Az aldehid-dehidrogenáz-2 csillapítja a magas zsírtartalmú étrend okozta szívizom-átalakulást és kontraktilis diszfunkciót

Yuguo Chen, PhD és Xiaoxing Li, PhD

Qilu Kórház, Shandong Egyetem

107 Wenhua Xi Road, Jinan, Shandong 250012 (Kína)

E-mail: [email protected], [email protected]

Kapcsolódó cikkek a következőhöz: "

Facebook
Twitter
LinkedIn
Email

Absztrakt

Bevezetés

A magas zsírtartalmú (HF) étrend krónikus fogyasztása metabolikus szindrómához (SM) vezet, amelyet számos anyagcserezavar jellemez, beleértve az elhízást, a csökkent glükóz toleranciát és a magas triglicerid szintet [1]. A HF-diéta által kiváltott elhízás a reaktív oxigénfajok (ROS) fokozott generációjával jár, amelyek oxidatív stresszt váltanak ki a szervezetben [2]. Az elhízás által kiváltott oxidatív stressz kardiovaszkuláris szövődményeket okoz, ideértve a lipotoxikus kardiomiopátiát is, amelyek szívizom-átalakulásként és szívműködési zavarként nyilvánulhatnak meg [3]. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a glükóz/lipid anyagcsere rendellenesség és a magas vérnyomás hozzájárul a bal kamra szerkezetének és működésének változásához [4-6].

A 2-es típusú mitokondriális aldehid-dehidrogenáz (ALDH2) kulcsfontosságú enzim, amely részt vesz a szívvédelemben [7]. Az ALDH2 aktiváció szorosan korrelál a kardioprotektív hatásokkal számos modellrendszerben [8-10]. Az ALDH2-t számos útvonal aktiválja, beleértve a c-Jun N-terminális kináz (JNK)/aktivált protein-1 (AP-1) útvonalat, amely fontos szerepet játszik a szív átalakításában és a sejtek apoptózisában [11, 12]. A JNK számos mitokondriális és magfehérje aktivitását foszforilezéssel szabályozza [13]. Különösen a JNK/AP-1 jelátviteli út megkönnyítheti az oxidatív stressz által kiváltott inzulinrezisztenciát és a szívizom hipertrófiáját [14, 15]. Továbbá az 1 inzulinreceptor szubsztrát (IRS-1) és a szerin-treonin protein kináz Akt szabályozza az oxidatív stresszel járó inzulinrezisztenciát és a sejtek apoptózisát [16, 17]. Az ALDH2 az autofágia szabályozásával és a SUV39H-Sirt1-függő PGC-1α dezacetilációval kapcsolatos mechanizmus révén véd a szívműködési rendellenességektől a HF-diéta által kiváltott elhízás ellen [18]. Az azonban továbbra sem világos, hogy az ALDH2 szabályozza-e a JNK/AP-1 vagy az IRS-1/Akt jelátviteli utakat az MS által kiváltott szívizom-átalakítás során.

Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk az ALDH2 protektív szerepét az MS által kiváltott lipotoxikus kardiomiopátiában, és feltártuk a mögöttes jelátviteli mechanizmust. Elõállítottuk az MS egér modelljét; ebben a modellben túlexpresszáltuk az ALDH2-t annak meghatározására, hogy az ALDH2 gátolja-e az oxidatív stresszt és az inzulinrezisztenciát, és véd-e a HF-diéta által kiváltott szívműködési zavarokkal és a szívizomszövet károsodásával szemben. Ezenkívül feltártuk az ALDH2 túlexpresszióval járó kardioprotektív mechanizmusokat, különös tekintettel a JNK/AP-1 és IRS-1/Akt jelátviteli utakra.

Anyagok és metódusok

Kísérleti állatok

Testtömeg mérés és szerológiai vizsgálat

Havi rendszerességgel vénás vért gyűjtöttek egy éjszakai éhgyomri után. A szérum koleszterin, a trigliceridek (TG), az alacsony sűrűségű lipoprotein – koleszterin (LDL-C), a HDL-C, az éhomi vércukor (FBG) és az éhomi inzulin (FINS) éhomi koncentrációit az osztály klinikai laboratóriumában (Qilu Hospital a kínai Jinan Shandong Egyetemmel áll kapcsolatban). Az inzulinrezisztencia indexet (IRI) a következő képlet alapján számítottuk ki: IRI = (FBG × FINS)/22,5, a korábban leírtak szerint [19].

