Az emberi elhízás hipotalamusi gyulladását környezeti és genetikai tényezők közvetítik

Absztrakt

Bevezetés

Az elhízást ma széles körben krónikus neuroendokrin betegségnek tekintik, amelynek központi rendellenessége a központi étvágyszabályozásban rejlik. A mediobasal hypothalamus (MBH) a perifériás anorexigén és orexigén jeleket integrálja a jóllakottság vagy az éhség nettó érzésének meghatározására (1). Az elmúlt évtizedekben meggyőző bizonyítékokat szolgáltattak arról, hogy a zsírszövetből felszabaduló leptin az egyik legfontosabb anorexigén jel a perifériáról az agyba, és hogy az MBH-ban a leptin-rezisztencia gyakori patológia a rágcsálók és az emberek elhízásában (2). Míg a leptinrezisztencia szorosan összefügg a gyakori egy nukleotid polimorfizmusokkal (SNP), például a melanocortin 4 receptorban (MC4R) (3), általánosan elfogadott, hogy a genetikai tényezők csak az elhízási járvány egy részét magyarázhatják.

Az elhízáshoz kapcsolódó alacsony fokú gyulladást kezdetben a zsírszövetben írták le (4–6). 2005-ben publikálták az első tanulmányt, amely arra utal, hogy elhízott állatok hipotalamuszában is előfordulhat gyulladás (7). Ebben az index vizsgálatban a magas zsírtartalmú étrendű patkányok hosszú távú táplálása MBH gyulladást váltott ki, és ez az elhízás kialakulásával járó hipotalamusz leptin rezisztenciát váltotta ki (7). Szövettanilag a hipotalamusz-gyulladást (HI) a gliosis jellemzi, amely a mikroglia behatolását és az asztrociták szaporodását foglalja magában, ami megnövekedett sejtsűrűséget eredményez (8). Állatmodellekben az MBH gyulladás és a gliozis még a testsúly növekedése előtt is kimutatható, ami arra utal, hogy a HI valóban okozhat okot az elhízás patofiziológiájában (9).

Míg a HI és a gliosis megállapításait több független csoport is megerősítette rágcsálók és nem emberi főemlősök állatmodelljeiben (8–10), a humán HI-ra vonatkozó adatok még mindig ritkák. 2012-ben 34 emberi alany agyi MRI-jének retrospektív elemzése 17,7 és 44,1 kg/m 2 közötti BMI-érték mellett elhízott embereknél az MBH T2-súlyozott MRI-jének hiperintenzitását tárta fel, amely szignifikánsan összefüggött a BMI-vel (9). Ezenkívül egy prospektív tanulmányt tettek közzé az elmúlt évben, amely 67 résztvevőnél MRI-t is használt (11). Megállapították, hogy egy hosszabb T2 relaxációs idő magasabb BMI-vel volt összefüggésben, és hangsúlyosabb volt a bal MBH-ban, és a jobb MBH hosszabb T2 relaxációs időt mutatott csak azoknál az egyéneknél, akiknél a bal oldali jel intenzitása legnagyobb. Fontos, hogy ebben a közelmúltbeli tanulmányban Ellen Schur és munkatársai MRI-vizsgálatokat is végeztek a halálozás utáni agyszeleteken, és MRI-adataikat összefüggésbe hozták a glia fibrilláris savas fehérje szövettani festésével. Ezzel a megközelítéssel meggyőzően megerősítették, hogy az MRI valóban kimutatta a HI-t és a gliozist, igazolva, hogy ez a technika megbízható módszer az MBH-gyulladás helyettesítő markereinek kimutatására humán vizsgálatokban.

A jelenlegi tanulmányban nem elhízott és elhízott személyeket vizsgáltunk az agy MRI, részletes táplálkozási elemzés, 16S rDNS mikrobiom szekvenálás és tömb alapú genotipizálás kombinálásával, hogy további betekintést nyerjünk a humán elhízás HI-ba.

