Az androgénreceptor semleges hím egereknél késői elhízás alakul ki, amelyet a csökkent energiafelhasználás és a lipolitikus aktivitás okoz, de normális inzulinérzékenységet mutat magas adiponektin szekrécióval

Absztrakt

Az androgénreceptor (AR) null hím egerek (AR L−/Y) késői kezdetű elhízást tártak fel, amelyet komputertomográfián alapuló testösszetétel-elemzés igazolt. Az AR L−/Y egerek eufágikusak voltak a vad típusú hím (AR X/Y) kontrollokkal összehasonlítva, de kevésbé dinamikusak és kevesebb oxigént fogyasztottak. A transzkriptum profilozás azt mutatta, hogy az AR L−/Y egerek alacsonyabb transzkriptumokkal rendelkeznek az 1 termogenetikus szétkapcsoló fehérjéhez, amelyet később kiderült, hogy az AR ligandumfüggően aktiválja. Megállapítottuk az inzulinszenzibilizáló adiponektin fokozott szekrécióját a zsírszövetből és a peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor-y expresszióját viszonylag alacsonyabban a fehér zsírszövetben, összehasonlítva az AR X/Y egerekkel. Mindkét tényező megmagyarázhatja, hogy az AR L−/Y egerek általános inzulinérzékenysége miért maradt ép a látszólagos elhízás ellenére. Az eredmények azt mutatták, hogy az AR fontos szerepet játszik a férfi anyagcserében az energiaegyensúly befolyásolásával, és negatív mind az adipozitás, mind az inzulinérzékenység szempontjából.

AR, androgén receptor
BAT, barna zsírszövet
CT, számítógépes tomográfia
PPAR-γ, peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor-γ
UCP, fehérje szétkapcsolása
WAT, fehér zsírszövet

Az elhízás etiológiája rendkívül heterogén, mivel a genetikai, környezeti és pszichoszociális tényezők közötti kölcsönhatások végeredménye. Az androgénreceptor (AR) gén lehet ezen genetikai tényezők egyike. Kimutatták, hogy az AR génismétlődés-variáció szorosan összefügg az idősebb felnőttek központi elhízási indexeivel (1). A tesztoszteron fontos tényező a férfiak testösszetételének meghatározásában. A hasi elhízás fordítottan korrelál a férfiak szérum tesztoszteronszintjével, nőknél azonban nem (2). A testzsír-tömeg egyenletes növekedése kíséri a férfiak szérum tesztoszteronszintjének életkorfüggő csökkenését (3,4), ami nagyobb morbiditáshoz vezet (5). A patológiailag hipogonadalos férfiak zsírtartalma is szignifikánsan magasabb (3,6), amit a tesztoszteron beadása megfordít (7,8), míg a szérum tesztoszteron szuppressziója egészséges fiatal férfiaknál növelte a zsírtömeg százalékát, csökkentette a lipid oxidációs sebességét és a nyugalmi energiát kiadások (9).

Generáltunk egy AR null (ARKO) egérvonalat, egy Cre-loxP rendszert (10–12) használva, és megállapítottuk, hogy a hím ARKO egereknél (AR L−/Y) későn megjelenő elhízás alakult ki, míg sem heterozigóta, sem homozigóta nőstény ARKO egerek érintettek (10), ami férfiaspecifikus AR hatást sugall az adipozitásra.

Itt közöljük a későn megjelenő elhízás mögöttes mechanizmusát AR L−/Y egerekben. A hiperfágia hiánya ellenére az AR L−/Y egerek spontán aktivitása alacsonyabb volt, és csökkent az általános oxigénfogyasztási arány. Megfigyeltük a termogén szétkapcsoló fehérje 1 (UCP-1) expressziójának egyidejű csökkenését is. Ezenkívül az AR L−/Y egereknél az inzulinrezisztencia egyedülálló hiánya az elhízott fenotípus ellenére azt sugallja, hogy ez összefügg az adiponektin fokozott szekréciójával a zsírszövetből.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

