Az anyai allopurinol megakadályozza a szívelégtelenséget a felnőtt férfi utódokban, akiket krónikus hipoxia terhesség alatt programoz

Cambridge-i Egyetem, Élettani, Fejlesztési és Idegtudományi Tanszékről, Egyesült Királyság (Y.N., A.D.K., C.M.L., B.J.A., Y.Y.C., R.N.-D., D.A.G.)

Cambridge-i kardiovaszkuláris stratégiai kutatási kezdeményezés (Y.N., S.E.O., D.A.G.).

Cambridge-i Egyetem, Élettani, Fejlesztési és Idegtudományi Tanszékről, Egyesült Királyság (Y.N., A.D.K., C.M.L., B.J.A., Y.Y.C., R.N.-D., D.A.G.)

Egyetemi Orvosi Központ, Utrecht, Hollandia (J.J.K., J.B.D.)

Cambridge-i Egyetem, Élettani, Fejlesztési és Idegtudományi Tanszékről, Egyesült Királyság (Y.N., A.D.K., C.M.L., B.J.A., Y.Y.C., R.N.-D., D.A.G.)

Cambridge-i Egyetem Metabolikus Kutató Laboratóriumok és Orvosi Kutatási Tanács Metabolikus Betegségek Egysége, Metabolikus Tudományok Intézete, Addenbrooke kórház, Cambridge, Egyesült Királyság (T.J.A., H.L.B., S.E.O.)

Cambridge-i Egyetem Metabolikus Kutató Laboratóriumok és Orvosi Kutatási Tanács Metabolikus Betegségek Egysége, Metabolikus Tudomány Intézet, Addenbrooke kórház, Cambridge, Egyesült Királyság (T.J.A., H.L.B., S.E.O.)

Egyetemi Orvosi Központ, Utrecht, Hollandia (J.J.K., J.B.D.)

Cambridge-i kardiovaszkuláris stratégiai kutatási kezdeményezés (Y.N., S.E.O., D.A.G.).

Levelezés Dino A. Giussani-nak, a Cambridge-i Egyetem Élettani, Fejlesztési és Idegtudományi Tanszékének, Downing St, Cambridge, CB2 3EG, Egyesült Királyság. Email

Cambridge-i Egyetem, Élettani, Fejlesztési és Idegtudományi Tanszékről, Egyesült Királyság (Y.N., A.D.K., C.M.L., B.J.A., Y.Y.C., R.N.-D., D.A.G.)

Cambridge-i kardiovaszkuláris stratégiai kutatási kezdeményezés (Y.N., S.E.O., D.A.G.).

Absztrakt

Az emberi klinikai terápiához képest jobb transzlációs értékű alternatív antioxidáns stratégia lehet a xantin-oxidáz inhibitor allopurinol. A hipoxia a xantin-oxidázból származó szabadgyökök generációjának növekedéséhez vezet, 11 és az embereknél az anya allopurinollal végzett kezelése áthalad a placentán, 12 igazolva ezt a beadási módot a szülészeti gyakorlat megelőző terápiájához. Felmerült, hogy az allopurinol jótékony hatással van az ischaemia-reperfúzió (IR) károsodásának csökkentésére a felnőttek kardiológiájában, valamint a gyermek- és felnőtt kardiotorákos műtétekben. 13,14 Valójában az anyai allopurinol-kezelést fontolgatják humán klinikai vizsgálatok során, hogy megvédjék az újszülött csecsemőt az oxidatív stressz okozta károsodástól a terhességben, amelyet magzati hipoxia bonyolít. 15

Mód

Adatok, anyagok és kódközlési nyilatkozat

A vizsgálat eredményeit alátámasztó adatok ésszerű kérésre a megfelelő szerzőtől állnak rendelkezésre.

Etikai jóváhagyás

Ezt a kutatást az Animals (Scientific Procedures) Act 1986. évi 2012. évi módosító rendelet alapján hagyták jóvá a Cambridge-i Egyetem Állatvédelmi és Etikai Felülvizsgálati Testületének etikai felülvizsgálatát követően.

Állatok

A Wistar patkányokat (Charles River, Ltd, Margate, Egyesült Királyság) egyenként, szellőztetett ketrecekben helyezték el, normál körülmények között, az élelemhez (Special Diet Services, Egyesült Királyság) és a vízhez való szabad hozzáférés mellett. 10 napos akklimatizáció után szűz nőstényeket (n = 56, 10–12 hetes korban) termékeny hím patkányokkal (minimum 12 hetes korúak) párosítottak. A kopulációs dugó jelenlétét a terhesség 0. napjának tekintették (időtartam kb. 21 nap).

