrobiotában különböző csoportokban. Az A, B, C csoport három különböző kezelést jelent az alábbiak szerint: Az A csoportot alapdiétával etették + 2% zöld tea porral; a B csoportba bazális étrendet adtak + 4% eperfa levélporral; A C csoport csak bazális étrendet etetett kontrollként. Mindegyik kezelést három ismétlésben hajtottuk végre (1., 2. és 3. jelöléssel)

A bél mikrobiális összetételeinek különbségei a különböző csoportok között

A fő koordináta-analízist (PCoA) súlyozott UniFrac távolságok alapján végeztük, hogy értékeljük a mikrobiális eloszlást a három csoport között. A súlyozott UniFrac-diagram megmutatta, hogy az A-B csoport bélmikrobiális közössége erősen elkülönült a C-csoportétól. Ezenkívül szignifikáns különbséget figyeltek meg a takarmány-adalékanyag-csoportok (A-B csoport) és a nem takarmány-adalékanyagok csoportja (C-csoport) között a PC1 és a PC2 esetében (58,07, illetve 19,97% variancia), P 2. ábra

A csirke bél mikrobiotájának differenciálása különböző takarmány-adalékokkal. a PCoA elemzés súlyozott UniFrac távolság alapján. Minden pont egy mintát jelent. Az első fő komponenst az X tengelyre, a második fő komponenst az Y tengelyre ábrázoljuk. A színek különböző csoportokat jelölnek. Az egyes tengelyek százalékos aránya jelzi a minták közötti eltéréshez való hozzájárulást. PCoA, fő koordináta-elemzés; Az A csoportot bazális étrend + 2% zöld tea por táplálta; a B csoportba bazális étrendet adtak + 4% eperfa levélporral; A C csoport csak bazális étrendet etetett kontrollként. b Specifikus bakteriális taxonok és domináns baktériumok filogenetikai profiljai a három különböző csoport között, az LEfSe analízissel meghatározva. A biomarker taxonokat színes körök és árnyékos területek emelik. Minden kör átmérője arányos a taxonok bőségével a közösségben. c Csoportbőség-hőtérkép, amely a három csoport differenciálisan bőséges nemzetségeinek normalizált értékeit mutatja. A csoport neve az X tengelyen van ábrázolva, az Y tengely pedig a nemzetséget ábrázolja. A színek viszonylagos bőséget tükröznek az alacsony (zöld) és a magas (piros) között

Lineáris diszkrimináns analízis (LDA) hatásméretet (LEfSe) [27] alkalmaztunk a takarmány-adalékokra reagáló specifikus filotípusok azonosítására az egyes csoportokban (2b. Ábra). Az LEfSe 13 baktérium taxonómiai osztályt mutatott ki, statisztikailag szignifikáns különbségeket mutatva a három csoport között. Családi szinten a relatív bőség Porphyromonadaceae, Lachnospiraceae, és Veillonellaceae a B csoportban szignifikánsan megnőtt, míg a Clostridiaceae, és Micrococcaceae és Lactobacillaceae szignifikánsan növekedtek az A, illetve a C csoportban. Nemzetségi szinten, Parabacteroides, Megamonas, Megasphaera és Phascolarctobacterium felülreprezentáltak voltak a B csoportban, míg Candidatus Arthromitus felülreprezentált az A csoportban, és Rothia és Lactobacillus Az eredmények azt is megmutatták, hogy a takarmány-adalékanyagok, a zöld tea por és az eperfa levélpor nagyban befolyásolták a csirkebél mikrobiota összetételét.

A HemI hasznos eszközkészlet lehet a hőtérképek kényelmes megjelenítéséhez és manipulálásához [28]. Ahhoz, hogy vizuálisabb képet nyújtsunk a domináns nemzetségek bőségének változatosságáról a minták között, Hem1 szoftvert használtunk (lásd: http://hemi.biocuckoo.org/download/HemI_Manual.pdf) a hőtérképek elkészítéséhez (2c. Ábra). Az eredmények azt mutatták, hogy a baktériumok jelentősen megnőttek a három csoportban. Megamonas, Bacteroides, és Prevotella nagyobb volt a B csoportban, mint az A és a C csoportban, és Lactobacillus nagyobb volt az A és a C csoportban. Ez azt mutatta, hogy az eperfa levélporral kiegészített takarmány megváltozott baktériumgazdagsághoz vezetett a kiegészítés nélküli táplálékhoz képest (C csoport).

