Az emberi növekedési hormon receptor (hGHR) Gene V2 promóter transzkripciós szabályozása transzkripciós aktivátorok és represszorok által

Absztrakt

A GH a posztnatális szomatikus növekedés kulcsszabályozója és fontos metabolikus hormon (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Sejt szinten a GH-akciókat a specifikus GH-receptor (GHR), az I. osztályú citokin-receptor (4, 5) közvetíti. Így a GH képessége biológiai hatásainak kifejtésére szorosan kapcsolódik a receptor megfelelő mennyiségéhez és normális működéséhez a célszövetekben.

A GHR expressziót három szinten szigorúan ellenőrzik: transzkripció, transzláció és poszttranszláció (8). Noha a transzlációs és poszttranszlációs szabályozás megértése az elmúlt két évtizedben jelentősen fejlődött (8, 9), transzkripciós szabályozásával kapcsolatos ismereteink továbbra is viszonylag korlátozottak. Az emberekben és számos állatfajban a GHR gén transzkripciót moduláló mechanizmusok vizsgálata közös tulajdonságot tárt fel: alternatív 5'-nem kódoló exonok alkalmazása, amelynek eredményeként több mRNS-transzkriptum keletkezik, amelyek különböznek 5'-nem fordított régiójukban (5 ' -UTR) szekvenciák, de a transzlációs kezdőhellyel szemben, a 2-es exonban ugyanabba a helyre hasítanak, és így kódolják ugyanazt a GHR-fehérjét. Úgy gondolják, hogy ez az 5′-UTR heterogenitás komplex szabályozó mechanizmust biztosít a fejlődés- és szövet-specifikus, valamint a mindenütt jelenlévő GHR expresszió meghatározására a különböző célszövetekben (10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ).

Jelen tanulmányban ezek közül a feltételezett cisz-szabályozó elemek közül többet vizsgáltunk a V2 proximális promoterben és exonban, hogy meghatározzuk, melyek funkcionálisan szignifikánsak. Tranziens transzfekció, géleltolódás és kromatin immunprecipitációs tesztek segítségével kimutattuk, hogy vannak pozitív [Ets1, C/EBP-homológ fehérje (CHOP), C/EBP] és negatív (Hes1) szabályozó elemek, amelyek modulálják a V2 transzkripciót, közvetlen kötődéssel vagy specifikus transzkripciós tényezőik közvetett társítása. Ezek a szabályozó tényezők valószínűleg nukleáris mediátorként szolgálnak, szabályozva a hGHR expresszióját válaszként számos különféle extra- és intracelluláris jelre.

Eredmények

Az Ets1 közvetlenül transzaktiválja a hGHR V2 promótert

Az Ets transzkripciós faktorok családja fontos szerepet játszik a génexpresszió szabályozásában, válaszul a többszörös fejlődési, mitogén és tumorral kapcsolatos jelekre. Az Ets-tagokat erősen konzervált DNS-kötő (ETS) doménjük jellemzi, amely alapján felismerik a mag DNS-motívumát, a GGA-t (A/T) (20, 21). A hGHR V2 proximális promóterben két átfedő feltételezett Ets kötő szekvenciát találtunk (1. és 2A. Ábra). Bár mindkét hely nagymértékben konzervált a különböző fajokban (1. ábra), a GHR mRNS expressziójának Ets-szabályozásáról eddig nem számoltak be.

Annak megállapítására, hogy az Ets1 feltételezett kötőhelye (i) n keresztül hat-e, az Ets1-et kotranszfektáltuk a négy Ets mutáns promoter konstrukcióval (2C. Ábra). Bármelyik Ets-kötőhely mutációja jelentős csökkenést eredményezett (~ 60%, P d - (+) - glükóz (61) .Aminosav-korlátozás egy vagy több esszenciális aminosav hiánya vagy elégtelen fehérjebevitel miatt transzkripcionálisan aktiválhatja a CHOP expressziót (69, 70, 71). Mivel a hGH-nak olyan fontos hatása van a glükóz és a fehérje anyagcseréjére, logikus, hogy a hGHR gén expresszióját a tápanyag állapotának változására reagálva szabályoznánk. Vizsgálataink szerint a CHOP ezen jelek valószínű intracelluláris közvetítője.

