A zsírellenes májműködés transzkriptóm elemzése Campari paradicsommal zebrafish diéta által kiváltott elhízási modell alkalmazásával

Absztrakt

Háttér

A növényi termékek magas étrendi bevitele előnyös az elhízás és az ahhoz kapcsolódó betegségek, például a diszlipidémia, az alkoholmentes zsírmájbetegség és a rák ellen. Korábban kidolgoztunk egy étrend által kiváltott zebrafish-elhízási modellt (DIO-zebrafish), amely zsigeri adipozitást, diszlipidémiát és májsteatózist fejleszt ki. A zebrafish egy polifág állat; így feltételeztük, hogy a DIO-zebrafish felhasználható a zöldségek elhízás elleni hatásainak transzkriptóm elemzésére.

Eredmények

Minden zöldség különböző hatásokat mutatott az elhízás ellen. A „Campari” paradicsomra összpontosítottunk, amely elnyomta a testtömeg, a plazma TG és a lipidcseppek növekedését a DIO-zebrafish májban. A campari paradicsom csökkent srebf1 mRNS az foxo1 génexpresszió, amely függhet a törzs magas β-karotin tartalmától.

Következtetések

A Campari paradicsom javítja az étrend által kiváltott elhízást, különösen a dyslipidaemiát és a máj steatosisát a lipogenezissel kapcsolatos génexpresszió csökkentésével. A DIO-zebrafish képes megkülönböztetni a különböző zöldségtörzsek elhízásellenes hatásait, és hatékony eszközzé válik az eredmények felmérésére és a természetes termékek elhízásellenes hatásainak új mechanizmusainak megtalálására.

Háttér

Felépítettük az étrend okozta elhízási modellt a zebrafish (DIO-zebrafish) Artemia magas zsírtartalmú étrendként [11]. A testtömeg, a plazma TG és a máj steatosis növekedése, amely ebben a modellben látható, nagymértékben összhangban van az embereknél megfigyelt elhízással és a DIO rágcsáló modelljeivel. Az adipozitású célszervek, például a máj és a zsigeri zsír szövettani konfigurációja szintén hasonló [11, 12]. Ezenkívül a zsigeri zsír fő génexpressziós profilja is megegyezik az emberével [11]. A DIO-zebrafish modellnek számos előnye van. A zebrafish válasza Artemia nagyon jó; szinte minden, ezekkel a szervezetekkel táplált zebrafish elhízottabbá válik, homogénebb, mint a rágcsáló modellek. A DIO-zebrafish könnyű létrehozni, és csak 2 hét szükséges az elhízás kiváltására. Ezen túlmenően, a zebrafish egy polifág állat, amely lehetővé teszi in vivo szűrés a tesztvegyületek orális beadásával. Előzetes tanulmányunkban a zebrafish sokféle zöldséget - többek között tököt, padlizsánt, uborkát, zöldpaprikát és brokkolit -, szemeket, köztük rizst, és babot is elfogyaszthat a szokásos halételek, például a Tetramin ® keverékeként. Így a zebrafish megfelelő állatmodelltá válhat az etetési kísérletben az élelmiszer-összetételek emberi elhízással szembeni hatásainak értékelésére.

Mód

Etikai jóváhagyás

A vizsgálat megfelelt a Mie Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága által megállapított etikai irányelveknek.

Anyagok

A paradicsomot (Delica törzs), a sütőtöket (Ebisu és Kurimasaru törzs) és a tojásnövényeket (Choshi és Senryo) a Delica Foods-tól (Tokió, Japán) vásároltuk. Mivel a Delica törzs vörös típusú paradicsom, amely széles körben kapható a japán szupermarketekben, meghatároztuk "szokásos" paradicsomként. A campari paradicsomokat az IDE Farmtól vásárolták (más néven Shio-Tomato, Kumamoto, Japán). Ezekről a zöldségekről az 1. kiegészítő fájl S1. Ábrája látható. A likopint (L9879) a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) szereztük be.

