Az anya magas zsírtartalmú étrend által kiváltott magzati oociták elvesztése összefügg a tüszők kompromittált növekedésével a felnőtt patkány utódokban 1

Michael W. Tsoulis

3 Biokémiai és Orvostudományi Tanszék, McMaster Egyetem, Hamilton, Ontario, Kanada

Pauline E. Chang

3 Biokémiai és Orvostudományi Tanszék, McMaster Egyetem, Hamilton, Ontario, Kanada

Caroline J. Moore

3 Biokémiai és Orvostudományi Tanszék, McMaster Egyetem, Hamilton, Ontario, Kanada

Kaitlyn A. Chan

3 Biokémiai és Orvostudományi Tanszék, McMaster Egyetem, Hamilton, Ontario, Kanada

Wajiha Gohir

3 Biokémiai és Orvostudományi Tanszék, McMaster Egyetem, Hamilton, Ontario, Kanada

James J. Petrik

5 Szülészeti és Nőgyógyászati Osztály 3, McMaster Egyetem, Hamilton, Ontario, Kanada

7 Orvostudományi Tanszék, Guelphi Egyetem, Guelph, Ontario, Kanada

Mark H. Vickers

6 Liggins Institute és Gravida, Nemzeti Növekedési és Fejlesztési Központ, Aucklandi Egyetem, Aukland, Új-Zéland

Kristin L. Connor

8 Egészségtudományi Tanszék, Carleton Egyetem, Ottawa, Ontario, Kanada

Deborah M. Sloboda

3 Biokémiai és Orvostudományi Tanszék, McMaster Egyetem, Hamilton, Ontario, Kanada

4 Gyermekgyógyászati Osztály, McMaster Egyetem, Hamilton, Ontario, Kanada

5 Szülészeti és Nőgyógyászati Osztály 3, McMaster Egyetem, Hamilton, Ontario, Kanada

Társított adatok

Absztrakt

BEVEZETÉS

A túlzott terhességi súlygyarapodás (GWG) fő klinikai kihívás; kockázati tényező a C-szakasz, az anya szülés utáni súlymegtartása, a húgyúti fertőzések, a terhességi cukorbetegség, a preeklampszia és a terhesség alatti magas vérnyomás-rendellenességek szempontjából [1, 2]. Ezenkívül a magzati, az újszülöttkori és a gyermekkori káros hatásokkal is összefüggésben van [3, 4], beleértve a későbbi életkori elhízás fokozott kockázatát [1, 5–7] és az ezzel járó társbetegségeket [8]. Tanulmányok azt mutatják, hogy ezek a hatások az életmódtól és genetikai tényezőktől függetlenül az utódok második és harmadik generációjában átterjednek, ami az egészségügyi hiányosságok több generációval történő folytatódását eredményezi [9–11]. Ugyanúgy az anyai elhízás, vagyis az anya BMI-je> 30 terhesség előtti, hasonló negatív eredménnyel jár az anyában és a magzatban is [2]. Fontos azonban különbséget tenni a túlzott GWG és az anyai elhízás között. A fenotípusos eredmények hasonlósága ellenére az ezeket az eredményeket közvetítő mechanisztikus utak eredendően különböznek egymástól [12]. Mindazonáltal nyilvánvaló, hogy a terhesség alatti „obezogén” környezet rövid és hosszú távon is jelentős terhet ró az egészségügyi rendszerekre.

E riasztó közegészségügyi forgatókönyv ellenére nem világos megértésünk az anyai túlzott GWG és az utódbetegségek kockázata közötti kapcsolatról. Még kevésbé ismeretes a korai életen átesett károk átterjedése az utódok második és harmadik generációjára, bár az elhízás és a kapcsolódó rendellenességek fokozott kockázatát az első generációs utódokban feltételezhetően a magzat fejlődő szervrendszereinek zavarai közvetítik [2]. Tekintettel arra, hogy a magzati petefészek és őssejtjei érzékenyek a terhességi környezeti sértésekre [13–15], valószínűnek tűnik, hogy az anya túlzott GWG-je negatív reproduktív következmények lehetősége mellett hatással lehet az őssejtek fejlődésére. Mivel az első generációs utódok fejlődő magzati petefészkében lévő csírasejtek végül a második generációt (nagy utódokat) fogják megteremteni, a túlzott GWG következtében a méhen belüli hátrányok és a multigenerációs betegség kockázata közötti kapcsolat a fejlődő petefészkekben rejlik. a bennük lévő petesejtek.

