Az akrilamid gélelektroforézis háttere

BISC411
A Sejt kísérleti molekuláris biológiája

A poliakrilamid-gél elektroforézis alapelvei (PAGE)

Erőteljes elektroforetikus technikákat fejlesztettek ki a makromolekulák molekulatömeg alapján történő elválasztására. A molekula mobilitása elektromos mezőben fordítottan arányos a molekulasúrlódással, amely a molekula méretének és alakjának eredménye, és közvetlenül arányos a molekula feszültségével és töltésével. A fehérjék feloldhatók elektroforetikusan egy félszilárd mátrixban, szigorúan a molekulatömeg alapján, ha meghatározott feszültség mellett módot találunk arra, hogy ezeket a molekulákat azonos mértékben és ugyanazon jelre töltsük fel. Ilyen körülmények között a molekulák mobilitása egyszerűen fordítottan arányos lenne a méretükkel.

Pontosan ezt az ötletet alkalmazzák a PAGE-ban a polipeptidek molekuláris súlyának megfelelő szétválasztására. A PAGE-ban az SDS (nátrium-dodecil-szulfát) anionos detergens megkötésével negatívan feltöltött fehérjék szétválnak a poliakrilamid-gél mátrixában egy elektromos mezőben, a molekulasúly szerint.
A poliakrilamid az N, N'-metilén-bisz-akrilamiddal (rövidítve BIS) térhálósított monomer molekula-akrilamid polimerizációjával jön létre. Az ammónium-perszulfát (APS) által generált szabad gyökök és az oxigént megkötő katalizátor (-N, N, N ', N'-tetrametil-etilén-diamin [TEMED]) szükségesek a polimerizáció megkezdéséhez, mivel az akrilamid és a BIS önmagában nem reagál vagy amikor összekeverik.

Az akrilamid-gél rendszerek kifejezett előnye, hogy az akrilamid és a BIS kezdeti koncentrációja szabályozza a gél térhálósodásának keménységét és mértékét. A gél keménysége viszont szabályozza a súrlódást, amelyet a makromolekulák tapasztalnak, amikor elektromos térben mozognak a gélen, és ezért befolyásolja az elválasztandó komponensek felbontását. A kemény gélek (12-20% akrilamid) jobban késleltetik a nagy molekulák vándorlását, mint a kicsiek. Bizonyos esetekben a nagy koncentrációjú akrilamid-gélek olyan szorosak, hogy kizárják a nagy molekulák bejutását a gélbe, de lehetővé teszik a komplex keverék kis molekulatömegű komponenseinek migrációját és felbontását. Alternatív megoldásként egy laza gélben (4-8% akrilamid) a nagy molekulatömegű molekulák sokkal messzebbre vándorolnak a gélen lefelé, és egyes esetekben azonnal kimozdulhatnak a mátrixból.

SDS poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE)

A nátrium-dodecil-szulfát (SDS vagy nátrium-lauril-szulfát) egy anionos detergens, amely denaturálja a fehérjemolekulákat anélkül, hogy megszakítaná a peptidkötéseket. Erősen kötődik az összes fehérjéhez, és nagyon magas és állandó töltés: tömeg arányt hoz létre az összes denaturált fehérjéhez. SDS-kezelés után, függetlenül a natív töltetektől, minden fehérje magas negatív töltésűvé válik.

A fehérjék denaturálását úgy végezzük, hogy oldható tiol-redukálószert (például 2-merkaptoetanolt, ditiotreitolt) és SDS-t tartalmazó pufferben melegítjük őket. A merkaptoetanol a cisztein maradékok összes diszulfidkötését szabad szulfhidrilcsoportokká redukálja, az SDS-ben történő melegítés pedig megszakítja az összes intra- és intermolekuláris fehérje kölcsönhatást. Ez a kezelés egyedi polipeptidláncokat eredményez, amelyek a detergens megkötése által indukált felesleges negatív töltést és azonos töltés: tömeg arányt hordoznak. Ezután a denaturált fehérjéket elektroforetikusan szigorúan, méretük alapján, SDS-t és tiol-redukálószereket tartalmazó pufferolt poliakrilamid-gélben oldhatjuk fel.

Az SDS-PAGE gélrendszerek rendkívül hasznosak a komplex fehérjekeverékek elemzésében és feloldásában. Ennek a technikának számos alkalmazása és módosítása releváns a modern kísérleti biológusok számára. Néhányat az alábbiakban említünk. Alkalmazzák őket az enzimtisztítás monitorozására, az oligomer fehérjék alegység-összetételének meghatározására, a szubcelluláris organellák és membránok fehérje-komponenseinek jellemzésére, valamint a vad típusú organizmusok fehérje-kivonatainak és az összenyomható mutánsoknak a specifikus fehérjék hozzárendelésére. Ezenkívül a polipeptidek mobilitása az SDS-PAGE gélrendszerekben arányos a molekulatömegük logaritmusának inverzével. Ez a tulajdonság lehetővé teszi egy ismeretlen fehérje molekulatömegének mérését +/- 5% pontossággal, gyorsan, olcsón és reprodukálhatóan.

