Az alltransz-retinsav elnyomja az elhízást és az inzulinrezisztenciát azáltal, hogy aktiválja mind a peroxiszóma-proliferációval aktivált β/δ receptorokat, mind a retinsav-receptorokat

  • Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
  • Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
  • Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
  • Levelezés céljából: [email protected]

ABSZTRAKT

Az all-transz-retinsav (RA) számos biológiai aktivitását a ligandum által aktivált transzkripciós faktorok, retinolsav receptorok (RAR), közvetítik, de ez a hormon aktiválhatja a nukleáris receptor peroxiszóma proliferációval aktivált β/δ (PPARβ/δ). Itt megmutatjuk, hogy az adipocita differenciálódás az RA jelátvitelének elmozdulásával jár, amely érett adipocitákban lehetővé teszi az RA számára mind a RAR, mind a PPARβ/δ aktiválását, ezáltal fokozza a lipolízist és kimeríti a lipidkészleteket. Az étrend által kiváltott elhízási egérmodell felhasználásával végzett in vivo vizsgálatok azt mutatták, hogy az elhízás kialakulását a zsíros PPARβ/δ expresszió és aktivitás csökkentése kíséri. Az elhízott egerek RA kezelése a lipid homeosztázis szabályozásában szerepet játszó PPARβ/δ és RAR célgének expresszióját indukálta, ami súlyvesztéshez és javított inzulinreakcióhoz vezetett. Az RA-kezelés szintén visszaállította a zsíros PPARβ/δ expressziót. Az adatok azt mutatják, hogy az elhízás és az inzulinrezisztencia RA általi elnyomását nagyrészt a PPARβ/δ közvetíti, és ezt tovább fokozza a RAR aktiválása. Két nukleáris receptor megcélzásával az RA egyedülállóan hatékony szer lehet a metabolikus szindróma terápiájában és megelőzésében.

all-transz-retinsav

Az A-vitamin metabolit all-transz-retinsav (RA) szabályozza a génexpressziót azáltal, hogy aktiválja a nukleáris hormon receptorokként ismert transzkripciós faktorok szupercsaládjának egyes tagjait. Régóta bebizonyosodott, hogy az RA számos biológiai aktivitását a retinsav receptorok (RARα, RARβ és RARγ) közvetítik (7, 23). A legújabb megfigyelések azonban azt mutatták, hogy az RA a RAR aktiválásán túl ligandumként is szolgálhat a nukleáris receptor peroxiszóma proliferációval aktivált β/δ (PPARβ/δ) receptorokhoz (32, 33, 37). A többi 1. alosztályi atomreceptorhoz hasonlóan a RAR-ok és a PPARβ/δ is heterodimerként funkcionálnak a retinoid X receptorral (RXR), és a motívum két közvetlen ismétléséből álló válaszelemeket (RE) hordozó célgének szabályozó régióihoz kötődve szabályozzák a transzkripciót. 5′-PuG (G/T) TCA. Az RXR-RAR heterodimerek kötődnek az RE-hez, amelyben az ismétlések 2 vagy 5 bp távolságra vannak egymástól (DR-2, DR-5) (21). Az RXR-PPAR heterodimerek RE-je egy DR-1-ből áll, amely kiterjesztett 5'-fél helyet, egy tökéletlen DR1-magot és egy adenint tartalmaz, mint távolságtartó nukleotidot (8). Ezekkel a heterodimerekkel történő ligandkötés receptoraktiválást eredményez, és általában növeli a célgének transzkripciójának sebességét.

A PPARβ/δ biológiai funkciói között különös jelentőséggel bír ennek a receptornak a részvétele az energiaegyensúly szabályozásában. Ezzel kapcsolatban beszámoltak arról, hogy a PPARβ/δ közvetlen célpontjainak repertoárja tartalmaz lipid- és glükóz-anyagcserében részt vevő géneket, és hogy ennek a receptornak az aktiválása növeli a lipid katabolizmust a vázizomban és a zsírszövetben, megakadályozza az elhízás kialakulását, javítja az inzulint érzékenység az elhízásra hajlamos egérmodellekben, és növeli az edzés állóképességét (3, 6, 18, 26, 41, 42). Következésképpen azt javasolták, hogy a PPARβ/8 agonisták hatékony anyagok lehetnek a metabolikus szindróma kezelésében (3). Azok a megfigyelések, amelyek szerint az RA PPARβ/δ ligandumként funkcionál, felkeltette annak az érdekes lehetőségét, hogy ez a hormon fontos szerepet játszhat a cukor és a lipid metabolizmusának és diszpozíciójának szabályozásában. A PPARβ/δ mellett a klasszikus RAR-ok is szerepet játszhatnak a lipid és az energia homeosztázisának szabályozásában. Például a rendelkezésre álló információk azt sugallják, hogy az 1-es fehérje (UCP1), az energia disszipációját közvetítő fehérje és az apolipoprotein A1 (apo A1), amely részt vesz a koleszterin és más lipidek plazma transzportjában, szétkapcsolását PPAR és RAR egyaránt szabályozhatja ( 14., 30., 31.).