Az egészséges petefészkek fejlődésének és későbbi működésének központi eleme az őstüsző medence kialakulása. Az őssejtekben található petesejtek az őssejtekből (PGC) származnak, amelyek az embrionális élet során a hátsó bélből a nemi gerincbe vándoroltak [16, 17]. Az ivarmirigy anlagénjéhez érve a PGC-k mitózison mennek keresztül, ezeknek a csírasejteknek egy része áttér az meiózis I-re, a diplotén szakaszban letartóztatják őket, és ezt követően primer petesejteknek nevezik őket [18]. A szülés utáni naptól (P) 1-től P4-ig rágcsálóknál [19, 20] (embereknél körülbelül 15-20 hét vemhesség) [21, 22] az elsődleges petesejtek egy részét teljesen egy laposított granulosa sejtek egésze veszi körül, és ezt követően őstüszőknek nevezik. A korai életkorban kialakult őshagymák száma nagymértékben meghatározza az emlősök reprodukciós potenciálját és élettartamát, mivel ez az a medence, amelyből a petesejteket előidéző petesejtek származnak. Miután ez a készlet kimerült, a reprodukciós siker csökken vagy megszűnik.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Állatmodell

A prepubertális petefészek fenotípusainak vizsgálata érdekében a CON és a HF csoportból származó nőstény utódok egy részét az elválasztástól kezdve kontroll étrendet etették és egy éjszakán át P27-n éheztették, nátrium-pentobarbitonnal (60 mg · kg −1) altattak, és lefejezéssel megölték. A későbbi biokémiai elemzésekhez törzs vérmintákat vettünk. A petefészkeket boncolgattuk, lemértük, és az egyik petefészket Bouin-oldatban rögzítettük, a paraffint beágyazottuk a szövettani elemzésekhez, míg a másik petefészket folyékony nitrogénben lefagyasztottuk molekuláris elemzések céljából (CON n = 7, HF n = 6).

A felnőtt petefészek fenotípusok P120-nál történő meghatározása érdekében a diestrus stádiumú (hüvelyi kenéssel meghatározott) nőstényeket egy éjszakán át éheztettük, nátrium-pentobarbitonnal (60 mg/kg -1) altattuk és lefejezéssel leöltük. A törzs vérmintáit összegyűjtöttük és feldolgoztuk a későbbi biokémiai elemzésekhez. A petefészkeket boncoltuk, lemértük, és az egyik petefészket Bouin-oldatban rögzítettük, és paraffint ágyaztunk be a szövettani elemzésekhez, míg a másik petefészket folyékony nitrogénben lefagyasztottuk molekuláris analízis céljából (CON n = 9, HF n = 6).

Végül az utódok egy alcsoportjában megvizsgáltuk az elválasztás utáni HF diéta hatását. Az elválasztáskor (P21) a női utódok egy alcsoportját véletlenszerűen osztották be kontroll vagy diétás étrend vagy magas zsírtartalmú étrend (a fentiek szerint részletesen) ad libitum fogadására, a vizsgálat hátralévő részében szabad vízhez jutással . Ez négy felnőtt utódcsoportot hozott létre: CON-con (n = 9), CON-hf (n = 5), HF-con (n = 6) és HF-hf (n = 5), az első rövidítéssel étrend kód, amely az anyai étrendet, a második pedig az elválasztás utáni étrendet jelzi. Ezeket az adatokat kiegészítő adatok mutatják be. (Kiegészítő S1 ábra; az összes kiegészítő adat online elérhető a www.biolreprod.org oldalon).

A petesejtek és a tüszők populációinak morfometriai elemzése

Az embrionális napon (E) 20, P4, P27 és P120 paraffinba ágyazott petefészkeket sorozatosan metszettük; Az E20, P4 és P27 petefészkeket 4 μm-nél, a P120 petefészkeket 8 μm-nél metszettük. Minden ötödik (E20, P4 és P120) vagy 10. (P27) petefészek metszetet hematoxilin- és eozinfestésre dolgoztunk fel, mint korábban [15, 34], egy éjszakán át szárítottuk, és a morfometriai elemzések előtt felhelyeztük.

AMH és AMH receptor II típusú immunolokalizáció

A follikuláris apoptózis meghatározása; Az aktivált kaszpáz-3 immunolokalizálása

Apoptotikus sejtek kimutatása a tüszőkben, a korábban leírtak szerint formálva [37] a magzati, újszülött, prepubertális és felnőtt petefészek szakaszokban (n = 3 csoportonként). Az endogén peroxidáz aktivitás gátlása és az antigén visszanyerés ellenőrzése a fentiek szerint formálódott. A nem specifikus kötődést 5% BSA-val blokkoltuk 10 percig szobahőmérsékleten, és egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk a Cell Signalingtől származó nyúlhasított hasított kaszpáz-3 antitesttel (katalógusszám: 9661), 1: 100 hígítás mellett, egy éjszakán át, 4 ° C-on. A következő napon a szöveti metszeteket szobahőmérsékleten inkubáltuk 2 órán át nyúl elleni biotinilezett szekunder antitesttel (1: 200 hígítás; Sigma-Aldrich), majd 1 órán át ExtrAvidinnel (1:50 hígítás; Sigma-Aldrich) inkubáltuk. Az aktivált kaszpáz-3-at 3,3′-diaminobenzidinnel (DAB tabletta; D4293 termék; Sigma Aldrich) vizualizáltuk, és az összes metszetet ellenfestettük Gills 2 hematoxilinnel (GHS216 termék; Sigma Aldrich). Az apoptotikus sejtek meghatározásához az aktivált kaszpáz-3 immunpozitív sejteket hat látómezőben mértük metszetenként × 250 nagyítással (n = 3 csoportonként). A képelemzést Olympus BX-61 mikroszkóp és integrált MetaMorph szoftver segítségével végeztük. Az adatok a kaszpáz-3 immunpozitív területe az összes elemzett petefészek terület aránya.

