Az alvást és az ébrenlétet a ventrális mediális középagy/Pons GABAerg neuronok vezérlik egerekben

Ebben a cikkben van egy javítás. Lásd:

Absztrakt

Az alvás-ébrenlét viselkedését az emlős agyának számos neuronális populációja szabályozza. Bár a ventrális középagy/pons (VMP) területe javasolt az alvás-ébrenlét szabályozásában való részvételre, az idegsejtek mechanizmusai továbbra sem tisztázottak. Itt azt tapasztaltuk, hogy a GABAerg neuronok nemspecifikus sejtszintű ablációja vagy szelektív ablációja hím egerekben az A diftéria-toxin A fragmens expresszálásával hím egerekben az ébrenlét nagymértékű növekedését váltotta ki, amely legalább 4 hétig tartott. Ezzel szemben a dopaminerg neuronok szelektív ablációja a VMP-ben csekély hatással volt az ébrenlétre. A VMP GABAerg neuronok kemogenetikus gátlása szintén jelentősen fokozta az ébrenlétet. A VMP GABAerg idegsejtek ablációjának vagy gátlásának ébredést elősegítő hatását különböző mértékben csillapította dopamin D1 vagy D2/3 receptor antagonisták adása, és mindkét antagonista együttes beadása megszüntette. Ezzel szemben a VMP GABAerg neuronok kemogenetikus aktiválása erősen fokozta a lassú hullámú alvást és csökkentette az ébrenlétet. Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a VMP GABAerg neuronok szabályozzák a dopaminerg hatásokat az egerek alvás-ébrenlét viselkedésében.

JELENTŐSÉGI NYILATKOZAT Az alvás-ébrenlét viselkedését szabályozó neuronális mechanizmusok és populációk jelenlegi ismerete hiányos. Itt azonosítottunk egy GABAergic ventrális középagy/pons területet, amely szükséges az egerek napi alvásának és ébrenlétének szabályozásához. Azt is megállapítottuk, hogy ezek a gátló idegsejtek a dopaminerg rendszerek elnyomásával szabályozzák az ébrenlétet. Meglepő módon ezen idegsejtek aktiválása erősen indukálta a lassú hullámú alvást, miközben elnyomta az ébrenlétet. Vizsgálatunk egy új agyi mechanizmust tár fel az alvás-ébrenlét szabályozásában.

AAV
ébredés
DREADD
EEG
idegi áramkörök
REM alvás

Bevezetés

Az alvás egyik lehetséges funkciója az energiatakarékosság az inaktivitás kikényszerítésével, ha az aktivitás nem előnyös (Siegel, 2009). Ezzel szemben, amikor a változó ökológiai igények az ébrenlétnek kedveznek, az állatok képesek lesznek elaludni. Az ébrenlét szabályozásának mechanizmusai, amelyek az állat alvásmennyiségének a viselkedéséhez való igazítását szolgálják, nagyrészt ismeretlenek.

Nemrégiben alvásszabályozó idegsejtként azonosítottuk a nucleus accumbens közvetett útvonalú neuronjait (Oishi et al., 2017b). Az atommagot a ventrális tegmentális terület (VTA) idegsejtjei innerválják a középagy hasi részében (Taylor és mtsai, 2014; Oishi és Lazarus, 2017). Bár mi és mások beszámoltunk arról, hogy a VTA dopaminerg neuronok aktiválása erősen ébrenlétet indukál (Eban-Rothschild és mtsai, 2016; Taylor és mtsai, 2016; Oishi és mtsai, 2017a), ennek a középagynak a szerepe az alvásban Az ébrenléti szabályozás továbbra sem egyértelmű, mert az eredmények ellentmondásosak. Patkányokban az ezen a területen lévő sejtek neurotoxikus elváltozásai a hipokretin-2-szaporinnal nincsenek hatással az alvás-ébrenlét viselkedésére (Gerashchenko et al., 2006). Macskáknál a ventrális középagy terület elektrolitikus elváltozásai, beleértve a VTA-t, nincs jelentős hatással az alvás-ébrenlét viselkedésére (Jones és mtsai., 1973), míg a VTA-t tartalmazó területen a sejtek N-metil-d-aspartát elváltozásai álmatlanságot okoz (Lai et al., 1999).