Ennek alapján megvizsgáltuk, hogy vajon a PPARβ/δ és/vagy RAR-okon keresztüli jelzés alapozza-e az RA szerepét az energia homeosztázis szabályozásában. A tenyésztett adipociták és a magas zsírtartalmú/magas szénhidráttartalmú étrend által kiváltott elhízás-egér modell segítségével megmutatjuk, hogy az érett adipocitákban az RA mind a RAR-okon, mind a PPARβ/δ-n keresztül jelez az energia homeosztázis szabályozásában szerepet játszó több gén kifejeződésének előidézésére. és az inzulin válaszok. Bemutatjuk továbbá, hogy az RA beadása elhízott egereknek a zsírtömeg csökkenéséhez és a glükóz tolerancia javulásához vezet, és hogy ezek a hatások a PPARβ/δ és RAR aktiválásához vezethetők vissza a zsírszövetben, az izomban és a májban. A megfigyelések azt sugallják, hogy két RA-receptor aktiválására való képessége miatt az RA egyedülállóan hatékony ágens az adipozitás és az inzulinrezisztencia elnyomásában.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Reagensek. A CRABP-II elleni antitesteket Cecile Rochette-Egly (13) szolgáltatta. A FABP5 elleni antitestek a R&D Systems-től származnak. A glikogén-szintáz kináz 3β (GSK3β), a foszforilezett GSK3a/β, az Akt1 és a foszforilezett Akt1 ellenanyagok a Cell Signaling cégtől származnak. A RARα, RARβ és szukcinát-dehidrogenáz (SDH) elleni antitestek a Santa Cruz Biotechnologies cégtől származnak. A RARγ, a β-tubulin és a PPARβ/δ elleni antitestek az Affinity BioReagents, Sigma Aldrich és Abcam cégektől származnak. Egér- és nyúlellenes immunglobulin torma-peroxidázzal konjugált antitestek a Bio-Rad Laboratories cégtől származnak. Az Alexa Fluorhoz konjugált nyúl elleni immunglobulin G az Invitrogen cégtől származik. Az RA-t a Calbiochem cégtől vásárolták, az RA pelleteket az Innovative Research of America cégtől szerezték be. A 4 - [(E) -2- (5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalinil) -1-propenil] benzoesavat (TTNPB) és a GW0742-et a Biomol cégtől vásároltuk. International és Toronto Research Diagnostics, Inc., ill.

Biokémiai elemzések. A lipolízist és a triglicerid felhalmozódást Zen Bio lipolízis és triglicerid akkumuláció készlet alkalmazásával értékeltük. Sejt- és szövetkivonatokat, valamint immunblot-elemzéseket a korábban leírtak szerint hajtottunk végre (32). Az immunblotok denzitometriáját az ImageJ program (National Institutes of Health [NIH]) segítségével határoztuk meg. A valós idejű kvantitatív analízishez (Q-PCR) az RNS-t RNeasy minikit (74104 katalógusszám), RNeasy lipidszövet minikit (74804 katalógusszám) és RNeasy szálas szövet minikit (74704 katalógusszám) segítségével extraháltuk. és a cDNS-t GeneAmp RNS PCR (Applied Biosystems) alkalmazásával állítottuk elő. A Q-PCR-t TaqMan kémiai és Assay-on-Demand szondák (Applied Biosystems) alkalmazásával végeztük CRABP-II (Mm00801691_m1), FABP5 (Mm00783731_s1), PPARβ/δ (Mm01305434_m1), adipóz-differenciálódáshoz kapcsolódó fehérje (ADm4R7; ), ANGPTL4 (Mm001278813_m1), Cyp26a (Mm00514486_m1) UCP1 (Mm00494069_m1), UCP3 (Mm00494074_m1), aldehiddehidrogenáz 9 (ALDH9; Mm00487200_m1); Mm00487200_m1) (Mm00436615_m1), RARα (Mm00436264_m1), RARβ (Mm01319680_m1), RARγ (Mm00441083_m1), hormonérzékeny lipáz (HSL; Mm00495359_m1), hapo A1 (Hs00163641_m1) Mm1 (m1) m1 és m 18s rRNS-t (4352930E) használtunk kontrollként.