Növényi és likopintartalmú halételek készítése

Először minden zöldséget folyékony fázissá homogenizáltunk egy otthoni használatra szánt standard keverővel (MX-X37, National, Japán). A zöldséglevet egy éjszakán át -80 ° C-on tároltuk. A fagyasztott levet ezután liofilizáltuk (DC-400, YAMATO SCIENTIFIC, Japán). Amikor a szárítás befejeződött, ugyanolyan térfogatú (tömeg) vizet és kereskedelmi forgalomban kapható pelyhes ételeket (Tetramin tropical flakes, Tetra, Németország) adtunk a növényi porhoz, és összekevertük, így 50% fagyasztva szárított növényi port tartalmazó keveréket kaptunk. Ezt követően az elegyet -80 ° C-on tároltuk, majd újra liofilizáltuk. A likopintartalmú haleledel elkészítéséhez a likopint etanolban szuszpendáljuk és Tetraminnal összekeverjük 0,74 μg/ml végkoncentrációig. Szárítás után mozsárban és mozsárban gondosan szemcsékké őrölték (nem porrá). Annak érdekében, hogy a granulátum méretét úgy állítsuk be, hogy alkalmas legyen a felnőtt zebrak halászatára, az őrlési eljárást addig ismételjük, amíg az összes granulátum áthaladhat egy 700 μm-es szitán. A granulátumokat nitrogéngázzal öblítettük, fénytől védve, és felhasználás előtt alikvotokban 4 ° C-on tároltuk. Tetramint, amelyet vízzel egyszer homogenizáltunk, majd liofilizáltunk, kontroll kontroll ételként használtuk.

Zebrafish etetés és kísérleti tervezés

Felnőtt zebrafish (AB, ZIRC, Eugene, OR, USA) 28 ° C-on tartottuk 14 órás fény: 10 órás sötét ciklus alatt, és a környezeti minőségű Zebrafish könyv [13]. Zebrafish-t osztottak minden étrendi csoportba 2 vagy 4 hétre, 5 hal/1,7 literes tartállyal. A túltáplálási csoportba tartozó zebrahalakat naponta háromszor etették Artemia (60 mg ciszták/hal/nap; Miyako Kagaku, Tokió, Japán). A kontrollcsoport zebrakjait naponta egyszer etették reggel Artemia (5 mg ciszták/hal/nap) 3,5 hónapos termékenyítés után (mpf). A zebrafish-t zöldségtartalmú pelyhes táplálékkal (2 mg/nap) háromszor etették 20 perccel korábban Artemia etetés a kísérletek alatt (1A. ábra).

A testtömeg, a plazma TG és a vércukorszint mérése

A vizsgálat során hetente mérték a testtömeg és a zebrafish hosszát. A zebrafish hosszát a test végétől a végéig mérték. A vérkémiai elemzésekhez a zebrafish-t egyik napról a másikra tápláléktól megfosztották, és a heparinizált üvegkapilláris tűvel (GD-1; Narishige, Tokió, Japán) a jelzett időpontokban vért vettek ki a hátsó artériából. A vércukorszintet kézi vércukormérővel határoztuk meg (Glutest Neo, Sanwa Kagaku Kenkyusho, Nagoya, Japán). A plazma TG meghatározásához a vérmintákat 3 percig, 3, 500 fordulat/perc mellett szobahőmérsékleten centrifugáltuk, és a plazmát összegyűjtöttük; A triglicerideket Wako L-típusú TG készlettel (Wako Pure Chemical Industries, Tokió, Japán) mértük a gyártó protokolljának megfelelően.

Táplálék mennyiségi vizsgálata

A takarmány mennyisége Artemia hetente mértük a vizsgálat során. Kikelt Artemia (5 vagy 60 mg cisztát/hal/nap) tápláltunk zebrafish-ba 1,7 literes akváriumban a fent leírtak szerint. A vak (nincs hal) ellenőrzéshez, Artemia egy üres, 1,7 literes tartályba tették zebrak (csak tenyészvíz) nélkül. 2 óra elteltével a Artemia A zebrafish által el nem fogyasztott mennyiségeket háromszor megszámoltuk, és levontuk a kontroll akváriumban levő mennyiségből az etetési szám meghatározásához Artemia minden tartályban.