Vita

A zöld tea por hatása a csirke bél mikrobiotájára

Egy nemrégiben készült kutatás feltárta, hogy billió mikroorganizmus él a csirkebélben, az első négy phyla pedig Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria és Bacteroidetes [29]. Ezzel a vizsgálattal összhangban a felső négy phylát a csirkebélben is megtalálták különböző csoportokból.

Az eperfa levélpor hatása a csirke bél mikrobiotájára

Következtetések

Összegzésként tanulmányunk bizonyítja, hogy a zöld tea por és az eperfa levélpor nagyban megváltoztathatja a csirke bél mikrobiotájának összetételét. A két növényi takarmány-adalékanyag azonban különböző módon befolyásolta a bél mikrobiotáját, jelezve, hogy eltérő és ellentétes hatást fejthetnek ki a csirke egészségére. Ezért feltétlenül meg kell vizsgálni és ki kell értékelni a kínai gyógynövények állat-egészségügyi hatásait, mielőtt takarmány-adalékanyagként bevezetnék őket az állattenyésztésben.

Mód

Állatpopuláció és tanulmányterv

Ezt a vizsgálatot a Kínai Népköztársaság állatgazdálkodási szabályainak szigorú betartásával végezték. Egészséges nőstény Huiyang szakállas csirkéket választottak ki a Guangdong Jinzhong Mezőgazdasági és Állattenyésztési Technology Co., Ltd. nemzeti Huiyang szakállas csirketenyésztő telepéről. Ez a baromfifajta helyi brojler.

Az összes csirkét intravénás barbiturát-túladagolással, majd méhnyak-diszlokációval eutanizálták. Béltartalmukat az eutanáziától számított 5 percen belül azonnal összegyűjtötték a ceca-ból, azonnal kriogén injekciós üvegekbe tették, azonnal -20 ° C-on tárolták hordozható fagyasztóban, a laboratóriumba szállították és -80 ° C-on tárolták a DNS kivonásáig.

DNS-extrakció, PCR és 16S szekvenálás

A béltartalom genomiális DNS-extrakciós készletét (TIANGEN Biotech, Kína) használtuk a teljes béltartalom-DNS kinyerésére. A készlet szilícium-dioxid membrán technológián alapul, és speciális puffer rendszert biztosít InhibitEX tabletta segítségével a székletminta gDNS kivonására (a részletes eljárást a TIANamp Stool DNA Kit kézikönyv mutatja, http://www.tiangen.com/asset/imsupload/up0044925001433136195.pdf). . Az egyes kezelésekből kilenc DNS-mintát véletlenszerűen három csoportba osztottunk, így poolonként három DNS-mintát kaptunk. A DNS-koncentrációt és tisztaságot a Nanodrop 2000 spektrofotométerrel határoztuk meg. A mikrobiális 16S rRNS gén V4 – V5 hipervariábilis régiójának amplifikálása a [40] -ben látható univerzális primereket használta. 25 μl PCR amplifikációs reakcióelegy tartalmazott 1 × PCR puffert, 1,5 mM MgCl2-t, mindegyik primert 1,0 μM-en, 0,25 U Ex Taq-ot (TaKaRa, Kína) és 10 ng genomiális DNS-t. A PCR-amplifikációs eljárás a következő volt: denaturálás 94 ° C-on 3 percig, majd 30 ciklus (ezt követően minden ciklus 40 másodpercig 94 ° C-on denaturált, 60 másodpercig 56 ° C-on hőkezelt és 72 ° C-on megnyúlt. 60 másodpercig) és végső meghosszabbítást 72 ° C-on 10 percig.

PCR-amplifikáció után a két PCR-terméket összekevertük, hogy 1,2% -os agarózgélen fussunk. Miután a célsávot kivágtuk, majd tisztítottuk SanPrep DNS gélkivonó készlet segítségével (Sangon Biotech, Kína). Valamennyi amplikont összegyűjtöttük mindegyik mintából azonos moláris mennyiséggel és szekvenáltuk Illumina MiSeq rendszerrel a Guangdong Meilikang Bio-Science, Ltd., Kínában.