Folyamatos SDS poliakrilamid gél elektroforézis

A koronggéleket két különböző akrilamid-gél alkotja, egyik a másik felett. A felső vagy egymásra rakódó gél 4-5% akrilamidot (nagyon laza gél) tartalmaz, gyengén pufferelve, pH-ja 9,0. Az alacsonyabb felbontású gél (gyakran futó gélnek hívják) magasabb akrilamid-koncentrációt vagy akrilamid-gradienst tartalmaz, erősen pufferelve 9,0 pH-n. Mindkét gél önthető csövekként üveg- vagy műanyag palackokban (csőgélek), vagy vékony lemezekként az üveglemezeken belül, amely elrendezés jelentősen javítja a felbontást, és lehetővé teszi sok fehérjeminta egyszerre történő elemzését és összehasonlítását ugyanaz a gél (födémzselék). Ma födémgéleket fog készíteni és futtatni.

Az ionerősség-diszkontinuitás a laza halmazállapotú gél és a keményen futó gél között feszültség-megszakadáshoz vezet, amikor áramot alkalmaznak. Ezeknek a géleknek a célja a fehérjemolekulák felbontásának maximalizálása azáltal, hogy a mintát egy ultravékony (1-100 nm) zónába redukáljuk és koncentráljuk a halmozó gél: futó gél határán. A fehérjemintát a halmozó gél mélyedésébe viszik fel, meglehetősen hosszú folyadékoszlopként (0,2-0,5 cm), a gél vagy a cső mennyiségétől és vastagságától függően. A fehérjeminta glicerint vagy szacharózt tartalmaz, így egy futó pufferrel lehet átfedni. Ezt a puffert futópuffernek nevezzük, és az elrendezés olyan, hogy a gél teteje és alja futópufferben van, hogy áramkört hozzon létre.

Az áram alkalmazásával a fehérjék lefelé vándorolnak a halmozó gélen keresztül a pozitív pólus felé, mivel a megkötött SDS negatívan tölti fel őket. Mivel az egymásra rakódó gél nagyon laza, az alacsony és átlagos molekulatömegű fehérjék nem akadályozódnak migrációjukban és sokkal gyorsabban mozognak, mint a futó gélben. Ezen túlmenően, a halmozó gél alacsonyabb ionerőssége (gyenge puffer) nagy elektromos ellenállást eredményez (azaz nagy elektromos mező V/cm), hogy a fehérjék gyorsabban mozogjanak, mint a futó gélben (nagy ionerősség, kisebb ellenállás, ezért alacsonyabb elektromos tér, V/cm). Ne feledje, hogy az alkalmazott feszültség áramot eredményez a gélben az ionok migrációján keresztül. Ezért az alacsony ionerősség nagy ellenállást jelent, mivel kevesebb ion van jelen a feszültség eloszlásához, és az elektromos mező (V/cm) megnövekszik, ami a nagymértékben polianionos fehérjék gyors vándorlását eredményezi.

A fehérjék gyors vándorlása a gélen keresztül azt eredményezi, hogy nagyon vékony zónaként halmozódnak fel és halmozódnak el a gél/futó gél határán, és ami a legfontosabb, mivel a 4-5% -os gél csak kis mértékben befolyásolja a nagy komponensek mobilitását. A verem a keverékben lévő fehérjék mobilitási sorrendjében van elrendezve. Ez a halmozási hatás kiváló felbontást eredményez a futó gélen belül, ahol a polipeptidek sokkal lassabban lépnek be és vándorolnak méretüknek és alakjuknak megfelelően.

Valamennyi gélrendszerben nyomkövető festéket (általában bróm-fenol-kéket) visznek be a fehérjemintával, hogy meghatározzák azt az időpontot, amikor a műveletet le kell állítani. A brómfenol kék egy kis molekula, amely lényegében akadálytalanul halad közvetlenül a gél alja felé haladó ionfront mögött. Kevés fehérjemolekula utazik a nyomkövető festék előtt. Amikor a festékfront eléri a futó gél alját, az áramot kikapcsolják, hogy megbizonyosodjanak arról, hogy a fehérjék nem elektroforizálódnak ki a gélből a puffertartályba.

A fehérjék megjelenítése

A géleket eltávolítjuk a csövekből vagy az üveglemezekről, és festékkel (Coomassie Brilliant Blue) festjük. A Coomassie kék erősen kötődik az összes fehérjéhez. A meg nem kötött festéket a gél nagymértékű mosásával távolítják el. A kék fehérje sávok ezután elhelyezhetők és számszerűsíthetők, mivel a kötött festék mennyisége arányos a fehérjetartalommal. A festett gélek száríthatók és konzerválhatók, fényképezhetők vagy szkennelhetők egy rögzítő denzitométerrel az egyes fehérjecsíkok színének intenzitásának mérésére. Alternatív megoldásként, ha a fehérjék radioaktívak, a fehérjeszalagok autoradiográfiával detektálhatók, amely technika a modern sejt- és molekuláris biológiában széles körben alkalmazható. Amikor a géleket olyan vékony lemezekként készítik elő, hogy a felbontás maximalizálható legyen, mint manapság, az akrilamid lemezeket eltávolítják a tartóüveg lemezekről és szűrőpapíron szárítják. Egy darab röntgenfilmet helyeznek és szorosan rögzítenek a szárított födém felett egy fénybiztos dobozban. A röntgenfilmet a fehérje sávokban található radioaktivitás exponálja, és kialakulása után sötét foltok vagy sávok láthatók a filmen. Ezek a sötét sávok viszont számszerűsíthetők, mivel intenzitásuk arányos a radioaktivitás mennyiségével, és ezáltal a fehérjetartalommal.