Kutatási tervezés és módszerek

MRI és spektroszkópia

Az MRI vizsgálatokat 3T MRI szkenneren (Achieva; Phillips Medical Systems, Eindhoven, Hollandia) végeztük 32 csatornás fejtekerccsel. A spektroszkópiai adatokat a Philips SpectroView csomag segítségével elemeztük. A metabolitok elemzéséhez az N-acetil-aspartátot (NAA) összehasonlítottuk a kreatinnal (Cr) (12,13).

A 16S baktérium rRNS gén szekvenálását, minőségellenőrzését és bioinformatikai elemzését a korábban leírtak szerint végeztük (14).

Tömb alapú genotipizálás

A FoCus (Food Chain Plus) mintákat az OmniExpress Exome tömbön írtuk be. A genotipizálási adatok szigorú minőségellenőrzésen mentek keresztül (15), így 1751 minta 964 193 közös és ritka SNP-vel maradt.

Szövetgyűjtemény

Két alany hipotalamiját boncoláskor boncoltuk, semleges pufferolt 10% -os formalinba merítve rögzítettük, dehidratáltuk és paraffinba ágyazottuk. A soros koronális agymetszeteket az optikai chiasma szintjétől a mammilláris testek farokhatáráig vágtuk. A hipotalamusz egymást követő 4 μm-es szakaszait (preopticus, supraopticus, tuberalis és mammillary hypothalamusos területek) deparaffinizáltuk és rehidratáltuk osztályozott alkoholokban.

Immunhisztokémiai festések és fotomikrográfia

A humán postmortem hipotalamusz szöveti szakaszokat standard citrát alapú hőantigén-visszakeresési eljárásnak vetettük alá, háromszor PBS-ben mostuk és 0,75% BSA-val PBS-ben blokkoltuk 45 percig. A metszeteket ezután az elsődleges antitestekkel (antiglia fibrilláris savas fehérje [αGFAP], nyúl monoklonális vagy anti-IBA1, nyúl monoklonális [Abcam]) inkubáltuk 1: 500/1: 250 hígítással 0,75% BSA-val 4 ° C-on. C éjszakán át, ill. A PBS-ben végzett megfelelő mosási lépések után szövethez kötött antitesteket detektáltunk biotinilált kecske anti-nyúl IgG antitestekkel (Vector Laboratories), majd torma-peroxidázzal konjugált avidint, mindkettőt PBS-ben 1: 200-ra hígítva. A primer antitestek kihagyásával csak másodlagos antitesteket és/vagy torma-peroxidáz-konjugált avidint használtunk kontrollként. A jel detektálására standard kromogén technikákat (Vector Laboratories) alkalmaztunk.

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzéseket és grafikákat R (16) alkalmazásával végeztük. Az adatok normális eloszlásának igazolásához Shapiro-Wilk tesztet és vizualizációs módszereket alkalmaztunk. A csoportok összehasonlításához kétfarkú t tesztet vagy Wilcoxon rangösszeg tesztet alkalmaztunk. A kiugró értékeket vizuálisan azonosították. Eltérő rendelkezés hiányában a P érték 5%, MC4R esetén n = 1 SNP, JNK n = 6 SNP, NF-ĸB n = 13 SNP és FTO n = 137 SNP esetén.

Mikrobiom elemzés

Az n = 26 nemzetség magjának mérhető mikrobiomjának minden nemzete (számlálási adatai) egyenként korrelált az elhízott emberi csoport MBH/amygdala jelarányával (n = 48), míg a P értékeket az AS_89 (18) algoritmus segítségével számoltuk. Valamennyi korrelációt a Spearman rang-korrelációs teszttel hajtottuk végre, a nem paraméteres eloszlás miatt.