Hipoxiás terhesség és anyai allopurinol kezelés

Langendorff szív előkészítése

Szív által stimulált funkció: agonisták és IR kihívás

A szív reakcióképessége a muszkarin agonista Carbachol (karbamilkolin-klorid, Sigma-Aldrich, Co, Ltd, Poole, Egyesült Királyság; tartomány, 10-10-10-6 mol/L) és a β1-adrenoreceptor agonista izoprenalin ([-] - izoprenalin [+] - bitartarát sót, Sigma-Aldrich, Co, Ltd, Poole, Egyesült Királyság; tartomány: 10–11 –10 –7 mol/L) az előzőekben leírtak szerint vizsgáltuk. 22 A végső dózisválasz után, amikor a pulzus és az LVDP visszatért az alapvonalra, a szíveket infravörös fertőzésnek vetették alá, amely 10 perc globális ischaemiaból állt, a perfúzió leállításával, majd 30 perc reperfúzióval.

CK és LDH aktivitás

A koszorúér-szennyvizet (2 ml) az ischaemia (-15 perc) előtt és a reperfúzió kezdetén (0 perc) összegyűjtöttük. A mintákat folyékony nitrogénben azonnal lefagyasztották, és az elemzésig -80 ° C-on tartották. A perfuzátum CK aktivitását bikromatikusan kapcsolt enzimreakciós vizsgálattal (Siemens Dimension RxL analizátor, Malvern, PA) elemeztük. A perfundátum LDH aktivitását kolorimetriás vizsgálattal (Siemens Dimension RxL analizátor, Malvern, PA) elemeztük.

Szívprotein expresszió

4 hónapos korban az egyes almokból származó hím testvér szívét izolálták, folyékony nitrogénben lefagyasztották és -80 ° C-on tartották. A szív β1-adrenerg receptorának, az M2 Ach receptornak és a SERCA2a fehérje expresszióját Western-blot segítségével határoztuk meg; 23 Minden mintához 10 µg fehérjét töltöttünk. Az egyenlő fehérjetöltést Coomassie kék festéssel igazoltuk. Az alkalmazott antitestek a β1-adrenerg receptor (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), az M2 Ach receptor (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) és a szív SERCA2a, Cell Signaling, Danvers, MA voltak. Torma-peroxidázhoz kapcsolt második antitest (Jackson ImmunoResearch) kötődést Super15 Signal West Pico kemilumineszcens szubsztrát (Thermo Scientific, Egyesült Királyság) segítségével detektáltunk. Az autoradiografált képeket az AlphaEase (Alpha Innotech) alkalmazásával számszerűsítettük.

Statisztikai analízis

A korábbi adatsorokból levezetett megfelelő teljesítményszámításokat végeztük el a statisztikai szignifikancia eléréséhez szükséges minimális mintaméret meghatározásához P

1.ábra. A szív bazális funkciója. Az értékek pontjelek, valamint az átlag ± SEM. A csoportok normoxikus (N; n = 9), hipoxikus (H; n = 8), hipoxiásak allopurinollal (HA; n = 8) és normoxikusak allopurinollal (NA; n = 9) terhesség alatt. Jelentős különbségek (P

Szívreakciók az autonóm agonistákra

A normoxikus terhesség felnőtt hím utódainak szívében dózisfüggő kronotrop (szívfrekvencia) és inotrop (LVDP) válasz mutatkozott az agonistákra (S1 táblázat a csak online elérhető kiegészítésben). A hipoxiás terhesség felnőtt hím utódai csökkent kardiális negatív kronotrop és inotrop válaszokat mutattak a karbacholra, míg az izoprenalinra gyakorolt pozitív kronotrop és inotrop válaszok szignifikánsan fokozódtak (S1. Táblázat). Következésképpen az izoprenalinhoz adott maximális válaszok aránya a karbacholhoz viszonyítva jelentősen megnőtt (2. ábra). Az allopurinollal kezelt, hipoxiás terhesség felnőtt hím utóinak szívében már nem jelentkeztek ezek a hatások (S1. Táblázat és 2. ábra). Az allopurinollal kezelt normox terhesség felnőtt hím utóinak szívében az inotrop válasz károsodott a karbacholra (S1. Táblázat).

