Az ateroszklerózis jelentős csökkenése a frankalkin (CX3CL1) -hiányos egereknél a brachiocephalicus artériánál történik, nem az aorta gyökérnél

Közreműködött: Jan L. Breslow, 2004. november 4

Absztrakt

énA gyulladásos folyamatok kritikus szerepet játszanak az atherogenezisben (1). A monociták tapadnak az érfalhoz, és beszerveződnek a subendoteliális térbe, ahol makrofágokká differenciálódnak, majd habsejtekké fejlődnek (2). Az adhéziós molekulák és kemokinek fontos szerepet játszanak a korai elváltozások kialakulásában (3-5). A fraktalkin (CX3CL1) ebből a szempontból különösen érdekes, mert nemcsak a monociták és a T-sejtek erős kötődését közvetíti az endotheliumhoz, hanem leválasztható a sejtmembránról és kemokinként szolgál (6, 7). A fraktalkin egy N-terminális kemokin doménből, egy mucinszerű szárból, valamint transzmembrán és citoplazmatikus doménekből áll. Az ADAM-17 metalloproteáz hasíthatja a mucinszerű szárat és felszabadíthatja az oldható kemokin domént (8). Meghatározták a CX3CR1 fraktalkinreceptort, amely egy G-fehérjéhez kapcsolt receptor, amely képes közvetíteni a leukocita adhéziót és migrációt, és kiváltja a jelátvitelt is (7, 9).

A frankalkin és a CX3CR1 egyaránt expresszálódik emberek és egerek érelmeszesedéses elváltozásaiban (10). A 249. aminosavmaradékot megváltoztató CX3CR1 polimorfizmus az akut koszorúér-események fokozott kockázatával (11), valamint a szívkoszorúér-betegség prevalenciájával és súlyosságával jár (12). Ugyancsak kimutatták, hogy a CX3CR1-hiányos egerek csökkentették az ateroszklerotikus elváltozásokat az érelmeszesedést érzékenyítő apolipoprotein E-hiányos háttéren (13, 14).

A frankalkin érelmeszesedésre való fogékonyságra gyakorolt hatásáról azonban még nem számoltak be. Kimutatták, hogy a fraktalkin knockout egerek normál bruttó anatómiai és hematológiai profilokkal rendelkeznek, kivéve az F4/80 sejtfelszíni markert expresszáló keringő leukociták számának csökkenését (15). Érdekes módon a frankalkinhiányos egerek kevésbé voltak érzékenyek az agyi iszkémia-reperfúziós sérülésekre (16).

A mostani vizsgálat célja a frankalkinhiány hatásának vizsgálata volt az aorta gyökér és a brachiocephalicus artéria (BCA) ateroszklerotikus elváltozásainak kialakulásában apolipoprotein E-hiányos (ApoE -/-) és alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) -receptorban (LDLR) -hiányos (LDLR -/-) egerek.

Mód

Fraktalkin genotipizálás. Az állatok genotípusának meghatározásához a genomikus DNS PCR-jével meghatároztuk a frankalkinhiányt. Mind a vad típusú, mind a mutáns allélek esetében a következő közös előindítót alkalmaztuk: CX3CL1-com, GCGAAGGAGTCTGCGGGTAGC. A vad típusú és a mutáns allél reverz primerei a következők voltak: CX3CL1-wt, TCACTCCACATTGTGGGAAAGGAA; és CX3CL1-ko, CGTGGGATCATTGTTTTTCTCTTG. A PCR-termékeket agarózgél-elektroforézissel választottuk el. Az allélméretek a vad típusnál 415 bp, a frankalkin knockout allél esetében 563 bp voltak.

Vérelemzések. Az ölés idején a teljes vért bal kamrai szúrással vették. A vérsejtszámláláshoz 36 μl teljes vért hígítottunk 144 μl 5% BSA-t tartalmazó PBS-ben, és elemeztük egy automatizált hematológiai elemzővel (Advia 120, Bayer, Wuppertal, Németország), amelyet kalibráltunk egérvérre. A lipoproteineket szekvenciális ultracentrifugálással izoláltuk 60 μl plazmából 1,063 g/ml (nagy sűrűségű lipoprotein) sűrűségű (d) TL-100 ultracentrifugában (Beckman Coulter). A koleszterint enzimatikusan határoztuk meg kolorimetriás módszerrel (Roche).