MRS adatelemzés

Megvizsgáltuk az NAA/Cr (L) és az MBH/amygdala szignálarány (L) közötti nemlineáris kapcsolatok különböző lehetséges formáit (mind a teljes mintában, mind az elhízott és nem elhízott alanyok esetében külön-külön), különös tekintettel a küszöbhatásokra, az exponenciális és az U- vagy S alakú kapcsolatok. Miután szétszórt sávok vizuális vizsgálatával megerősítettük, hogy ilyen összefüggések nincsenek, lineáris modellben függő változóként az NAA/Cr (L) ranggal transzformált értékeit használtuk, amelyek bármilyen monoton (szintén nemlineáris) kapcsolatot kimutattak az NAA/Cr ( L) és MBH/amygdala jelarány (L).

Etika

A tanulmányt a németországi Kielben működő helyi etikai bizottság jóváhagyta (A156/03-4/13), és minden egyes probát megalapozott beleegyezést adott a vizsgálatba való felvétel előtt.

Eredmények

A HI és a gliozis jelen van az emberi elhízásban, és csak a bal hipotalamuszra korlátozódik

A jelenlegi tanulmányban 57 elhízott humán és 54 kontroll alany MBH-ját vizsgáltuk, életkor és nem szerinti gyakorisággal, T2-súlyozott MR-képalkotással. Jellemzőiket az 1. táblázat tartalmazza. Joshua Thaler és munkatársai (9) javaslata alapján a jelen MRI-tanulmányban az MBH T2 intenzitását a corpora amygdala intenzitásával kapcsoltuk össze annak érdekében, hogy normalizálódjunk a nem specifikus neuronális hatásokra (1. ábra). . Amint a 2A. Ábra mutatja, az elhízott humán alanyok az MBH T2 intenzitásának szignifikáns növekedését mutatják, ami gyulladást és gliozist jelez, amely hatás csak a bal, nem a jobb hipotalamuszban mutatható ki. Ezenkívül érzékenységi elemzést hajtottak végre úgy, hogy hat túlsúlyos egyént kizártak az MRT T2 intenzitás (R) összehasonlításából a nem elhízott és elhízott alanyok között, ami nem eredményezte a statisztikai eredmény jelentős változását (P = 0,54). Az elhízás ezen megállapításai mellett érdemes megemlíteni, hogy nem elhízott kontroll alanyoknál azt találtuk, hogy az MBH T2 intenzitása fiziológiailag alacsonyabb a bal oldalon, mint a jobb MBH (P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

A tantárgy jellemzőinek összefoglalása

A HI és a gliozis az emberi elhízásban szisztémás, alacsony fokú gyulladással jár, de nem perifériás inzulinérzékenységgel vagy hipertrigliceridémiával

Ezt követően arra céloztunk, hogy a HI és a gliosis összefüggésbe kerüljön-e szisztémás alacsony fokú gyulladással vagy perifériás anyagcserezavarokkal, például inzulinrezisztenciával és/vagy hipertrigliceridémiával. Ezért szérum IL-6 szintet és CRP szintet mértünk szisztémás gyulladásos markerként és glükóz és inzulin (HOMA-IR számítása), valamint triglicerid szintet metabolikus paraméterként. A korrelációs elemzések az IL-6 és a CRP pozitív korrelációját tárták fel az MBH/amygdala szignálaránnyal (L), míg a metabolikus faktorok nem mutattak összefüggést (IL-6: P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

Az MBH/amygdala jelarány lineáris modellje (L)

A HI és a gliozis az emberi elhízásban nincs összefüggésben a csökkent neuronsejtek számával