Karotinoidok, cukortartalom, aszkorbinsav és NO3 meghatározása

Paradicsomtartalmú halételek DPPH gyökfogó aktivitásának mérése

A paradicsomtartalmú halételek l, 1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) gyökfogó aktivitását egy korábban ismertetett módszerrel mértük [21]. Röviden, a nyers anyag egy részét feloldottuk 200 μl EtOH-ban, összekevertük 800 μl 100 mM Tris-HCl pufferrel (pH 7,4), majd hozzáadtuk 1 ml 500 μM etanolos DPPH-hoz. Az elegyet erőteljesen rázzuk, és 20 percig hagyjuk szobahőmérsékleten, sötétben. A reakcióelegy 60 μl-es mintájának DPPH gyökfogó aktivitását fordított fázisú HPLC analízissel határoztuk meg. Az elemzéseket TSKgel Octyl-80TsQA oszlopban (4,6 × 250 perc, Tosoh, Tokió, Japán) szobahőmérsékleten, MeOH/H2O (7: 3, v/v) mozgófázissal végeztük 0,8 ml/perc áramlási sebességgel. min. A csúcsokat 517 nm-en beállított UV detektorral követtük nyomon. A DPPH elszíneződésének százalékos gátlását a mintakivonattal Trolox-ekvivalens/100 grammban fejeztük ki (μmol TE/100 g) [22].

Olajvörös O festés

A májszöveteket sebészi manipulációval sztereoszkópos mikroszkóp alatt (MZ16F; Leica Microsystems, Wetzlar, Németország) gyűjtöttük össze. A májokat 10% -os pufferelt formalin oldattal (Histo-Fresh; Pharma, Tokió, Japán) rögzítettük. A rögzített mintákat szacharóz-oldatba (Wako) helyeztük 4 ° C-on 3 órán át, majd gyorsan fagyasztottuk folyékony nitrogénnel hűtött izopentánban (Wako), beágyazva a Tissue-Tek-be (Sakura Finetek, Tokió, Japán), és kriosztáttal ( Microm HM-550; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). A metszeteket 15 percig olajvörös O (Wako) munkaoldatába merítettük, és desztillált vízzel leöblítettük a korábban leírtak szerint [23]. A metszeteket Mayer hematoxylinnel (Wako) is ellenfestették, hogy a mag protokolljait a gyártó protokollja szerint jelenítsék meg.

DNS mikroarray elemzés

Kvantitatív RT-PCR

Minden minta teljes RNS-ét a fent leírtak szerint tisztítottuk. Az első szálú cDNS-t 500 ng teljes RNS-sel állítottuk elő Super Script III első szálú rendszer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) és véletlenszerű primer (Invitrogen) alkalmazásával. A kvantitatív RT-PCR-t a Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) segítségével három példányban, a gyártó protokolljának megfelelően végeztük. A láncindítók szekvenciáját a 2. kiegészítő fájl S1 táblázata mutatja be. Az adatokat a béta aktin mennyiségével normalizáltuk (actb, NM_131031); ez lehetővé tette számunkra a kezdeti sablonkoncentráció bármilyen változásának, valamint a reverz transzkripciós reakció konverziós hatékonyságának figyelembe vételét.

Statisztikai analízis

Minden adatot átlag ± SEM-ként adunk meg. A 2 csoport közötti különbségeket statisztikai szignifikancia szempontjából vizsgáltuk a Student's-szel t-teszt. Többszörös összehasonlításhoz egyirányú ANOVA-t, majd Bonferroni-Dunn többszörös összehasonlítási eljárást alkalmaztunk. A P-érték

Eredmények és vita

A Campari paradicsom magas elhízásellenes hatást mutat a DIO-zebrafish-ban

Összehasonlítva a pelyhes ételekkel, amelyeket a zebrafish [13] etetésére is használtak, a zsír és fehérje mennyisége Artemia magasabbak, illetve alacsonyabbak, míg a szénhidrát mennyisége összehasonlítható [24]. A zebrafish 5 vagy 60 mg frissen kikelt Artemia napi fogyasztotta a biztosított 80% -át és 50% -át Artemia, fordítva 20, illetve 150 cal-ra. Mivel a zebrafish fenntartási energiaigénye az 1. táblázat: Karotinoidok, cukortartalom, aszkorbinsav és NO3 - meghatározás Campariban és a szokásos paradicsomban