3T3-L1 sejtek differenciálódása. A 3T3-L1 fibroblasztokat 10% borjúszérummal kiegészített Dulbecco-módosított Eagle táptalajban (DMEM) növesztettük. A sejteket hagytuk növekedni 2 napig az összefolyás után, és differenciáló táptalajt adtunk hozzá (DMEM 10% magzati szarvasmarha-szérummal [FBS], 10 μg inzulinnal [Sigma Aldrich]/ml, 0,5 mM IBMX [3-izobutil-1- metil-xantin; Sigma Aldrich] és 0,25 mM dexametazon [ThermoFisher]). Három nappal később a táptalajt 10% FBS-sel kiegészített DMEM-mel helyettesítettük, és a sejteket hagytuk további 4 napig differenciálódni. A differenciálódást olajvörös O festéssel és a FABP-4 expressziójának monitorozásával határoztuk meg.

ShRNS-t hordozó lentivírusok. Az egér FABP5 rövid hajtű RNS-t (shRNS; TRCN0000011894) és az egér PPARβ/8 shRNS-ét (TRCN0000026045) az Open Biosystems-től kaptuk, és a vírusokat a gyártó protokollja szerint állítottuk elő. A vírusokat összegyűjtöttük, és a sejteket kétszer, 24 órás intervallummal fertőztük. A kísérleteket 5 nappal később hajtottuk végre.

Az egérvizsgálatokat a Case Western Reserve University Egér Metabolikus Fenotipizáló Központja végezte. A C57BL/6Ntac egereket (Taconic) a kísérletet megelőzően 16 hétig magas zsírtartalmú/magas szacharóz tartalmú étrenden (HFHS kutatási étrend D12331) helyeztük el. A sovány egereket etett táplálékkal etettük (LabDiet 5P76 Irradiated Isopro RMH 3000 [Prolab, St. Louis, MO]). Az egereket szubkután implantálták egy RA-pellettel vagy pelletált mintával, 10 g-os precíziós trochar alkalmazásával (Innovative Research of America). További egérkísérleteket hajtottunk végre RA, GW0742 vagy TTNPB-vel szezámolajban oldva (Sigma Aldrich), és közvetlen pipettázással (0,16 mg/50 μl) adtuk az állatok szájába. A szöveteket egy éjszakai böjt után, a kísérlet időtartamának végén gyűjtöttük be.

Testtömeg és táplálékfelvétel. Hetente egyszer huszonnégy órás élelmiszer-fogyasztást mértek. Minden 24 órás periódus alatt az egereket külön-külön, vékony ágyneművel helyeztük el, és ismert mennyiségű étrendet biztosítottunk. A 24 óra után megmaradt ételt lemértük. A testtömegeket a 24 órás etetési periódus előtt és után mértük.

Glükóz-tolerancia tesztet mértünk 6 órán át éheztetett egereknél, és intraperitoneálisan injektáltunk glükózt (2 g/kg). Vért vettünk a farokérből, 0, 15, 30, 60 és 120 percnél UltraTouch mérővel.

Vérparaméterek. Egy éjszakán át tartó böjt után egereket leöltek, és a vért szívszúrással vették össze. A plazmát Microtainer plazma-elválasztó csövekkel (Becton Dickinson) izoláltuk. Az inzulint ultraszenzitív egér inzulin enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (Mercodia, Lincoln Park, MO) mértük. Egyéb paramétereket az Állatorvosi Diagnosztikai Szolgálat (Marshfield Laboratories, Marshfield, WI) mért.

Szövettan. A szöveteket 10% -os formalinnal extraháltuk és tartósítottuk, majd a Case Western Reserve University Histology Core feldolgozta és metszette. A metszeteket Zeiss kamerával elemeztük. A májsejtek számát úgy határoztuk meg, hogy egér két szakaszból megszámláltuk az egyes sejtek egyes magjait egy × 10 mezőben; minden csoportból négy egeret számláltunk.

EREDMÉNYEK

Az adipogenezist a RAR-ok csökkentése és a PPARβ/δ jelátvitel szabályozása kíséri. Az RA lipid homeosztázisban való részvételének hátterében álló mechanizmusok feltárásához megvizsgáltuk azokat a jelátviteli utakat, amelyek révén a hormon az adipocitákban működik. Ennek érdekében a jól bevált tenyésztett adipocita sejt modellt, az NIH 3T3-L1-t használtuk. A preadipocita sejteket az összefolyás után 2 napig hagytuk növekedni, és standard hormonkeverékkel (10 μg inzulin/ml, 0,5 mM IBMX, 0,25 mM dexametazon) differenciálódásra indukáltuk őket. Három nappal később a táptalajt 10% FBS-sel kiegészített DMEM-mel helyettesítettük, és a sejteket 4 napig növesztettük. A differenciálódást a lipidfelhalmozódás monitorozásával és az FABP4 adipocita marker indukciójának vizsgálatával igazoltuk (lásd a kiegészítő anyagban az S1a és b ábrát).