2. ábra. Szívszimpatikus dominancia. Az értékek pontjelek, valamint a szív kronotrop és inotrop válaszainak aránya az izoprenalinra és a karbacholra átlag ± SEM. A csoportok normoxikus (N; n = 9), hipoxikus (H; n = 8), hipoxiásak allopurinollal (HA; n = 8) és normoxikusak allopurinollal (NA; n = 9) terhesség alatt. Jelentős különbségek (P

Ischemia/Reperfusion Challenge

A hipoxiás terhesség felnőtt hím utódai károsodott szívfelépülést mutattak IR-re (3A. Ábra) és megnövekedett CK- és LDH-szennyvízszinteket (3B. És 3C. Ábra) a reperfúzió kezdetekor. Az allopurinollal kezelt hipoxiás terhesség felnőtt hím utódai helyreállított szív-helyreállítási választ mutattak IR-re és normalizált CK és LDH-ra (3A. Ábra - 3C. Ábra).

3. ábra. Szív iszkémia-reperfúziós kihívás. Az értékek pont ábrák vagy átlag ± SEM értékek az iszkémia-reperfúzióra adott bal bal kamrai fejlett nyomás (LVDP) reakcióra, valamint a perfuzátum CK (kreatin kináz) és LDH (laktát dehidrogenáz) szintekre. A csoportok normoxikus (N; n = 9), hipoxikus (H; n = 8), hipoxiásak allopurinollal (HA; n = 8) és normoxikusak allopurinollal (NA; n = 9) terhesség alatt. Jelentős különbségek (P

Szívprotein expresszió

A hipoxiás terhesség felnőtt hím utódai a SERCA2a fokozott szívfehérje-expresszióját mutatták, anélkül, hogy a β1-adrenerg vagy 2-es típusú muszkarin receptor expressziójára jelentős hatással lett volna (4A-4C. Ábra). Az allopurinollal kezelt hipoxiás terhesség felnőtt hím utódai a SERCA2a szívfehérje-expresszióját helyreállították (4A. Ábra). Az allopurinollal kezelt normox terhesség felnőtt hím utódai a SERCA2a fokozott szívfehérje-expresszióját mutatták a kezeletlen normoxikus terhesség felnőtt hím utódainak szívéhez viszonyítva (4A. Ábra), nincs hatással a β1-adrenerg vagy 2-es típusú muszkarin receptorok fehérje-expressziójára.

4. ábra. Szívfehérjék expressziója. Az értékek pontjelek, valamint az átlag ± SEM. A csoportok normoxikusak (N; n = 6), hipoxiásak (H; n = 6), hipoxiásak allopurinollal (HA; n = 6) és normoxikusak allopurinollal (NA; n = 6) terhesség alatt. Jelentős különbségek (P 2+ ATPáz 2a.

Terhességi jellemzők és utódbiometria

A terhesség hossza, az alom nagysága és a férfi/nő arány értékei nem különböztek csoportonként (táblázat). A hipoxiás terhesség nem befolyásolta a születési súlyt vagy a test növekedésének szimmetriáját. A normoxikus terhességhez viszonyítva a hipoxiás terhesség felnőtt hím utódainak szíve hasonló súlyú volt, de a bal kamra abszolút súlya csökkent (táblázat). A hipoxiás terhességben szenvedő anyai allopurinol nem befolyásolta a terhesség jellemzőit vagy a hím utódok biometriáját, és nem állította vissza a kezeletlen hipoxiás terhesség felnőtt férfi utódainál mért abszolút LV-súly csökkenését (táblázat). Normoxikus terhesség alatt az allopurinollal végzett anyai kezelésnek semmilyen hatása nem volt (táblázat).

asztal. Terhességi jellemzők és utódbiometria

Az értékek átlag ± SEM az anyai és utódváltozókra. A csoportok N (n = 10–17), H (n = 8–21), HA (n = 8–22) és (NA, n = 10–17) terhesség. abs jelzi az abszolút súlyt; CRL, korona-far hossza; H, hipoxiás; HA, hipoxiás, allopurinollal kezelve; LV, bal kamra; N, normoxikus; NA, normoxikus, allopurinollal kezelve; PI, ponderális index (testtömeg. [CRL 3] -1); rel, relatív súly; és RV, jobb kamra.

*Jelentős különbségek (P 2+ menedzsment. A CK és az LDH aktivitása a szívkoszorúér-perfuzátumban IR után a hipoxiás terhesség felnőtt hím utódainál is megemelkedett, ezáltal összekapcsolva a szívstressz és sérülés molekuláris markereit a megnövekedett szívérzékenységgel az IR sérülésekre (5. ábra).