Az ateroszklerózis számszerűsítése. Az ateroszklerózis számszerűsítéséhez az aorta gyökérnél a formalinnal fixált szíveket a leírásnak megfelelően dolgoztuk fel (18). Az atherosclerosis számszerűsítéséhez a BCA-nál az OCT-vegyületbe ágyazott ereket 10 μm vastagságban disztálisról proximálisra metszettük. A belső rugalmas lemezhez luminalisan érkező ateroszklerotikus elváltozásokat három egyenlő távolságú, olajvörös színű O-festett szakaszon számoltuk 200, 400 és 600 μm távolságban a BCA elágazási pontjától a carotis és a subclavia artériákba (18).

Immunfestés. A BCA fagyasztott szakaszait jéghideg acetonban rögzítettük (10 perc) és PBS-sel mostuk. A peroxidázokat 1% H2O2-val leállítottuk (10 perc). A metszeteket 5% normál szérummal (kecskeszérum, CD68 és juhszérum, a-aktin és CX3CL1) 20 percig mossuk és blokkoljuk. Az elsődleges antitesteket 60 percig inkubáltuk (patkány anti-egér CD68, MAC1957GA, Serotec, 1: 100 hígítás; nyúl anti-egér α-aktin, BT-560, Biomedical Technologies, 1:80 hígítás; és nyúl anti-egér CX3CL1, Millennium Pharmaceuticals, 1:80 hígítás). A metszeteket torma-peroxidáz (HRP) konjugált másodlagos antitesttel (1:50 hígítás) inkubáltuk 30 percig (kecske anti-patkány IgG/HRP, STAR 72, Serotec, CD68 esetén; juh nyúl elleni IgG/HRP STAR54, Serotec, az a-aktin és a CX3CL1 esetében). Mosás után a peroxidázt Nova Red-szel (Vector Laboratories) inkubálva vizualizáltuk, majd a metszeteket hematoxilinnel festettük. A szakaszokat szárítottuk és tartósan VectaMount szerelőközeggel szereltük fel (Vector Laboratories).

Statisztikai analízis. Az összes adatot átlag ± SD-ben fejezzük ki, hacsak másként nem jelezzük. Két csoport között statisztikailag szignifikáns különbségeket elemeztünk Mann-Whitney vagy χ 2 tesztekkel. Statisztikailag szignifikáns különbségeket több mint két csoport között elemeztünk Kruskal-Wallis teszt és egy utóvizsgálat segítségével a két csoport (prizma szoftver, GraphPad) közötti különbségek meghatározására. A kovariancia elemzését ncss szoftverrel számoltuk. A ≤0,05 valószínűségi értéket szignifikánsnak tekintették.

Eredmények

Ateroszklerotikus elváltozás területe CX3CL1-hiányos B6.ApoE -/- egerekben 16 hetes korban az aorta gyökérnél és a BCA-nál. A BCA metszeteit 200, 400 és 600 μm-rel számszerűsítettük a BCA elágazási pontjától a subclavia és a carotis artériák felé. (A) Aorta-gyökér elváltozás területe a nőstény B6.ApoE -/- egerekben. (B) BCA elváltozás területe a nőstény B6.ApoE -/- egerekben. (C) Aorta-gyökér elváltozás területe hím B6.ApoE -/- egerekben. (D) BCA elváltozás területe hím B6.ApoE -/- egerekben. A sávok a ± SEM átlagot jelentik, és az egyes csoportokban az állatok száma meg van adva a sávokon.

A frankalkinhiánynak az érelmeszesedés progressziójára gyakorolt hatását az LDLR-hiányos háttéren is megvizsgáltuk. A fraktalkin-hiány nem befolyásolta a nők testsúlyát; hímeknél azonban szignifikáns hatás volt, ami nagyrészt a frankalkin heterozigóta knockout állatok súlyának csökkenésének tudható be (Kruskal-Wallis teszt, P = 0,02; Dunn utóvizsgálata, P -/- CX3CL1 +/+ egerek, aorta-gyökér elváltozás területe) nőstényekben szignifikánsan, 28% -kal csökkent a B6.LDLR -/- CX3CL1 +/- és 35% -ban a B6.LDLR -/- CX3CL1 -/- egerekben (101 663 ± 38 987 μm 2 vs. 73 468 ± 28 599 μm 2 és 65 870 ± 24 381 μm 2; Kruskal-Wallis teszt, P = 0,001; Dunn utóvizsgálata, P -/- CX3CL1 hiányos egerek függetlenek a teljes és az LDL-koleszterin szint csökkenésétől. Összehasonlítva a B6LDLR -/- CX3CL1 +/+ egerekkel, a frakkalkin heterozigóta vagy homozigóta knockout egereknél nem volt szignifikáns csökkenés az aorta-gyökér elváltozásban (35,936 ± 17,976 μm 2 vs. 29,976 ± 18,056 μm 2, illetve 32 360 ± 17 890 μm 2).