RA, GW0742 és TTNPB hatása elhízott egerek és HepG2 sejtek génexpressziójára. (a és b) PPARβ/δ célgének (a), valamint a PPARβ/δ és FABP5 (b) mRNS szintje kezeletlen, RA-val kezelt és GW0742-kezelt egerekben 3 hetes kezelés után (0,16 mg/nap) . *, P ≤ 0,05 (szemben az elhízott, kezeletlen egerekkel). (c) A zsíros HSL és UCP1 és a máj apo A1 szintje elhízott egerekben szezámolajat (elhízott), RA, GW0742 vagy TTNPB tápláltak 2 napig (0,16 mg/nap). A WAT-okat és a májat összegyűjtöttük, az RNS-t izoláltuk, és az mRNS-szinteket Q-PCR-rel vizsgáltuk. *, P <0,05; **, P = 0,09; ***, P = 0,06 (szemben az elhízott kezeletlen egerekkel). (d) Apo A1 mRNS szintje a megjelölt ligandumokkal kezelt HepG2 sejtekben (0,1 μM, 4 óra). *, P ≤ 0,05 (kezeletlen egerekhez viszonyítva).

RA-val és GW0742-vel 3 hétig kezelt elhízott egerek jellemzői

VITA

Számos bizonyíték bizonyította, hogy az A-vitamin részt vesz az adipozitás és az energiaegyensúly szabályozásában. Ezért arról számoltak be, hogy az A-vitamin egereknek történő beadása súlyvesztéshez vezet (11), hogy az egerekben az A-vitamin-anyagcserét közvetítő enzimek genetikai manipulációja megváltoztatja az adipozitást (45, 46), és hogy a rágcsálókat vitaminnal kezelik Az A vagy RA megváltoztathatja az energia homeosztázisban részt vevő zsírgének expressziós szintjét (11, 25). Azonban ezek a hatások hátterében álló molekuláris mechanizmusok nem voltak teljesen ismertek.

A tenyésztett sejteket és a magas zsírtartalmú/magas szénhidráttartalmú étrend által kiváltott elhízási egérmodellt használva bebizonyítjuk, hogy az RA a program több aspektusát is kiváltja, amelyekről ismert, hogy a PPARβ/δ aktiválása váltja ki. Adipocitákban az RA indukálta a PPARβ/δ célgének expresszióját, beleértve a lipidanyagcserében részt vevő géneket is - pl. A szétkapcsoló fehérjéket kódoló gének, a zsírsav oxidációjához szükséges ALDH9 és az ANGPTL4, a plazma lipoprotein anyagcserét szabályozó adipokin (20) - és olyan fehérjéket kódoló gének, mint a PDK1 és a GLUT4, amelyek részt vesznek az inzulinválaszokban. In vivo az RA-kezelés felszabályozta a lipid- és cukrot feldolgozó PPARβ/δ célgének expresszióját a zsírszövetben és a májban, és összefoglalta a PPARβ/δ jelentett aktivitását a vázizom mitokondriális tartalmának növekedésében (42). Figyelemre méltó, hogy az elhízott egerek RA kezelése súlyvesztéshez és jobb glükóz toleranciához vezetett a kezelt egerek nagyobb táplálékfelvétele ellenére. Az RA-val kezelt egerek magasabb testhőmérsékletével együttvéve ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy a fogyás a fokozott energiafelhasználásból származik.

Jelen tanulmány eredményei azt mutatják, hogy az elhízott egerek RA kezelése a zsír lipidkészleteinek kimerüléséhez, súlyvesztés indukciójához, a máj steatosisának megfordításához, az izom mitokondriális tartalmának növekedéséhez, a glükóz tolerancia javulásához és a FABP5/PPARβ/δ útvonal. Ezek az adatok megalapozzák az A-vitamin régóta jegyzett, de rosszul ismert funkcióját az energiaegyensúly szabályozásában, és arra utalnak, hogy az RA hatékony hatóanyag lehet az elhízás és az inzulinrezisztencia visszaszorításában.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a tanulmányt a NIH R01 DK060684 támogatás és a 024505 ADVANCE támogatás támogatta a Case Western Reserve University ACES programjához. A Case Western Reserve University egérmetabolikus fenotipizáló központját az NIH DK59630 támogatása támogatja.