Az emberi gyomor adenokarcinómák genetikai mutációjának elemzése iontorrent szekvenáló platform segítségével

Közreműködött ebben a munkában: Zhi Xu, Xinying Huo

Onkológiai Osztály Tanszék, a Nanjing Orvostudományi Egyetem Nanjing Első Kórháza, Nanjing, Kína

Közreműködött ebben a munkában: Zhi Xu, Xinying Huo

Onkológiai Osztály Tanszék, a Nanjing Orvostudományi Egyetem Nanjing Első Kórháza, Nanjing, Kína

Tagság: San Valley Biotechnology Incorporated, Peking, Kína

Társulási Norris Átfogó Rákközpont, Keck Orvostudományi Molekuláris Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszék, Dél-Kaliforniai Egyetem, Los Angeles, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Tagság: San Valley Biotechnology Incorporated, Peking, Kína

Onkológiai Osztály Tanszék, a Nanjing Orvostudományi Egyetem Nanjing Első Kórháza, Nanjing, Kína

Társulás Norris Átfogó Rákközpont, Keck Orvostudományi Molekuláris Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszék, Dél-Kaliforniai Egyetem, Los Angeles, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Onkológiai Osztály Tanszék, a Nanjing Orvostudományi Egyetem Nanjing Első Kórháza, Nanjing, Kína

Zhi Xu,
Xinying Huo,
Hua Ye,
Chuanning Tang,
Vijayalakshmi Nandakumar,
Feng Lou,
Dandan Zhang,
Haichao Dong,
Hong Sun,
Shouwen Jiang

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Xu Z, Huo X, Ye H, Tang C, Nandakumar V, Lou F és mtsai. (2014) Humán gyomor adenokarcinómák genetikai mutációjának elemzése Ion Torrent Sequencing Platform segítségével. PLoS ONE 9 (7): e100442. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0100442

Szerkesztő: Masaru Katoh, Nemzeti Rákközpont, Japán

Fogadott: 2013. február 20 .; Elfogadott: 2014. május 28 .; Közzétett: 2014. július 15

Finanszírozás: A munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány támogatásával támogatta Dr. Jinfei Chen (támogatás száma: 81272469) és Dr. Zhi Xu (támogatás száma: 81000880); a Jiangsu tartomány 12. ötéves programja az egészség fejlesztése technológiával és oktatással projekt támogatása Jinfei Chennek; valamint a Wu Jieping Alapítvány és a Nemzeti Egészségügyi Intézetek támogatásai (R01 CA90427 és R01 AI084811 Si-Yi Chennek). A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők: Hua Ye, Chuanning Tang, Feng Lou, Dandan Zhang, Haichao Dong, Hong Sun, Shouwen Jiang, Guangchun Zhang, Zhiyuan Liu, Zhishou Dong, Baishuai Guo, He Yan, Chaowei Yan, Lu Wang, Ziyi Su és Yangyang Li a San Valley Biotechnology, Inc. munkatársai. Ez nem változtatja meg a szerzők betartását az adatok és anyagok megosztására vonatkozó PLOS ONE irányelvek mellett.

Bevezetés

A gyomorrák világszerte a második leggyakoribb rák, amelynek gyakorisága nagymértékben változik a különböző földrajzi helyeken. Az előfordulása Japánban, Kelet-Ázsiában, Dél-Amerikában és Kelet-Európában a legmagasabb, míg a legkevesebb Kanadában, Észak-Európában, Afrikában és az Egyesült Államokban [1]. Ez azonban továbbra is a harmadik leggyakoribb gyomor-bélrendszeri rosszindulatú daganat Észak-Amerikában a vastagbél- és hasnyálmirigyrák után, és általában 40 éves életkor után következik be [2]. A Lauren-osztályozás a gyomorrákot két fő szövettani típusra osztja: bél- vagy diffúz. A diffúz típusú daganatok nem kohéziós tumorsejtek diffúzan beszivárognak a gyomor stromájába, és gyakran mélyen beszivárognak a gyomor falába, alig vagy egyáltalán nem mirigyképződéssel. A bél típusú rákok viszont felismerhető mirigyképződést mutatnak, amely mikroszkópos megjelenésükben hasonló a vastagbél nyálkahártyájához [3]. A legtöbb gyomorrák szórványos, de 8–10% genetikailag öröklődik [2].