Jelen vizsgálatunkban ablációs technikát alkalmaztunk, amely a diftéria toxin fragmens A (DTA) vírusos expresszióján alapult, és megállapítottuk, hogy a ventrális mediális középagy/pons területén (VMP) a ventrális metszéspontjában található nem specifikus vagy GABAerg neuron-specifikus ablációk. a mediális középagy és a pons nagymértékben fokozta az ébrenlétet az egerekben. A fokozott ébrenlét a VMP GABAerg neuronok kemogenetikus gátlása után is megfigyelhető volt. Farmakológiai eszközökkel tovább bizonyítottuk, hogy ezt az izgalmi hatást dopaminerg rendszerek közvetítik. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a VMP GABAerg sejtek kritikus fontosságúak az alvás-ébrenlét viselkedésének szabályozásában.

Anyagok és metódusok

Egerek és vegyszerek.

A következő egérvonalakat használtuk: C57BL/6J vad típusú (WT, Charles River Laboratories), dopamin transzporter (DAT) -Cre (Bäckman et al., 2006) (The Jackson Laboratory 006660) és vezikuláris GABA transzporter (VGAT) -Cre (Vong és mtsai., 2011) (Dr. Bradford Lowell, a Harvard Medical School szívesen nyújtotta). Hím egereket (8–20 hét, 25–35 g) használtunk a viselkedési vizsgálatokhoz, és szigetelt hangszigetelt kamrákba helyeztük 23 ± 0,5 ° C környezeti hőmérsékleten, 55 ± 3% páratartalom mellett, 12 órás fényben./sötét ciklus (8: 00-kor világít), és ad libitum ételt és vizet biztosított. Valamennyi kísérletet a Tsukubai Egyetem Állatgondozási Bizottságának megfelelően végeztük el, és minden erőfeszítést megtettünk a felhasznált állatok számának, valamint a fájdalom és kellemetlenség minimalizálása érdekében.

A klozapin-N-oxidot (CNO, Millipore-Sigma), az SCH23390 szelektív D1 receptor antagonistát (Millipore-Sigma), a szelektív D2/D3 receptor antagonista raclopridot (Millipore-Sigma) és hisztamin H1 receptor antagonista ketotifent (Tokyo Chemical) használtuk. sóoldatban oldva.

Plazmidok és adeno-asszociált vírusvektorok (AAV).

A pAAV-CMV-FLEX-DTA plazmid előállításához egy FLEX-DTA kazettát (lásd 1A. Ábra) szintetizáltunk az Eurofins Genomics K.K. és beillesztettük a ClaI és a BamHI restrikciós helyek közé egy pAAV-MCS vektorba (Stratagene). A pAAV-CMV-FLEX-hrGFP plazmid előállításához a pAAV-CMV-FLEX-DTA AscI és NheI restrikciós helyei közötti DTA fragmenst hrGFP kódoló szekvenciával helyettesítettük. A pAAV-hSyn-FLEX-hM4Di-mCherry és a pAAV-hSyn-FLEX-hM3Dq-mCherry plazmidokat (Krashes et al., 2011) Dr. Bryan Roth (Észak-Karolinai Orvostudományi Egyetem, Chapel Hill, NC) ). Az ebben a vizsgálatban előállított plazmidokat az Addgene-ben helyezzük el.

pAAV-CMV-FLEX-DTA, pAAV-CMV-FLEX-hrGFP, pAAV-CMV-Cre (Lazarus et al., 2011), pAAV-hSyn-FLEX-hM4Di-mCherry vagy pAAV-hSyn-FLEX-hM3Dq-mCherry rh10 szerotípus AAV-jába csomagoltuk 293A sejtek felhasználásával, a korábban leírtak szerint (Kaur et al., 2017; Oishi et al., 2017a, b).

Sebészet.