DIO-zebrafish paradicsommal végzett máj transzkriptóm elemzése

A Campari paradicsom máj steatosis elleni terápiás mechanizmusának feltárására DNS mikroarray kísérleteket végeztünk e zebrafish májszöveteinek felhasználásával. A DIO-zebrafish-ban táplált Campari paradicsomban 116 és 52 próba expressziója növekedett (> 1,3) és csökkent (2. táblázat: a biológiai hálózatokból származó gének QPCR-je a Campari paradicsom kezelésben a rendszeres törzshez képest

Campari paradicsomkezelés májának útelemzése. Az IPA által 90 emberi ortológ segítségével azonosított biológiai hálózatok megváltoztak a Campari paradicsomkezelés során. A csomópont színének intenzitása az upreguláció (piros) és a downregulation (zöld) nagyságát jelzi. (A) 1. hálózat, összefügg a lipid anyagcserével. (B) 2. hálózat, szintén a lipid anyagcseréhez kapcsolódik. (C) A 3. hálózat a rák kompromisszumához kapcsolódik. Ezeknek a hálózatoknak a pontszámát a 2. táblázat ismerteti. Folyamatos nyíl, indukció és/vagy aktiválás; folytonos vonal nyílfej nélkül, kötés; szaggatott nyíl, elnyomás és/vagy gátlás.

Következtetések

Transzkriptómprofilokkal kapcsolatos megfigyeléseink a Campari paradicsom lipidcsökkentő tulajdonságát mutatják be a DIO-zebrafish-ban a lipogenezissel kapcsolatos génexpresszió csökkentése révén. A DIO-zebrafish megkülönböztetheti a zöldségek különböző elhízásellenes hatásait, és felhasználható az elhízással kapcsolatos betegségek, különösen a zsíros májbetegségek elleni cselekvési mechanizmusok azonosítására. Ez az első olyan vizsgálat, amelyben a zebrafish-t használták az élelmiszerek értékeléséhez.

A szerzők információi

Toshiyuki Tainaka a Delica Foods fejlesztési részlegének igazgatója és posztgraduális hallgató a Mie Egyetem Orvostudományi Karán. Tainaka úr kutatásának középpontjában a zöldségek egészségfejlesztő funkciója áll.

Yasuhito Shimada, MD, a Mie Egyetem Orvostudományi Doktori Iskola Molekuláris és Sejtes Farmakológiai, Farmakogenomikai és Farmakoinformatikai Tanszékének tanársegédje. Dr. Shimada kutatásának középpontjában az elhízás megelőzésének tanulmányozása áll, a zebrafish étrend által kiváltott elhízási modelljének felhasználásával.

Yuhei Nishimura, Ph.D., a Mie Egyetem Orvostudományi Doktori Iskolájának Molekuláris és Sejtfarmakológiai, Farmakogenomikai és Farmakoinformatikai Tanszékének oktatója. Dr. Nishimura kutatási területe a bioinformatika és a farmakoinformatika.

Norihio Nishimura, PhD, a Mie Egyetem Orvostudományi Doktori Iskola Fordítástechnikai Orvostudományi Tanszékének professzora. Dr. Nishimura kutatási területe a mezőgazdasági biotechnológia és az élelmiszer-tudomány.

Toshio Tanaka, Ph.D., a Mie Egyetem Orvostudományi Doktori Iskolájának Molekuláris és Sejtfarmakológiai, Farmakogenomikai és Farmakoinformatikai Tanszékének professzora. Dr. Tanaka kutatásának középpontjában a gyógyszercélok azonosítása áll a farmakogenomikai megközelítés segítségével. Dr. Tanaka több mint 100 szakértő által áttekintett kutatási cikket és beszámolót tett közzé nemzetközi folyóiratokban.