ARKO mutáns egérvonalat hoztak létre és tartottak fenn a korábban leírtak szerint (10–12). Heterozigóta nőstényeket vad típusú hímekké tenyésztettek (C57BL/6NCrj; Charles River Japan, Tokió, Japán), hogy ARKO hím egereket (AR L−/Y) és heterozigóta nőstényeket hozzanak létre. Étrendjük (CLEA rágcsáló-étrend CE-2; Kyudo, Tosu, Saga, Japán) összetétele a következő volt: 54,4% szénhidrát, 24,4% fehérje, 4,4% zsír és 342,2 kcal/100 g. Az egereket hetente lemértük, és az élelmiszer-fogyasztást a maradék étel 3 napos lemérésével mértük. Az összes állati protokollt a Kyushu Egyetem állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyta jóvá.

Testzsír-összetétel elemzése.

A testzsír-összetétel számítógépes tomográfiai (CT) elemzéséhez az egereket pentobarbitál-nátrium intraperitoneális injekcióival (Nembutal; Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japán) érzéstelenítettük, majd LaTheta (LCT-100M) kísérleti állat-CT rendszerrel (Aloka, Tokió) szkenneltük., Japán). Az L2 és L4 közötti összefüggő 2 mm-es szeletképeket alkalmaztuk a kvantitatív értékeléshez LaTheta szoftverrel (1.00 verzió). A zsigeri zsírt, a szubkután zsírt és az izmokat megkülönböztettük és kvantitatívan értékeltük.

Spontán tevékenység.

A spontán fizikai aktivitást egy Letica infravörös rendszerrel (Panlab, Barcelona, Spanyolország) mértük. Az egereket 45 × 45 cm 2 -es infravörös keretbe helyeztük, amelyben 16 × 16 elfogó infravörös fénysugár képezte az infravörös sejtek kettős rácsát. Az egerek infravörös kereten belüli helyzetét valós időben követtük nyomon. Egy további felső infravörös keretet alkalmaztunk a nevelés detektálására (az egér felállt a hátsó lábain). Az olyan paramétereket, mint a megtett távolság, a sebesség, a tenyésztési szám és az időtartam, az Acti-Track program segítségével elemeztük. Két 2,00 és 5,00 cm/s sebességi küszöbérték beállításával a mozgásokat pihenésre (2,00 cm/s-nál lassabban), lassan (2,00 és 5,00 cm/s között) és gyorsan (5,00 cm/s-nál gyorsabban) mozgatták. ). Az egereket a felvétel megkezdése előtt 5 órával a keretbe helyeztük, hogy lehetővé tegyük a környezettel való ismerkedést. A felvételt a fények kikapcsolása után 2 órával kezdték meg, és 8 órán át tartott; az egereket egyedileg értékeltük.

Oxigénfogyasztás mérése.

Az egereket rendszeres chow-val etettük, állandó szobahőmérsékleten (21–23 ° C) tartottuk, és ~ 22 hetes korban oxigénfogyasztás-mérésnek vetettük alá őket egy számítógép által vezérelt nyílt áramkörű indirekt kaloriméterrel (Oxymax; Columbus Instruments, Columbus OH ). Az egereket egyenként metabolikus kamrákban helyezték el (10 × 20 cm2), és szabadon hozzáférhettek az élelemhez és a vízhez. A kamrához való 1 órás adaptáció után a V02-értéket 4 perces időközönként 24 órán keresztül értékeltük. Az összes mintaadatot Oxymax Windows szoftverrel (1.0 verzió) elemeztük.

Glükóz tolerancia és inzulin teszt.

Az intraperitoneális glükóz tolerancia teszthez az egereket egy éjszakán át éheztettük, majd 2 g d-glükózt/testtömeg-kg-ot injektáltunk i.p. A farok vércukorszintjét az injekció beadása előtt és után 15, 30, 60, 90 és 120 perccel követtük vércukorszintmérőkkel (Matsushita Kotobuki Electronics Industries, Ehime, Japán). Az inzulin provokációs teszt céljából az egereket egy éjszakán át éheztettük, majd 0,7 egység rendszeres inzulint/testtömeg-kg-ot injektáltunk i.p. A farok vércukorszintjét a fentivel azonos időpontokban mértük.