Ateroszklerotikus elváltozás területe CX3CL1-hiányos B6.LDLR -/- egerekben 16 hetes korban az aorta gyökérnél és a BCA-nál. A BCA metszeteit 200, 400 és 600 μm-rel számszerűsítettük a BCA elágazási pontjától a subclavia és a carotis artériák felé. (A) Aorta-gyökér elváltozás területe nőstény B6.LDLR -/- egerekben. (B) BCA elváltozás területe nőstény B6.LDLR -/- egerekben. A sávok a ± SEM átlagot jelentik, és az egyes csoportokban az állatok száma meg van adva a sávokon.

A BCA elváltozások területei lényegesen kisebbek voltak a B6.LDLR -/- háttérben, mint a B6.ApoE -/- háttérben. Mindazonáltal, összehasonlítva a B6.LDLR -/- CX3CL1 +/+ egerekkel, a nőstény B6.LDLR -/- CX3CL1 -/- egereknél a BCA elváltozás területe ~ 50% -kal csökkent 200 μm-nél (11 500 ± 9 969 μm 2 és 4 752 ± 6 637 μm 2; P = 0,02), de a 400 vagy 600 μm szakaszokban nem volt szignifikáns különbség (2B. Ábra). A BCA elváltozások területeit nem számszerűsítették hím egerekben, mert az elváltozások sokkal kisebbek, mint a nőstény egerekéi (18), és a vizsgálat körülményei között nem voltak elég nagyak ahhoz, hogy érdemben összehasonlíthassák a különböző genotípusokat.

Ateroszklerotikus elváltozás területe CX3CL1-hiányos B6.ApoE -/- egerekben 12 hetes korban. (A) Aorta-gyökér elváltozás területe a nőstény B6.ApoE -/- egerekben. (B) Aorta-gyökér elváltozás területe hím B6.ApoE -/- egerekben. A sávok a ± SEM átlagot jelentik, és az egyes csoportokban az állatok száma meg van adva a sávokon. n.s., nem jelentős.

Valószínű, hogy a frankalkin adhéziós molekulaként és kemokinként vesz részt az ateroszklerotikus elváltozások kialakulásában, monocitákat toborozva az érfalba, amelyek ezt követően makrofágokká alakulnak. Ezért a kontroll és a frakcionin-hiányos egerekben a bifurkációhoz közeli 200 μm-es BCA-ban a makrofág-felhalmozódást CD68 festéssel számszerűsítettük. A B6.ApoE -/- egerekben a frankalkinhiány a CD68 festési terület 80% -os csökkenését eredményezte (30 439 ± 19 729 μm 2 vs. 6 014 ± 9 591 μm 2, P -/- egerek, a frankalkin hiány 57% -kal csökkentette a CD68 festési területet % (12 800 ± 10 605 μm 2 vs. 5 468 ± 7 016 μm 2, P = 0,01) (4B ábra).

A ateroszklerotikus elváltozások CD68-val festett területe a BCA-ban CX3CL1-hiányos B6.ApoE -/- és B6.LDLR -/- egerekben 16 hetes korban. (A) Nőstény B6.ApoE -/- egerek. (B) Nőstény B6.LDLR -/- egerek.

Reprezentatív soros szakaszok a BCA-n keresztül a CX3CL1-hiányos B6.ApoE -/- egereknél 16 hetes korban. Olajvörös O festés CX3CL1 +/+ (A) és CX3CL1 -/- (B) egerekben. CD68 festés (piros) CX3CL1 +/+ (C) és CX3CL1 -/- (D) egerekben. CX3CL1 festés (piros) CX3CL +/+ (E) és CX3CL1 -/- (F) egerekben. α-aktin festés (piros) CX3CL1 +/+ (G) és CX3CL1 -/- (H) egerekben.