A Lobie laboratórium számos tanulmánya (65, 66, 72) bebizonyította, hogy a hGHR, különösen az autokrin hGH, amely a hGHR-n keresztül hat, képes szabályozni az emlő karcinóma sejtekben a CHOP expressziót, és p38 MAPK-függő módon fokozhatja transzkripciós aktivitását, ami fokozott védelmet eredményez az apoptózis ellen. Megállapításunk alapján, miszerint a CHOP képes felszabályozni a hGHR transzkripciót, feltételezzük, hogy pozitív visszacsatolási hurok jön létre; az autokrin hGH termelés fokozza a CHOP szinteket és a transzkripciós aktivációt, beleértve a hGHR gén expressziójának felfelé szabályozását, és a megnövekedett hGHR szint fokozott sejtszintű választ fog eredményezni az autokrin hGH-ra.

Összességében az az adatunk, amely azt mutatja, hogy a CHOP képes szabályozni a V2 promoter aktivitását, transzkripciós kapcsolatot biztosít a hGHR V2 expressziójának szabályozásához ER stressz, tápanyag állapot és hGH alapján.

C/EBPβ

Nagy dózisú C/EBPβ stimulálta a V2 proximális promotert. A legvalószínűbb, hogy ezen a szinten túlexpresszálva a C/EBPβ homodimerként működik. Bár a V2 proximális promóter régiójában nincsenek megjósolva konszenzusos C/EBP kötő szekvenciák, helyhez irányított mutagenezis kísérleteink azt sugallják, hogy a C/EBPβ homodimerek legalább részben a nem kanonikus CHOP-C/EBP heterodimer helyet használják aktiválásra. Valójában a C/EBPβ homodimerekről kimutatták, hogy kötődnek a CHOP-C/EBP heterodimer helyekhez, de alacsony affinitással (23, 33, 34). Megállapításunk, hogy a C/EBPβ csak magas szinten kifejezve transzaktiválja a V2 transzkripciót, egyetért ezzel a forgatókönyvvel.

Számos tanulmány arról számolt be, hogy a C/EBPβ kritikus közvetítője a GH-szabályozott génátírásnak (27, 28, 29, 73, 74, 75). A GH és más hormonok képesek foszforilezni a C/EBPβ-t a MAPK vagy a foszfatidil-inozitol-3-kináz jelátviteli útvonalakon keresztül, és elősegíthetik annak tranzakciós képességét. Jelenlegi megállapításunk, miszerint a C/EBPβ stimulálhatja a V2 promoter aktivitását, olyan mechanizmust biztosít, amellyel a hGH szabályozni tudja saját receptora expresszióját. Adams (76) kivételével, aki azt is megfigyelte, hogy a C/EBP tagok, különösen a C/EBPδ stimulálhatják a juh 1B promóterét, a V2 homológ promótereken végzett egyéb C/EBP vizsgálatokról nem számoltak be. Mivel azonban a C/EBP fehérjék számos fiziológiai folyamatot szabályoznak, beleértve a sejtek proliferációját, az adipocita differenciálódást, az energia anyagcserét és a gyulladást (77, 78), nem meglepő, hogy a C/EBP tagok hozzájárulnak a hGHR V2 transzkripciós aktivációjához.

A Hes1 elnyomó hatást fejt ki a V2 transzkripcióra

A Hes1 egy emlős bázikus-spirál-hurok-spirál (bHLH) transzkripciós faktor, amely transzkripciós represszorként működik azáltal, hogy két specifikus DNS-szekvenciához kötődik: az N dobozhoz (CACNAG) vagy a C osztályú E típusú dobozhoz (CACGCG) (36)., 38, 79, 80, 81.). Jelen tanulmányban két, C-osztályú Hes helyet azonosítottunk és jellemeztünk a V2 exonban. Funkcionális elemzés és in vitro, valamint in vivo kötési vizsgálatok azt mutatták, hogy a Hes1 túlzott expresszió a hGHR V2 promóter hatékony transzkripciós represszióját váltja ki mind a HEK293 sejtekben, mind az SGBS preadipocytákban azáltal, hogy ezekhez az exon Hes helyekhez kapcsolódik. Mivel mindkét hely egyedi az emberi V2-hez, mechanizmust biztosít a hGHR V2 fajspecifikus szabályozásához.