Kimutatták, hogy sok általánosan aktivált onkogén mutációt hordoz a gyomorrákban. A genetikai mutációkat célzó egyetlen vagy kombinatív terápiás szerek egyre vonzóbbá válnak a gyomorrák kezelésében. Például a trasztuzumabot kemoterápiával kombinálva hagyták jóvá az ERBB2-pozitív gyomorrák kezelésében [4]. Az EGFR, egy másik receptor tirozin-kináz túlexpressziója miatt figyelemre méltó néhány gyomorrákban, és jelenleg folyamatban vannak az EGFR-gátlók alkalmazásával végzett kísérletek [5]. Hasonlóképpen, a gyomorrákok más molekulák, például a MET, az MSTIR és az FGFR2 túlzott expressziójával vagy amplifikációjával társulnak, és több nyomvonal is teszteli az inhibitorok hatékonyságát ezekkel a molekuláris mutációkkal szemben [6], [7].

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

A tanulmányt a Kínai Nanjing Orvostudományi Egyetem Nanjing Első Kórházának Etikai Bizottsága hagyta jóvá. A formalin fixált és paraffinba ágyazott (FFPE) tumormintákhoz nem állt rendelkezésre tájékozott beleegyezés, ezért az ebben a vizsgálatban felhasznált összes mintát és orvosi adatot visszafordíthatatlanul névtelenítették.

Betegtájékoztatás

A vizsgálat során használt tumormintákat a Kínai Nanjing Orvostudományi Egyetem Nanjing Első Kórházából gyűjtötték. A gyomor adenokarcinómában szenvedő betegek összesen 238 FFPE tumor mintáját elemezték. 238 beteg átlagéletkora 60 év volt (tartomány: 28–81). 238 mintából 135 daganat volt diffúz és 103 daganat volt bél.

DNS előállítás

DNS-t izoláltunk az FFPE mintákból deparaffinizálás és 3-5 μm vastag paraffin szakaszok xilolban történő extrahálása után, és a QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) felhasználásával a gyártó utasításainak megfelelően.

Ion Torrent PGM könyvtár előkészítése és szekvenálása

Ion Torrent adapterrel ligált könyvtárat készítettünk a gyártó Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 protokolljának (Life Technologies, Part # 4475345 Rev. A) nyomán. Röviden: 50 ng összevont amplikonokat javítottunk meg, és az Ion Torrent P1 és A adaptereket ligáltuk DNS-ligáz alkalmazásával. Az AMPure gyöngy (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) tisztítását követően az adapterrel ligált termékeket nick-transzlációval és PCR-amplifikálással összesen 10 ciklus alatt végeztük. A kapott könyvtárat AMPure gyöngyökkel (Beckman Coulter) tisztítottuk, és a könyvtár koncentrációját és méretét az Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) és az Agilent BioAnalyzer DNS nagy érzékenységű LabChip (Agilent Technologies) alkalmazásával határoztuk meg.

Az emulzió mintájának PCR-jét, az emulzió törését és dúsítását az Ion Xpress Template Kit (Part # 4467389 Rev. B) használatával hajtottuk végre, a gyártó utasításainak megfelelően. Röviden: egy DNS templát másolat/Ion gömb részecskék (ISP) bemeneti koncentrációját adtuk az emulzió PCR mester keverékéhez, és az emulziót IKADT-20 keverővel (Life Technologies) állítottuk elő. Ezután az ISP-ket kinyertük és a templát-pozitív ISP-ket dúsítottuk Dynabeads MyOne Streptavidin C1 gyöngyök (Life Technologies) felhasználásával. Az ISP dúsulást a Qubit 2.0 fluorométerrel (Life Technologies) igazoltuk. A szekvenálást 316 chip segítségével végeztük az Ion Torrent PGM-en 65 cikluson keresztül, és vonalkódot használtunk ezekhez a mintákhoz. Az Ion Sequencing Kit v2.0-t alkalmaztuk a reakciók szekvenálásához, az ajánlott protokollnak megfelelően (cikkszám: 4469714 Rev. B).

Változatos hívás

A PGM-futtatások adatait kezdetben az Ion Torrent platform-specifikus Torrent Suite szoftver segítségével dolgozták fel a szekvenciaolvasások előállítására, az adapter-szekvenciák levágására, a szűrésre és a gyenge jelprofil-olvasások eltávolítására. Az Ion AmpliSeq szekvenálási adatokból származó kezdeti variánshívásokat a Torrent Suite v3.0 szoftverrel, egy plug-in „variant caller v3.0” programmal generáltuk. A hibás bázis hívás kiküszöbölése érdekében több szűrési lépést alkalmaztunk a végső variáns hívás előállításához (S1. Ábra). Az első szűrőt a teljes lefedettség átlagos mélységénél> 100-nál, az egyes változatok lefedettségénél> 20-nál, az egyes minták variánsfrekvenciáinál> 5% -nál, és a P-értéknél 1. ábra. FFPE minták, mintánként 300 000 olvasásra normalizálva.