5. ábra. A legfontosabb megállapítások összefoglalása. A hipoxiás terhesség programja a szívelégtelenséget felnőtt férfi utódokban. Az érintett mechanizmusok közé tartozik a xantin-oxidáz növekedése, a szív szimpatikus dominanciája és a szív kalciumbiológiájának megváltozása. A xantin-oxidáz gátlóval, az allopurinollal végzett anyai kezelés megakadályozza a felnőtt férfi utódok programozott szívműködési zavarait, normalizálva a szív szimpatikus dominanciáját és megváltoztatva a szív kalciumbiológiáját. Ezért a xantin-oxidázból származó oxidatív stressz fontos szerepet játszik a szívműködési zavarok fejlesztési hipoxiával történő programozásában. Az allopurinollal végzett anyai kezelést klinikai beavatkozásnak kell tekinteni a szívbetegség programozása ellen az emberi magas kockázatú terhesség felnőtt utódainál. Az IR iszkémia-reperfúziót jelez; LV, bal kamra; ROS, reaktív oxigénfajok; és SERCA2a, szarkoplazmatikus retikulum Ca2 + ATPáz 2a.

A jelenlegi tanulmány további adatai azt mutatják, hogy a hipoxiás terhesség hím utódainak szívében fokozott a szimpatikus dominancia. A hypoxiás terhesség utódainál a SERCA2a szívfehérje szintjének növekedése ismét szerepet játszhat ebben a programozott válaszban, mivel a SERCA2a elősegíti a szív kontraktilitásának növekedését és a szív β-adrenerg receptorainak foszforilátjainak stimulálását és inaktiválja a foszfolambanot, a SERCA inhibitorát. 28 A fokozott szívszimpatikus dominancia része a kompenzációs neuroendokrin mechanizmusnak, amely növeli a szívizom kontraktilitását és fenntartja a szívteljesítményt a hipoxiás terhesség fiatal felnőtt utódainál. Az ilyen kompenzációs válaszok azonban később az életben dekompenzálódhatnak, mivel a szimpatikus dominancia és a szívizom kontraktilitásának tartós növekedése nem fenntartható, káros hatásokat vált ki a szívműködésben, és végül szívelégtelenséghez vezet. 29,30

A bazális koszorúér-áramlás csökkenését a szívkárosodás megnövekedett kockázatával kapcsolják össze az IR hatására. 30,31 Ezzel az állítással összhangban a hipoxiás terhesség felnőtt hím utódainak szívében az ischaemia után az IR-helyreállítás károsodott, az LDH és a CK pedig fokozottan emelkedett a szívkoszorúér-szennyvízben. Az LDH részt vesz a glükóz metabolizmusában és katalizálja a laktát és a piruvát interkonverzióját, míg a CK a kreatin átalakulását foszfokreatinná, amely felelős az ATP transzferéért és hasznosításáért. A kardiomiociták károsodása esetén az LDH és a CK felszabadul a citoplazmából a véráramba, ezt a hatást klinikailag kiaknázzák a szívkárosodás megalapozott biomarkereiként. 7,31 Az LDH és a CK szennyvízszintjének emelkedése közvetlenül az ischaemia után tehát erős bizonyíték arra, hogy a hipoxiás terhesség utódainak szívében megnő az IR sérülés kockázata.

Perspektívák

A fejlődő hypoxia, amely az emberi káros terhességi programok leggyakoribb eredménye, megnövekedett szívbetegség kockázatot jelent a felnőtt utódokban. Megalapozott rágcsáló-modell segítségével itt megmutatjuk, hogy a xantin-oxidáz-eredetű oxidatív stressz a fejlődési hipoxiát összekapcsolja a szívműködési zavarokkal, valamint a szívstressz és sérülés molekuláris mechanizmusaival a felnőtt utódokban. Ezenkívül az anya allopurinollal történő kezelése védő. Ezért a xantin-oxidáz-eredetű oxidatív stressz célzott gátlása jobb transzlációs értéket kínálhat a humán klinikai terápiában, hogy megakadályozza a szívműködési zavarok programozását a magas kockázatú terhesség utódainál.

A finanszírozás forrásai

Ezt a tanulmányt a British Heart Foundation támogatta, London, Egyesült Királyság. D. Giussani a Cambridge-i Egyetem Élettani, Fejlesztési és Idegtudományi Tanszékének fejlõdõ szív- és érrendszeri élettanának és orvostudományának professzora, a Gonville és a Caius College orvostudományi professzora és orvostudományi igazgatója, a Lister Institute munkatársa és a Royal Society Wolfson Kutatási Érdemdíjas.