Az FSH, LH és E2 keringő plazmaszintjei

A keringő plazma FSH, LH és E2 szinteket a kereskedelemben kapható patkány ELISA-val (FSH a CEA830Ra termékkel; Uscn Life Science Inc.; LH a CEA441Ra termékkel; és E2 az ES180S-100 egér/patkány; Calbiotech termékkel) mértük a gyártók szerint 'specifikációk a P27 és P120 utódokban. Az FSH, az LH és az E2 vizsgálati intra variabilitási együtthatói 5,0, 7,3 és 7,7% voltak.

Molekuláris elemzések

RNS extrakció és reverz transzkripció.

A teljes RNS-t ~ 5 mg fagyasztott, őrölt petefészek szövetből extraháltuk RNeasy mini kit (74104 termék; Qiagen) felhasználásával 350 μl RLT pufferrel (1: 100 hígítás [v: v]; β-merkaptoetanol; M3148 termék; Sigma-Aldrich) a gyártó utasításainak betartásával. Az RNS mennyiségét és tisztaságát NanoDrop 2000 spektrofotométerrel elemeztük; Thermo Scientific). Az RNS integritását az abszorbancia 260/280 nm-nél (A260: A280 nm) és A260: A230 nm-nél mért arányával határoztuk meg minden minta esetében (> 2,0, illetve> 1,5). Az összes RNS-mintát -80 ° C-on tároltuk a cDNS keletkezéséig.

Két mikrogramm teljes RNS-t használtunk az első szálú cDNS-szintézishez Superscript VILO cDNS-szintézis készlet (Life Technologies) felhasználásával a gyártó utasításai szerint, és egy szokásos termociklerrel (C1000 Touch termék; Bio-Rad). A cDNS-t -20 ° C-on tároltuk, amíg kvantitatív PCR (qPCR) vizsgálatokat végeztünk.

qPCR vizsgálatok

Kvantitatív PCR-vizsgálatot hajtottunk végre az előzőekben leírtak szerint [15] a Lightcycler 480 rendszer (Roche Diagnostics) és a LightCycler 480 SYBR Green I Master (katalógusszám 04707516001; Roche Diagnostics) alkalmazásával. Az összes génre vonatkozó primereket az NCBI-nél elérhető (Internet: blast.ncbi.nlm.nih.gov) weboldalon található Primer BLAST szoftver segítségével tervezték. Az alapozókat a Life Technologies vagy az Integrated DNA Technologies gyártotta, és a szekvenciákat az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza. Az optimális primer körülményeket a következő ciklusos körülményekhez igazítottuk: hossza: 20 bp (tartomány: 17–23 bp); olvadási hőmérséklet (Tm): 60 ° C (tartomány: 58–62 ° C); és az amplikon hossza: 50–200 bp. Diszociációs elemzéseket végeztünk a specifitás biztosítása érdekében, és a disszociációs görbékben egyetlen csúcsot produkáló mintákat használtunk.

Az összes qPCR-vizsgálatot kezdeti denaturálással végeztük 95 ° C-on 5 percig, majd a génterméket amplifikáltuk 45 egymást követő ciklusban, 95 ° C-on 10 másodpercig, 60 ° C-on 10 másodpercig és 72 ° C-on 10 percig. mp. A kérdéses gén minden lemeze tartalmazott egy standard görbét (akár 5-szeres, akár tízszeres soros hígítást), amelyet a petefészek-cDNS összesített mintájából állítottunk elő, míg az amplifikációs és a disszociációs görbéket az összes standardhoz és a mintához (LightCycler 480 rendszer; Roche Diagnostics) készítettük. . Minden mintát három példányban futtattunk. Az összes mRNS-adat hét különféle referenciagén (Ywhaz, Ywhag, β-aktin, B2M, SDHA, HPRT és ciklofilin) geometriai átlagához viszonyítva, amelyek szintje csoportonként nem különbözött.

Statisztikai elemzések

ASZTAL 1

A HF-vel táplált gátak által született utódok fenotípusos jellemzői. *