A. Az egyes amplikonok átlagos lefedettségének megoszlása. Az adatokat átlag ± SD-ként mutatjuk be. B. Adott beolvasási mélységű amplikonok száma, 100 olvasásnyi tartályokba rendezve. A kék sávok a megcélzott amplikonok számát jelzik az olvasási mélységen belül, a piros vonal pedig a megcélzott amplikonok% -át mutatja, amelyek ≥ olvasási mélység.

Ebben a tanulmányban 238 emberi gyomor adenocarcinoma mintát szekvenáltunk, a megcélzott lókuszok átlagos lefedettségi mélysége> 100 (1A. Ábra). A mintavételezésünk daganatait diffúz vagy béltípusba soroltuk a Lauren-osztályozás alapján (Asztal 1). Szigorú standard variáns hívással a következő gének mutációit azonosítottuk (2. táblázat): APC, BRAF, ERBB2 FBXW7, KIT, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RB1, SMAD4 és a mutáció magas előfordulása a TP53 gén mentén. A missense, a pontmutációk, az inszerciók és a deléciók részletes gyakorisága a 45 tumor szupresszor gén 737 lókuszán és 238 gyomor adenokarcinóma mintájának onkogénjein profilozott. S1. Táblázat. Mintakészletünk a betegség különböző stádiumaiban (Ia, Ib, II, IIIa, IIIb, IV) pontozott tumorokat tartalmazott az AJCC/TNM rák stádiumrendszere alapján (3. táblázat), és különböző differenciálási lehetőségekkel is rendelkeztek (4. táblázat). A TP53 exonjainak és funkcionális doménjeinek részletes szekvenálási elemzését az alábbiakban ismertetjük.

Missense mutációs eloszlás a TP53 exonjaiban és funkcionális doménjeiben

A. A különböző exonokban észlelt mutációk gyakorisága. B. Mutációeloszlás exonokban. C. Mutációeloszlás a funkcionális területeken.

Többszörös mutációk és mutációs forró pontok a gyomor adenokarcinómáiban

Az individualizált kombinációs terápia klinikai sikere a mutációs kombinációk és minták azonosításán alapul, ha a célszervek egy részét vagy kombinációját együttesen adják a detektált mutációs kombinációkkal szemben. A daganatos csoportunkban a szekvenálás elemzésével kimutatott mutációk némelyike nem csak visszatérő és gyakori volt, hanem más mutációkkal együtt is előfordult. A minták 13,6% -ának volt legalább egy vagy több missense mutációja, 1,70% -ának legalább két vagy több missense mutációja volt, 0,4% -ának legalább három vagy több missense mutációja volt, és a minták 86,1% -ánál semmilyen káros mutáció nem volt látható a vizsgált 737 lokusok egyikében sem a potenciális tumor szuppresszor gének és onkogének (5. táblázat).

Vita

A gyomor adenocarcinoma, a gyomorrák leggyakoribb típusa, heterogén, és előfordulása és oka földrajzi régióktól, nemtől, etnikumtól és étrendtől függően változik [20]. A Helicobacter pylori fertőző ágens krónikus atrófiás gyomorhuruthoz kapcsolódik, amely a gyomor adenokarcinóma gyulladásos prekurzora [20]. Míg a H. pylori a világ népességének nagy részében gyomor-bélrendszert kolonizál, és mutációkat és genomiális instabilitást vált ki a gazdaszervezet DNS-ében, csak a bonyolult kockázati profilú egyének hajlamosak rák kialakulására [21].

segítő információ

S1. Ábra.

A változatok szűrési folyamata. (a) A szálon elfogult variánsokat az Integrative Genomics Viewer (IGV) szoftverrel (http // www.broadinstitute.org/igv) kiküszöböltük; (b) Az AMPL339432 változatát ki kell küszöbölni, mivel ez az amplikon nem egyedi, illeszkedik a PIK3CA-hoz az emberi genomban; (c) Minden statisztikai elemzésünk a kék mezőben szereplő adatokon alapult.

S1. Táblázat.

Pontmutációk, inszerciós és deléciós mutációk gyakorisága 238 GA-ban található 45 gén 737 lókuszában.