Echokardiográfiai értékelés

A szív szerkezetének és működésének vizsgálatához az egereket 1% izofluránnal altattuk és kétdimenziós irányított M-módú echokardiográfiával értékeltük egy 30 MHz-es jelátalakítóval ellátott Vevo 770 eszközön (RMV 707B; Visual Sonics, Toronto, Kanada). Bal kamra végdiasztolés átmérője (LVEDD), bal kamra vége szisztolés átmérője (LVESD), bal kamrai vég diasztolés térfogata (LVEDV), bal kamrai vég szisztolés térfogata (LVESV), kamrai szeptum vastagsága (IVSd) és bal kamra posterior az F-vastagságot a végdiasztolában (LVPWd) rögzítettük az M-módú képekből. Az ejekciós frakciót (EF) és a frakcionált rövidülést (FS) az alábbiak szerint számítottuk: EF = (LVEDV – LVESV)/LVEDV × 100%; FS = (LVEDD – LVESD)/LVEDD × l00%, az előzőekben leírtak szerint [20]. Az összes echokardiogramot egy tapasztalt személy végezte kézi szondával. A paramétereket öt egymást követő ciklus alatt mértük.

Szövettani vizsgálat

Az érzéstelenítést és az eutanáziát követően a bal kamra egy részét kivágtuk, foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) öblítettük és azonnal 10% semleges pufferelt formalinban rögzítettük. A mintákat paraffinba ágyaztuk, 5 μm-es szakaszokra vágtuk, és hematoxilinnal és eozinnal (HE), valamint Masson trichromjával (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) festettük. A Masson kék festés százalékos arányát 10 véletlenszerűen kiválasztott mezőben határoztuk meg, mindegyik egér három nem egymást követő soros szakaszának minden szakaszán. A megmaradt szívszövetet -80 ° C-on lefagyasztották a Western-blottolás és az ALDH2 enzimatikus aktivitás kimutatása céljából.

Transzmissziós elektronmikroszkópia

A szívizom kb. 2,5 mm3 egy részét 2,0% glutáraldehiddel rögzítettük elektronmikroszkópos vizsgálat céljából. A metszeteket H-7000FA transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgáltuk (Hitachi Co. Ltd., Tokió, Japán).

A mitokondriális ALDH2 aktivitás mérése

A mitokondriális ALDH2 aktivitást szobahőmérsékleten, 33 mM nátrium-pirofoszfátot, 0,8 mM NAD +, 15 mM propionaldehidet és 50 μg fehérjét tartalmazó pufferben mértük. Az ALDH2 szubsztrátumát ecetsavvá oxidálták, míg a NAD + NADH-vá redukálódott. A NADH termelést az abszorbancia 340 nm-en történő mérésével határoztuk meg. Az ALDH2-aktivitást nmol NADH-ként fejeztük ki percenként mg fehérje értékre számítva.

A terminális dezoxinukleotidil-transzferáz által közvetített dUTP nick end jelöléses vizsgálat

A kamrai szövet metszeteit (5 μm vastagságú) paraffinba ágyazottuk és proteináz K oldatban inkubáltuk 30 percig. Ezután a metszeteket egy terminális dezoxinukleotidil-transzferáz által közvetített dUTP nick end label label (TUNEL) készlettel (Roche, Basel, Svájc) festettük a gyártó protokolljainak megfelelően. A magokat DAPI festéssel azonosítottuk. A TUNEL-pozitív sejteket fluoreszcens mikroszkóppal (Olympus, Tokió, Japán) számoltuk meg 400-szoros nagyítással, és kiszámítottuk az apoptotikus sejtek százalékos arányát.

A mitokondriális membránpotenciál mérése

A mitokondriális membránpotenciál változását (ΔΨm) a JC-1 fluoreszcens szondával (Life Technologies, Carlsbad, CA) határoztuk meg. A megtisztított mitokondriumokat JC-1-vel festettük 37 ° C-on 20 percig, és áramlási citometriával (FACSCalibur; BD, Franklin Lakes, NJ) vagy konfokális mikroszkóppal elemeztük. A fluoreszcencia emissziót 530 nm-en mértük a JC-1 monomer formájánál (zöld), és 590 nm-nél a JC-1 aggregátumoknál (piros). A ΔΨm csökkenését jelzi a fluoreszcencia csökkenése 590 nm-en.