Szövettan.

Az egereket 45 hetes korban megölték egy éjszakai böjt után, és a vért szívpunkcióval vették fel. A szubkután fehér zsírszövetet (WAT), az interscapularis barna zsírszövetet (BAT), a májat és a veséket eltávolítottuk és 4% paraformaldehidben rögzítettük. Dehidratálás után a szövetmintákat véletlenszerű orientációban paraffinba ágyazva, 10 μm-es szeletekre szeletelve hematoxilinnal és eozinnal festették.

Vér vegyszerek.

A vért a halál idején összegyűjtöttük, és az izolált szérumot alikvotizáltuk, és felhasználásig -20 ° C-on tároltuk. Az összes vérkémiai elemet az SRL (Tokió, Japán) mérte. A plazma teljes hosszúságú adiponektinszintjét enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálati rendszerrel mértük, a korábban leírtak szerint (13).

Valós idejű PCR.

A teljes RNS-t 100 mg intraperitoneális WAT-ból vagy interscapularis BAT-ból izoláltuk RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) alkalmazásával. Az esetleges DNS-szennyezés eltávolítása érdekében a DNS oszlopon történő emésztését RNáz-mentes DNáz-készlettel (Qiagen) végeztük. Ezután 3 μg teljes RNS-t reverz transzkripciónak vetettek alá véletlenszerű primerekkel alapozott SuperScript III reverz transzkriptáz (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával. A cDNS-t ezután valós idejű PCR-analízisnek vetettük alá a különféle transzkriptumok számszerűsítése érdekében, LightCycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország) felhasználásával, a gyártó utasításai szerint, amint azt korábban leírtuk (14). Az egyes céltranszkriptumok előre/reverz primer szekvenciáit az 1. táblázat mutatja. A β-aktint egyszerre amplifikálták belső kontrollként. Az egyes transzkriptumok valós idejű PCR-adatait a β-aktin arányaként számítottuk ki.

UCP-1 promoter assay.

Az egér UCP-1 promóterének 3,85 kb méretű (-3 860-10-tól a start kodontól) régióját PCR-rel amplifikáltuk specifikus primerek (1. táblázat) és KOD-Plus DNS-polimeráz (Toyobo, Osaka, Japán) alkalmazásával T-ben. -gradiens termoblokk (Biometra Biomedizinische Analytik, Gottingen, Németország), majd ezt követően a pGL3-Basic (Promega, Madison, WI) vektorba klónozták egy UCP-1 – Luc riporter elkészítéséhez. Ezután közvetlen szekvenálást hajtottak végre a teljes hosszúságú szekvencia és orientáció validálása céljából. Az AR hatását az UCP-1 promoterre NIH-3T3-L1 adipocitákban elemeztük kettős luciferáz vizsgálattal, a korábban leírtak szerint (15). Röviden: 1x105 sejtet/üreget 12 lyukú lemezekre oltottunk, és az UCP-1 – Luc és a pCMV-AR, vagy a pCMX (üres vektor), valamint a belső kontroll pRL-CMV vektorokat együtt transzfektáltuk a sejtekbe SuperFect (Qiagen). A sejteket 10-8 mol/l dihidroxi-triptaminban vagy oldószerében, etanolban 24 órán át inkubáltuk, majd LUMAT LB9507 luminométerrel (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Németország) lizáltuk és relatív luciferáz-vizsgálatnak vetettük alá őket.

Statisztikai analízis.

Az adatokat átlag ± SD-ként fejeztük ki, és Student's tail-t teszttel vagy ANOVA-val értékeltük, majd post hoc összehasonlításokat végeztünk Fisher által védett legkevésbé szignifikáns különbség-teszttel.