Az agy mikroinjekcióihoz pentobarbitállal (60 mg kg -1, ip) altatott egereket kétoldalúan injektáltunk a VMP-be (3,4 mm hátsó és 0,2 mm laterális a bregma felé, 4,4 mm-rel a dura alatt) egy üveg segítségével 60 nl AAV-injekcióval. mikropipetta és egy légnyomás-befecskendező rendszer. Nem szelektív sejttípusú ablációval rendelkező egerek előállításához a WT egereket AAV-FLEX-DTA (8,6 × 10 10 részecske ml-1) és AAV-Cre (1,5 × 10 11 részecske ml - 1: 1) keverékével injektáltuk. 1) vagy önmagában az AAV-FLEX-DTA. A dopaminerg vagy GABAerg neuron ablációval rendelkező egerek előállításához DAT-Cre vagy VGAT-Cre egereket injektáltunk AAV-FLEX-DTA vagy AAV-FLEX-hrGFP-vel (1,5 × 10 11 részecske ml -1). A kemogenetikai kísérletekhez a VGAT-Cre egereket AAV-FLEX-hM4Di-mCherry-vel (1,1 × 10 11 részecske ml -1) vagy AAV-FLEX-hM3Dq-mCherry-vel (1,1 × 10 11 részecske ml -1) injektáltuk.

Az egereket krónikusan beültették az elektroencefalográfia (EEG) és az elektromiográfia (EMG) elektródjaival is a poliszomnográfia céljából, az előzőekben leírtak szerint (Oishi et al., 2016). Röviden, az implantátum két rozsdamentes acélból készült csavart tartalmazott, amelyek EEG elektródaként szolgálnak, és két szigetelt, teflonnal bevont ezüsthuzalt helyeztek kétoldalúan a trapézizmokba, hogy EMG elektródaként szolgáljanak. Az elektródákat fogakrillal rögzítették a koponyához.

EEG/EMG felvételek.

Miután 1-2 hetet hagytunk a posztoperatív helyreállításra és a transzgén expresszióra, az egereket EEG/EMG rögzítő kábelekkel csatlakoztattuk. Az EEG/EMG jeleket felerősítettük és szűrtük (EEG: 0,5–64 Hz, EMG: 16–64 Hz), 128 Hz-es mintavételi frekvenciával digitalizáltuk és a SLEEPSIGN szoftver (Kissei Comtec) segítségével rögzítettük. Az éberségi állapotokat offline módon értékelték a 10 s korszakok három szakaszra történő jellemzésével: (1) ébrenlét, (2) lassú hullámú alvás (SWS) és (3) gyors szemmozgás alvás (REMS) standard kritériumok szerint (Oishi et al., 2016).

Farmakológiai és kemogenetikai kísérletek.

A kiindulási 24 órás felvételeket követően a VGAT-Cre DTA/VMP egereknek sóoldatot, 0,03 mg kg -1 SCH23390, 2 mg kg -1 raclopridot vagy 10 mg kg -1 ketotifent adtunk 10:00 órakor. Mindegyik egér véletlenszerű sorrendben kapta a dopaminreceptor-antagonisták összes kombinációját, legalább 3 d intervallummal a gyógyszer beadása között. Külön egércsoport kapott ketotifent. A gyógyszerek dózisait a korábbi vizsgálatok alapján választották ki (Qu et al., 2008; Unno et al., 2012; Oishi et al., 2017a). A kemogenetikus gátláshoz a VGAT-Cre M4/VMP egereket intraperitoneálisan sóoldattal vagy 3 mg kg -1 CNO-val injektáltuk 10:00 órakor, 2 egymást követő napon. A kemogenetikus aktiváláshoz mindegyik VGAT-Cre M3/VMP egér intraperitoneálisan fiziológiás sóoldatot vagy különböző dózisokat (0,3, 0,9 és 2,7 mg kg -1) kapott CNO-val 20: 00-kor, legalább 3 d-es időközönként.

Szövettan.

Mély érzéstelenítésben klórhidrát túladagolásával (500 mg kg -1, i.p.) az állatokat intrakardiálisan sóoldattal, majd semleges pufferolt 10% -os formalinnal perfundáltuk. Az agyakat ezután egy éjszakán át 20% -os szacharózba helyeztük 4 ° C-on, hogy csökkentsük a fagyasztó műterméket. Az agyakat 40 μm-en metszettük egy fagyasztó mikrotomon.