Miután megállapítottuk, hogy a HI és a gliosis jelen van az elhízott emberek bal MBH-jában, a következő célként azt vizsgáltuk, hogy a gyulladásos reakció összefügg-e az idegsejtek pusztulásával, ami a folyamat visszafordíthatatlanságára utal. Az MRS segítségével megbecsültük az idegsejtek számát az NAA/Cr arány kiszámításával a bal agyféltekében. A nonobese és az elhízott humán alanyok NAA/Cr arányának összehasonlítása nem mutatott szignifikáns különbséget, ami arra utal, hogy a bal hipotalamusz régióban nem csökken az idegsejtek száma (3. ábra). Szintén nem találtunk szignifikáns különbséget az NAA/Cr arányban, amikor T2 hiperintenzitással rendelkező és anélküli egyedeket vizsgáltunk (P = 0,54 Wilcoxon teszt segítségével). Ezenkívül lineáris modellt alkalmaztak az elhízás kiigazítására, ami ismét arra utal, hogy a bal hipotalamusz régiójában nincs neuronpusztulás.

Hasonló idegsejtek száma a két súlycsoport között. Az NAA-t (a neuronális és axonális életképesség és intenzitás markere) összehasonlítottuk a Cr-vel (belső referencia). A nem elhízott (n = 38) és az elhízott (n = 43) betegeket összehasonlítottuk a bal MBH NAA/Cr szignálarányukkal (Wilcoxon rangösszeg teszt), és nem mutattak szignifikáns különbséget a neuronális sejtek számában (P = 0,12). Harmincegy alanyot kizártak az MRS adatelemzéséből, mert a metabolitok csúcsait nem sikerült megfelelően meghatározni, vagy mert az MRS sík kimaradt a hipotalamuszból. n.s., nem jelentős.

A HI és az elhízás gliozisa a bél mikrobiomjának zavaraihoz kapcsolódik

Ezután megvizsgáltuk, hogy az MBH gyulladása és a gliosis összefügg-e specifikus bél mikroorganizmusokkal. Az elhízott humán alanyok székletmintáit 16S rDNS szekvenálásnak vetették alá, és elemezték a magban mérhető mikrobiomot, beleértve az n = 26 nemzetségeket. Az elhízott emberek csoportján belüli korrelációs elemzések két baktériumot azonosítottak, amelyek nominálisan szignifikáns, negatív korrelációt mutattak az MBH/amygdala jelaránnyal (L): Parasutterella sp. és a Marinilabiliaceae (nemzetség osztályozatlan) (3. táblázat). A Parasutterella sp. Nemzetségben mérhető alapvető mikrobiom fajok további korrelációs elemzése majd egy nukleotidszekvencia-robbanás (19) azonosította a P. excrementihominis-t, hogy negatívan kapcsolódjon az MBH/amygdala jelarányhoz (L) elhízott embereknél. A vizsgált bélbaktériumok egyike sem mutatott szignifikáns pozitív kapcsolatot az MBH/amygdala jelaránnyal (L).

Két azonosított baktérium korrelációs elemzése MBH/amygdala jelaránnyal (L) és táplálkozási paraméterekkel

Az MBH gyulladásával és gliozisával összefüggő bélmikrobiota zavarok a táplálékzsírhoz kapcsolódnak, de nem a szénhidráthoz, a fehérjéhez vagy a teljes energia bevitelhez.

A JNK génben vagy az MC4R génben előforduló gyakori polimorfizmusok növelik az egyéni hajlamot a HI és a gliozisra

Dobozdiagramok, amelyek az elhízott betegeknél az MBH T2 hiperintenzitásával szignifikánsan összefüggő SNP-ket mutatnak a jelölt géneken belül. A JNK gén (SNP rs1062225) vagy az MC4R gén (SNP rs11872992) heterozigóta SNP-jének hordozása az elhízott betegcsoporton belül megnövekedett HI-szinttel társul (Wilcoxon rangsummérték). Az MC4R homozigóta mutációval rendelkező egyik probandumot kizártuk az MC4R analízisből. A JNK gén SNP-jéhez nem léteztek homozigóta mutációval rendelkező próbák.