ROS mérése

Az intracelluláris ROS mérésére diklór-dihidrofluoreszcein-diacetát (DCFH-DA) fluoreszcenciát (Life Technologies) használtunk. A kardiomiocitákat 5 mM DCFH-DA-val inkubáltuk 20 percig, 37 ° C-on Hank kiegyensúlyozott sóoldatában, PBS-sel öblítettük, teljes Dulbecco módosított Eagle-táptalajban visszanyertük, és azonnal lézerszkennelésű konfokális mikroszkóppal elemeztük (LSM710 modell; Zeiss, Jena, Németország). A fluoreszcencia intenzitását Image-Pro Plus szoftverrel (Media Cybernetics, Atlanta, GA) mértük.

Immunhisztokémiai festés

A metszetek viaszmentesítése és rehidratálása után az antigén-visszakeresést 15 percig végeztük 1% -os citromsavpufferben (pH 6,0) 92–98 ° C-on. A tárgylemezeket szobahőmérsékleten 30 percig hűtöttük, PBS-sel öblítettük, és 20 percig inkubáltuk 5% szarvasmarha-szérum albuminnal a nem specifikus kötődés gátlására. A tárgylemezeket egy anti-4-hidroxinonenal (4-HNE) antitesttel (1: 200; nyúl poliklonális anti-egér; Sigma-Aldrich) inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on, majd biotinilezett anti-nyúl IgG szekunder antitesttel inkubáltuk. DAB szubsztrát készletet (Vector Laboratories, Burlingame, CA) használtunk az immunhisztokémiai reakció kimutatására.

Western blot elemzés

A fehérjéket nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk és nitrocellulóz membránokra helyeztük. A membránokat 5% zsírmentes tejjel blokkoltuk, és specifikus primer antitestekkel inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on. A p-JNK, IRS-1, p-IRS-1, Akt és p-Akt elleni antitesteket a Cell Signaling Technology-tól (Beverly, MA), az ALDH2 és a kaszpáz 3 elleni antitesteket a Santa Cruz Biotechnology-tól (Santa Cruz) szereztük be., Kalifornia). Anti-AP-1 antitestet vásároltak az Abcam-tól (Cambridge, MA). A membránokat torma-peroxidázzal kapcsolt másodlagos antitestekkel inkubáltuk. A membránokat ECL Prime reagensek (GE Healthcare, Piscataway, NJ) felhasználásával fejlesztettük ki, és a kemilumineszcenciát LAS-4000 lumineszcens képelemzővel (Fujifilm, Stamford, CT, USA) detektáltuk. A denzitometriás elemzést ImageJ szoftver segítségével végeztük (National Institute of Health, Bethesda, MA).

Valós idejű PCR

A teljes RNS kivonásához a TRIzol-reagenst (Invitrogen) használtuk. A teljes RNS-koncentrációt NanoDrop ND-1000 spektrofotométerrel (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) határoztuk meg. Az első szál cDNS szintézisét véletlenszerű primerek és TaqMan reverz transzkripciós reagensek alkalmazásával hajtottuk végre (Applied Biosystems, Foster City, CA). A valós idejű PCR-t előre megtervezett TaqMan szonda-primer készletek és a Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) segítségével Prism 7500 rendszerben (Applied Biosystems) végeztük, kivéve a DLL4-et, amelyet SYBR Green módszerrel mértünk SsoFast EvaGreen alkalmazásával. Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornia). A specifikus primerek szekvenciája a következő volt: I. kollagén: sense 5′-GTTCCTCCCAGCTCTCCATCAAGA-3 ’és antiszensz 5′-GCTCTGGTCACAGGGTCTCATCTC-3’; kollagén III: sense 5′-GGCTTCCTGCTCTTCCATCTCTTA-3 ’és antiszensz 5′-CCTTCTCTAGGCGGCAAGTGACCT-3’; és transzformáló növekedési faktor (TGF) -β1: sense 5′-TTGCTTCAGCTCCACAGAGA-3 ’és antiszensz 5′-TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC-3’. Az mRNS szinteket β-aktinná normalizáltuk. A relatív mRNS expressziót 2 –∆∆Ct módszerrel értékeltük.

Statisztikai analízis

Az adatokat az átlag ± az átlag standard hibájaként (SEM) mutatjuk be. Az összehasonlításokat egyirányú varianciaanalízissel végeztük, amelyet Tukey – Kramer post hoc teszt követett. P