Az immunhisztokémia céljából a metszeteket 0,3% -os hidrogén-peroxidban inkubáltuk, majd egy éjszakán át nyúl anti-DsRed-del (1: 10 000, Clontech, katalógusszám: 632496, RRID: AB_10013483), egér anti-NeuN-sel (1: 2000, Millipore, katalógusszám: MAB377), RRID: AB_2298772), vagy nyúl anti-tirozin-hidroxiláz (TH; 1: 20 000, Millipore, AB152 katalógus, RRID: AB_390204). A metszeteket 2 órán át inkubáltuk biotinilezett antitestben (1: 1000, Jackson ImmunoResearch Laboratories), és 1 órán át avidin – biotin komplexel (1: 1000; Vectastain ABC Elite kit, Vector Laboratories) kezeltük. Az immunreaktív sejteket 3,3′-diaminobenzidinnel és 0,01% hidrogén-peroxiddal reagáltatva.

In situ hibridizációhoz 918 bp-os digoxigeninnel jelölt ribopróbát állítottunk elő VGAT mRNS-hez PCR-amplifikációval (primerek: előre, gcatgttcgtgctgggcctacc; fordított, cagcgcagcgtcagcccccag T7 promoterrel konjugálva) sablonként egér farok genomi DNS-t használva, majd átírás. Ezután a metszeteket 1 μg ml -1 koncentrációjú VGAT szondával inkubáltuk 50% -os formamidot tartalmazó 5x nátrium-citrát pufferban, 50 ° C-on, egy éjszakán át, 1x sóoldat-nátrium-citrát pufferben 50 ° C-on mostuk, lúgos foszfatázzal konjugáltuk. anti-digoxigenin antitest (1: 500, Roche) egy éjszakán át, és 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát/nitrokék-tetrazóliummal (BCIP/NBT, Millipore-Sigma) reagáltatva láthatóvá válik.

A c-Fos és mCherry kettős jelölése érdekében immunfestést végeztünk nyúl anti-c-Fos antitesttel (1: 2000, Millipore, ABE457 katalógus, RRID: AB_2631318), peroxidázzal konjugált nyúlellenes antitesttel (1: 250, Jackson ImmunoResearch Laboratories) és tiramiddal konjugált fluoreszcein (PerkinElmer). Az mCherry-pozitív sejteket az mCherry natív vörös fluoreszcenciájával azonosítottuk. A képeket konfokális LSM800 lézeres pásztázó mikroszkóppal elemeztük (Carl Zeiss).

A kvantitatív szövettani elemzéshez megszámoltuk a sejteket, amelyek pozitívak voltak TH, VGAT mRNS, c-Fos vagy mCherry szempontjából, a VMP-ben kétoldalúan elhelyezett számláló doboz segítségével. Egy 500 × 650 μm-es dobozt helyeztünk el, amelynek ventrális mediális éle az interpedunculáris mag közepén, a mediális határ pedig a középvonal mentén, 3,8 mm-rel a bregma mögött. Az elülső-hátsó koordinátákat a Paxinos és Franklin egér agyatlaszból nyertük (Paxinos és Franklin, 2001). A sejtszámot az Abercrombie korrekciós faktor alkalmazásával állítottuk be (Guillery, 2002).

Elektrofiziológia.

Kísérleti tervezés és statisztikai elemzés.

Viselkedési kísérletekhez az egerek számát az állatok várható eltérései és az AAV mikroinjekciók változékonysága alapján választottuk meg.

A VMP dopaminerg neuronhiánya alig vagy egyáltalán nem befolyásolja az ébrenlétet

A VMP GABAerg neuronhiány növeli az ébrenlétet egerekben

A dopamin a fokozott ébrenlétet közvetíti a VMP GABAerg neuronhiányos egerekben

A dopamin receptor antagonisták elnyomták az ébrenlétet egerekben, a GMPAerg neuronok hiányában a VMP-ben. Az ébrenlét teljes mennyisége 6 órán át VGAT-Cre DTA/VMP-ben (A, C) vagy VGAT-Cre hrGFP/VMP egerek (B, D) dopamin receptor antagonistákkal (SCH23390 és/vagy racloprid; A, B) vagy a hisztamin H1 receptor antagonista ketotifen (C, D). Az adatokat átlag ± SEM formájában mutatjuk be (n = 5–8).