EREDMÉNYEK

Korábban beszámoltunk arról, hogy 10 hetes korig az AR L−/Y egerek növekedési retardációja a vad vad típusú (AR X/Y) hím egerekhez képest volt, de a következő néhány hétben testtömegük felzárkózott, majd meghaladta az AR X/Y egerekét, és végül nyilvánvaló elhízássá fejlődött (10). Ezeket a jelenségeket nem figyelték meg ARKO nőstény egereknél. Jelen tanulmányban objektív CT-alapú testösszetétel-elemzést végeztünk egereknél 40 hetes korban. Az 1A. Ábra mutatja a zsírszövet és az izom CT becsült súlyát a vizsgált területen (L2 – L4). Bár az izom mennyisége nem változott, az AR L−/Y egerek zsigeri és szubkután zsírja és teljes zsírja szignifikánsan nehezebb volt, mint az AR X/Y egereké. Az 1B ábra reprezentatív CT-képeket mutat AR X/Y (bal) és AR L−/Y (jobb) egerek L3 szintjén. Az AR L−/Y egerek zsírtartalma megnőtt mind a zsigeri, mind a szubkután területeken. Így a megnövekedett zsírbetegség, nem pedig a testnövekedés lineáris növekedése, jelentette az AR L−/Y egerek megnövekedett testtömegét.

Az AR L−/Y egerek testsúlya 45 hetes korban szignifikánsan magasabb volt, mint az AR X/Y egereké (2A. Ábra), és a CT-adatokkal összhangban az AR L−/Y egerek perirenális zsírpárnái egyértelműen nagyobbak voltak, mint az AR X/Y egereké (az adatokat nem mutatjuk be). A megnövekedett testtömeg ellenére az AR L−/Y egerek veséje szignifikánsan kisebb volt, mint az AR X/Y egereké (2B. Ábra), alátámasztva a korábbi vizsgálatokat, amelyek kisebb veséket mutattak ki orchidektomizált egerekben (16, 17).

Ezután tanulmányoztuk a glükóz metabolizmusának molekuláris eseményeit a vázizomzatban, mert az izom az androgén és az adiponektin fő célpontja is. Amint az a 2–5. A 3I – M, bár a GLUT1 transzkriptum szintje változatlan volt (az adatokat nem közöltük), az AR L−/Y egerekben a GLUT4 (izom-domináns típus) szintek szignifikánsan felülszabályozódtak. Az izom-domináns hexokináz I szintjét szintén szabályoztuk, bár a hexokinase II esetében nem találtunk változást. Az izom-típusú foszfofruktokináz - bár statisztikailag nem szignifikánsan - általában magasabb volt, míg az izom-típusú piruvát-kináz (beleértve az izom-típusú piruvát-kináz-1-et és -2-t is) növekedése statisztikai szignifikanciát ért el. Ezek az adatok azt sugallják, hogy az AR L−/Y egerekben aktiválódhat az izom glükózfelvétele és oxidációja.

Az energiaegyensúly fogalma, amely magában foglalja mind az energia bevitelét (táplálkozását), mind az energiafelhasználását (fizikai aktivitás, alapanyagcsere és adaptív termogenezis), az elhízás megértésének kulcsa (24). Először azt tapasztaltuk, hogy az ad libitum táplálékbevitel változatlan volt az AR L−/Y és az AR X/Y egerek között; vagyis az AR L−/Y egerek eufágikusak voltak, amint arról már beszámoltunk (10). Ezután 8, 20 és 40 hét körüli egerek spontán fizikai aktivitását mértük (2. táblázat). A 8 órás megfigyelési periódus alatt, amíg a lámpák nem voltak, a 20 hetes AR L−/Y egerek lényegesen rövidebb távolságot futottak, és csaknem feleannyi tenyésztési (hátsó lábon állva) viselkedést mutattak, ami egy másik fontos paraméter dinamikus viselkedés, összehasonlítva az AR X/Y egerekkel. Az AR L−/Y egerek szintén csökkent aktivitást mutattak 40 hetes korban, és ami még fontosabb, 8 hetes korban, amikor az AR L−/Y egerek testtömege még nem haladta meg az AR X/Y egerek súlyát. Ez arra utal, hogy az AR L−/Y egerek csökkent aktivitása belső hiba, de nem másodlagos hatása a túlsúlyos egereknek.