Fogyás és a perifériás inzulinérzékenység javulása a bariatrikus műtét miatt nem befolyásolja a HI-t vagy a gliozist

A jelenlegi vizsgálat elhízott személyeinek egy alcsoportjában (n = 10) az MBH gyulladását és a gliózisát is megvizsgáltuk a bariatrikus műtétekre reagálva. Amint az 5A. És B. Ábrán látható, ~ 10 hónapos időtartam alatt ez a műtéti eljárás mély súlycsökkenést és az inzulinérzékenység drámai javulását eredményezte, amit az átlagos HOMA-IR 7,4-ről 1,7-re történő szignifikáns csökkenése jelez ( P = 0,02). Ezzel szemben az IL-6 szérumszintek nem különböztek a vizsgálati periódus előtt vagy után, ami azt jelzi, hogy ebben a 10 hónapos időszakban a bariatrikus műtét képes javítani az anyagcsere-funkciót, de nem képes csökkenteni a szisztémás alacsony fokú gyulladást (1. ábra). 5C). A hipotalamusz tekintetében az MBH T2 hiperintenzitása (L) a beavatkozás után nem normalizálódott szignifikánsan (5D. Ábra). Szintén nem volt megfigyelhető szignifikáns különbség az NAA/Cr (L) hányadosban, ami a megfigyelési periódus előtti és utáni idegsejtek összehasonlítható számát jelzi (P = 0,17).

Pre- (T0) és poszt- (T1) bariatrikus műtét. Súlyos, elhízott, bariatriás műtéten átesett betegeknél (n = 10) a BMI és a HOMA-IR szignifikáns javulást mutatott, de az IL-6 vagy az MBH-T2 intenzitása nem volt átlagosan 10 hónapos követési idő után. Az MRI mérések során két lemorzsolódás hagyta el a vizsgálatot klaustrofóbia miatt, és egyes esetekben fenotípusos adatok nem álltak rendelkezésre A: n = 8. B – D: n = 7. Páros kétfarkú t tesztek (A, B és D) és Wilcoxon aláírt rangvizsgálatot (C) alkalmaztunk. Az adatok átlagként (SD) jelennek meg.

Vita

Az elhízással kapcsolatos korábbi vizsgálatokban az MBH T2 hiperintenzitását, mint a HI mértékét, lateralizáltuk a bal agyféltekére (9, 11), ezt a megállapítást prospektív tanulmányunk is megismételte (2. ábra). Bár kizárhatnánk a bal- és a jobbkezességgel való összefüggést, figyelemre méltó, hogy más hipotalamusz funkciók, különösen a paraszimpatikus kiáramlás lateralizálódnak az agy bal oldalára (22). Korábbi megfigyeléseink mellett eredményeink azt sugallják, hogy a bal MBH fiziológiailag alacsonyabb MRI T2 intenzitással rendelkezik, mint a jobb oldali (2A. Ábra, fehér sávok). Az MRI intenzitása nemcsak a gliasejtek számának növekedésével, hanem az alacsonyabb idegsejtszámmal is korrelál (23). Azt sugallja, hogy a bal MBH egészséges körülmények között nagyobb számú neuront tartalmazhat, és ezért dominálhatja a jobb MBH-t az autonóm funkciók szabályozásában.

A jelenlegi tanulmány megállapításai arra utalnak, hogy a HI és a gliosis inkább az elhízás általános szisztémás alacsony fokú gyulladásával, mintsem metabolikus rendellenességekkel, például inzulinrezisztenciával függ össze. Ez ellentétben áll egy korábbi vizsgálattal, amelyben beszámoltak az MBH T2 hiperintenzitásának és a perifériás inzulinrezisztencia szignifikáns összefüggéséről (11). Ebben a jelentésben azonban nem mértük a gyulladásos biomarkereket, és nem végeztek súlycsökkentő beavatkozást; ezért nem biztos, hogy végérvényesen el lehetett volna gondolkodni a gyulladásos és metabolikus tényezőkön a HI és a gliosisban betöltött szerepük tekintetében. Ezenkívül állatkísérletekben bebizonyosodott, hogy a HI testtömeg-növekedést eredményez (9), ami arra is utal, hogy az MBH patológia nem az elhízással összefüggő inzulinrezisztencia eredménye.