Reprezentatív soros szakaszok a BCA-n keresztül a CX3CL1-hiányos B6.LDLR -/- egereknél 16 hetes korban. Olajvörös O festés CX3CL1 +/+ (A) és CX3CL1 -/- (B) egerekben. CD68 festés (piros) CX3CL1 +/+ (C) és CX3CL1 -/- (D) egerekben. CX3CL1 festés (piros; nyilakkal jelölt belső rugalmas réteg alatt) CX3CL +/+ (E) és CX3CL1 -/- (F) egerekben. α-aktin festés (piros) CX3CL1 +/+ (G) és CX3CL1 -/- (H) egerekben.

Vita

Ez a tanulmány a frankalkinhiány feltűnő hatását mutatja az atheroscleroticus elváltozás területére a BCA-ban, az aorta gyökérre csak kismértékű hatást gyakorol. A fraktalkinhiány mind a nőstény, mind a hím B6.ApoE -/- egerekben ~ 85% -kal csökkentette a BCA karotid és subclavia artériákba történő bifurkációjához legközelebb eső részét. Ezzel szemben ugyanazon a genetikai háttéren, ugyanabban az időpontban a frankalkinhiány nem volt hatással az aorta-gyökér elváltozás területére nőstény vagy hím egerekben. Bár a frankalkinhiány egy korábbi időpontban csökkentette az aorta-gyökér elváltozás területét is, ez a hatás viszonylag kicsi volt (~ 30%), és csak nőknél jelentkezett. A B6.LDLR -/- szenzibilizáló háttérben mind az aorta gyökér, mind a BCA elváltozás területe kezdetben kisebb volt, a fraktalkinhiány pedig az aorta-gyökér elváltozás területét nőstény egerekben ~ 35% -kal és a BCA-hoz legközelebb eső részében csökkentette. elágazása ~ 50% -kal. Ezen a háttéren a frankalkinhiány nem volt hatással hím egerek aorta-gyökér elváltozásának területére, és nőstény egerekben nem volt hatással a BCA elváltozás területére az érnek az aortához legközelebb eső részében. Így a fraktalkin ateroszklerotikus elváltozások fejlődésére gyakorolt hatását erősen befolyásolja a lézió helye és a szenzibilizáló háttér.

Összefoglalva megállapítottuk, hogy a frankalkinhiány fő hatása az érelmeszesedésre a BCA-nál, nem pedig az aorta gyökérnél volt. Erős bizonyítékot találtunk egy specifikus fraktalkin-háttér kölcsönhatásra is. Eredményeink eltérnek a fraktalkin receptor, a CX3CR1 knockout esetében közölt eredményektől, de jelenleg nem állapítható meg, hogy ez a különbség a kísérleti körülmények különbségeinek vagy a frankalkin és receptora közötti bizonyos mértékű nem átfedő funkcióknak köszönhető-e.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Adam D. Persky, Helen Yu és Suey Lee technikai segítségét. Ezt a munkát a HL-54591-08 és a HL70524-02 nemzeti egészségügyi intézetek támogatták. D. T. a Deutsche Forschungsgemeinschaft Emmy Noether program munkatársa volt (DFG Te 342/1-1).

Lábjegyzetek

↵ § Kihez kell címezni a levelezést: The Rockefeller University, Box 179, 1230 York Avenue, New York, NY 10021. E-mail: breslowrockefeller.edu .

↵ † Jelenlegi cím: Laboratóriumi Orvostudományi, Klinikai Kémiai és Molekuláris Diagnosztikai Intézet, Lipcsei Egyetemi Kórház, 04103 Lipcse, Németország.

Szerző közreműködései: D.T., S.P., M.T., J.-C.G.-R., R.K. és J.L.B. tervezett kutatás; D.T., S.P., M.T., J.-C.G.-R., R.K. és J.L.B. végzett kutatás; D.T., S.P., M.T., J.-C.G.-R., R.K. és J.L.B. új reagensekkel/analitikai eszközökkel járult hozzá; D.T., S.P., M.T., J.-C.G.-R., R.K. és J.L.B. elemzett adatok; és D.T., S.P., M.T., J.-C.G.-R., R.K. és J.L.B. írta a lap.

Rövidítések: BCA, artéria brachiocephalicus; LDL, alacsony sűrűségű lipoprotein; LDLR, LDL receptor.