Az AR L−/Y egerek WAT-jában a legfontosabb termogenetikus molekula, az UCP-1 (26) expressziós szintje kevesebb volt, mint az AR X/Y egerek tizede (5A. Ábra). Az AR valószínűleg új pozitív szabályozója az UCP-1 génnek, mert három szteroid receptor válasz elemet (TGTTCT) tártunk fel egy UCP-1 promóter szekvencián (-7 645 bp-ig, GenBank csatlakozási szám: U63418) és 3,85 kb Az UCP-1 promoter, amely az utolsó konszenzus szekvenciát tartalmazza, pozitívan reagált az AR-ra NIH-3T3-L1 adipocytákban dihidrotesztoszteron-függő módon (5B. Ábra). Az UCP-1 transzkriptum csökkenését az AR L−/Y egerek BAT-jában is megfigyelték (5.C ábra), bár kevésbé volt domináns, mint a WAT-nál; ezt azonban az AR transzkriptum hétszer magasabb expressziója magyarázza férfi WAT-ban, mint a BAT (5D. ábra). Az UCP-1 visszaszorítása bizonyos mértékig megmagyarázhatja az alsó V o 2 értéket AR L−/Y egerekben. Ezenkívül egy másik termogenetikai tényező, a PPAR-γ koaktivátor 1 (27) szintén szignifikánsan csökkent az AR L−/Y egerek WAT és BAT esetében egyaránt (5E. És F ábra).

Hormonérzékeny lipáz katalizálja a zsírszövetben a lipolízis sebességkorlátozó lépését. A hormonérzékeny lipáz transzkriptumszintje szignifikánsan csökkent az AR L−/Y WAT-ban (6A. Ábra), míg a de novo lipidszintézis indikátoroké, például a zsírsavszintáz (6B. Ábra) és az acetil-CoA karboxiláz (6. ábra). A 6C. Ábra), valamint a lipogén transzkripciós faktor szterin szabályozó elemet megkötő protein-1c (6D. Ábra) mind WAT, mind BAT esetében nem változtak szignifikánsan (az adatokat nem mutatjuk be). A lipoprotein lipázt, a keringő plazma trigliceridből származó lipogenezisben szerepet játszó kulcs enzimet kódoló transzkriptumok szignifikánsan csökkentek az AR L−/Y WAT-ban (6E. Ábra). Az AR L−/Y WAT zsírsav-β-oxidációs markerei a karnitin-palmitoil-transzferáz 1 (6F. Ábra) és a hosszú láncú acil-CoA dehidrogenáz (6G ábra) alacsonyabb tendenciákat mutattak, de statisztikailag nem voltak szignifikánsak. Összességében a csökkent lipolízis, nem pedig a fokozott lipidszintézis, számolhat az AR L−/Y egerek fokozott zsírosságával.

VITA

Az AR L−/Y egerek hipertrófiás adipocitáinak és kiterjesztett WAT-jának közvetlen molekuláris mechanizmusa a megváltozott lipid homeosztázisra támaszkodhat, amelyet csökkent lipolízis, de nem fokozott lipogenezis jellemez. A hormonérzékeny lipáz átiratai feltűnően csökkentek, míg a lipogenetikus gének (zsírsavszintáz, acetil-CoA karboxiláz, szterin szabályozó elemet kötő fehérje-1c és lipoprotein lipáz) génjei nem nőnek (változatlanok vagy csökkentek). Az eredmények összhangban vannak a korábbi javaslatokkal, miszerint az androgének lipolitikusak (28,29), és nagyon különböznek azoktól az aromatáz kiütő egerekétől, amelyeknél a lipogenezist fokozottnak találták (magas lipoprotein lipázszint), de a lipolízis normális volt (30), ami arra utal, hogy az ösztrogén antilipogén.