Számos állatmodell azt jelzi, hogy a táplálkozási tényezők, például a magas zsírtartalmú étrend, indukálják a HI-t és a gliozist (8,9). Ezenkívül a táplálkozásról ismert, hogy erősen befolyásolja a bél mikrobiomját (31,32). Így azt követően megvizsgáltuk, hogy a makrotápanyagok társulnak-e a két bélmikroba bőségével, amelyekről megállapították, hogy összefüggenek az MBH T2 hiperintenzitásával. Érdekes, hogy a Parasutterella sp. azt tapasztaltuk, hogy a diéta magasabb zsírtartalma jelentősen összefügg a baktérium alacsonyabb mennyiségével. Mivel a baktérium alacsonyabb száma magasabb MBH/amygdala jelaránnyal jár, ezek a megállapítások arra utalnak, hogy a bél mikrobiomján keresztüli táplálkozás befolyásolhatja a HI-t és a gliózist. Fontos, hogy a Parasutterella sp. a zsírbevitelhez kapcsolódott, de nem a teljes energiafogyasztáshoz, ami ismét arra utal, hogy nem a kalóriabevitel és/vagy az elhízás fenotípus váltja ki önmagában a HI-t, hanem bizonyos makrotápanyagok és bélmikrobiális fajok. Ez arra utal, hogy az emberekben, csakúgy, mint az állatmodellekben (9), a bél-agy tengely változásai nem az elhízás következményei, hanem inkább étvágy- és jóllakottság-rendellenességet válthatnak ki, és ezért okozhatják a testtömeg növekedését.

Vizsgálatunk több korlátozására is rá kell mutatni. 1) csak asszociációkról és összefüggésekről adunk adatokat, ezért nem tudjuk bizonyítani az oksági összefüggéseket; 2) a hipotalamuszban (L) lévő voxelek, amelyeket MRS elemzéshez használtak, változóan átfedhetik a T2 arányra elhelyezett érdekes koronális régiókat (ROI); 3) a táplálkozási adatokat önállóan kitöltött kérdőívekkel nyerték, és ezért elfogultak lehetnek; és 4) a bariatrikus műtéten átesett alanyok száma túl kevés lehetett a HI-re gyakorolt jelentős hatások kimutatásához.

Összegzésként egy prospektív transzlációs tanulmányt mutatunk be a HI és a gliosis szerepéről az emberi elhízásban. Eredményeink azt sugallják, hogy a HI a jövőben további diétás és/vagy farmakológiai kezelési célnak tekinthető a bariatrikus műtétek és a nem műtéti elhízási terápiák hatásának erősítésére, különösen a testsúly fenntartásának szakaszában.

Cikk információk

Köszönetnyilvánítás. A szerzők hálás köszönetet mondanak minden betegnek és kontrollalanynak a vizsgálatban való részvételért. A szerzők köszönetet mondanak Dr. Robert Semple-nek a Cambridge-i Egyetemtől a kézirat lektorálásáért. Ezenkívül a szerzők köszönetet mondanak az 1743-as „Gének, környezet és gyulladás” kutatócsoportnak, amelyet a Német Kutatási Alapítvány (Deutsche Forschungsgemeinschaft [DFG]) finanszírozott.

Finanszírozás. A tanulmányt a szövetségi oktatási és kutatási minisztérium (Bundesministerium für Bildung und Forschung [BMBF]) támogatásával támogatták Németországban (FoCus, 0315540A sz.). Az Orvosi Informatikai és Statisztikai Intézetet a DFG támogatta (FOR2107).

Érdeklődési kettősség. A cikk szempontjából lényeges összeférhetetlenségről nem számoltak be.