Az intakt glükóz homeosztázis, a glükózfelvétel és az oxidáció mögött álló molekuláris eseményeket az AR inaktiválásával fokozták a vázizomzatban, tükrözve a policisztás petefészek-szindrómás betegek klinikai képét, ahol az androgénfelesleg összefügg az inzulinrezisztenciával (32) és a csökkent glükózfelvétel ( 38). Ebben a pillanatban azonban nem vagyunk biztosak abban, hogy a fokozott glükózfelvételt és -oxidációt közvetlenül az androgén-AR rendszer inaktiválása okozza-e, vagy a hiperadiponektinémia vagy az alacsony PPAR-γ expresszió másodlagos-e.

A testtömeg és az energia trigliceridként történő tárolása a zsírszövetben homeosztatikusan az energiabevitel és a ráfordítás közötti hosszú távú egyensúly által szabályozott; az elhízás csak akkor alakul ki, ha az energiafelvétel krónikusan meghaladja a teljes energiafelhasználást (24). Bár ez nem befolyásolja az étvágyat, az AR inaktiválása a spontán fizikai aktivitás belső csökkenését okozza hím egerekben, valamint az általános oxigénfogyasztást (V o 2). Így az androgén-AR rendszer inaktiválása hím egerekben krónikus pozitív energiamérleget eredményez, ami kedvez a zsírtömeg és az elhízás felgyorsulásának.

Az alsó V o 2-vel egyetértésben mind a termogén UCP-1, mind a PPAR-γ koaktivátor 1 transzkriptumok csökkentek az AR L−/Y egerek zsírszövetében. Az UCP-1, amely leválasztja az energia szubsztrát oxidációját a mitokondriális ATP termeléséről, és ezáltal potenciális energia veszteséget eredményez hő formájában, az adaptív termogenezis egyik legfontosabb molekulája (26). Tudomásunk szerint ez az első alkalom, hogy bebizonyosodott, hogy az AR ligandumkötése után közvetlenül aktiválja az UCP-1 transzkripciót, feltehetően a promóteren található szteroid válaszelemekhez kötődve.

Bár az AR közvetlenül szabályozza az energia homeosztázisban szerepet játszó perifériás szövetek tényezőit, mint például az UCP-1, ez nagy valószínűséggel befolyásolja a központi idegrendszer által kifejtett mechanizmust is, mivel az AR-t sűrűn találták meg különböző hipotalamusz magokban, beleértve a ventromediális hipotalamust és a dorsomedialis hipotalamust és az íves mag (39). Az androgént aktiváló 5a-reduktázt a hipotalamuszban is expresszálják (40). Az androgén-AR rendszer fiziológiai szerepe a hipotalamuszban nagyrészt ismeretlen. Nagyon lehetséges, hogy a receptor részt vehet a leptin által szabályozott melanokortin áramkör szabályozásában, mivel a hipotalamuszban az AR aktiváció növeli a gátló neuropeptid szomatosztatint (41,42), ami viszont gátolhatja az anorexigén melanocita stimuláló hormont vagy a kokaint. amfetaminnal szabályozott átirat. Az AR L−/Y megváltozott energiamérlege, amelyet alacsonyabb V o 2 és alacsonyabb fizikai aktivitás jellemez, indokolttá teszi az AR intra-centrális idegrendszeri szerepének további tanulmányozását, amely jelenleg folyamatban van.

Összefoglalva, az androgén-AR rendszer korrelál a hím adipozitással, és a rendszer inaktiválása késői megjelenésű elhízást okoz a hím egerekben a megváltozott energiaegyensúly miatt, mivel az AR L−/Y egerek eufagikusak voltak, de fizikailag kevésbé dinamikusak és kevesebb az oxigén -fogyasztás az AR X/Y egerekhez képest. A csökkent energiafelhasználás mechanizmusa mind a központi idegrendszerben, mind a perifériás szövetekben megtalálható. Az adipozitásban kifejtett negatív szerepe mellett az androgén-AR rendszer negatív szerepet játszik az inzulinérzékenységben is, legalábbis részben azáltal, hogy gátolja az adiponektin felszabadulását a zsírszövetből.