Hes1-t a Notch szignalizáció elsődleges downstream célpontjaként azonosították, amely evolúciósan konzervált mechanizmus vezérli a sejtek sorsdöntéseit (82); a Notch receptor aktiválása indukálja a Hes1 és más Hes család fehérjéinek expresszióját (79, 82, 83, 84, 85). Számos friss jelentés azt jelzi, hogy bizonyos alternatív jelátviteli kaszkádok, mint például a c-Jun N-terminális kináz út (86) vagy a Ras/MAPK jelzés (87), szintén indukálhatják a Hes1 expresszióját. Így a fejlődési jelek és különféle egyéb ingerek Notch-függő vagy -független utakon keresztül működhetnek Hes1 indukálására, amely ezt követően elnyomja a célgén transzkripcióját. Bár a Hes1 elengedhetetlen számos fejlődési folyamathoz, kevés célgént azonosítottak, főleg embereknél (38). Jelen jelentésünk az első bizonyíték arra, hogy a hGHR V2 transzkripciót negatívan szabályozza a Hes1. A Hes1 általi szabályozás segíthet elmagyarázni a hGHR expressziójának változását a fejlődés vagy a differenciálódás során, de azt, hogy a hGHR gén a Hes1-en keresztüli Notch jelátviteli útvonal célpontja-e, tovább kell vizsgálni.

Különböző transzkripciós faktorok hatása a hGHR V2 expressziójának up-szabályozására az SGBS adipocita differenciálódása során

Legutóbbi megállapításunk, miszerint a V2 promoter nagyobb aktivitást mutat az érett adipocytákban, mint a preadipocytákban, arra utal, hogy a hGHR V2 expressziójának növekedése az SGBS adipocyta differenciálódása során legalább részben a fokozott transzkripciós aktivitásnak köszönhető (19). Az ebben a folyamatban szerepet játszó specifikus tényezők jellemzéséhez összehasonlítottuk számos transzkripciós faktor expresszióját és működését a preadipocytákban és az adipocyta differenciáció során.

Bár azt tapasztaltuk, hogy az Ets1 vagy a CHOP túlzott expressziója markánsan felfelé szabályozza a V2 promóter aktivitását, kvantitatív RT-PCR adataink azt mutatják, hogy az Ets1 és a CHOP expresszió szintje a konfluens SGBS preadipocytákban a legmagasabb, amit a differenciálódás kezdeti szakaszában markáns csökkenés követ, és alacsony szintek a későbbi szakaszokban (kiegészítő 2C. ábra). Az Ets1 vagy CHOP expresszió és a V2 transzkripció közötti korreláció hiánya arra utal, hogy egyik tényező sem felelős a V2 promóter aktivitásának növeléséért az SGBS adipocita differenciálódása során. Nem zárhatjuk ki azonban annak lehetőségét, hogy az Ets1 vagy a CHOP a preadipocita stádiumban működik, hogy felkészítse a sejteket a megnövekedett hGHR V2 expresszióra és differenciálódásra.

Összefoglalva megállapítottuk, hogy több transzkripciós faktor hat a hGHR V2 promoterre, pozitív (Ets1, CHOP és C/EBPβ) és negatív (Hes1) hatásokat kiváltva. Lehetnek downstream nukleáris effektorokként, amelyek összekapcsolják a hGHR gén expressziójának specifikus szabályozását válaszként a növekedési faktorok, fejlődés, táplálkozás és stressz ingerek által kiváltott különböző jelátviteli kaszkádokra (7. ábra).

Anyagok és metódusok

V2 promoter luciferáz riporter gén plazmidok és expressziós plazmidok

A jelen munkában használt luciferáz fúziós plazmidokat a korábban leírt módon állítottuk elő (19). Korábbi (19) és jelen tanulmányunkban úgy döntöttünk, hogy a juh 1B major TSS-t (T) +1 -ként jelöljük a V2 promóter konstrukció számozásához, mert ez képviseli a homológok között azonosított legtávolabbi cDNS 5′-véget. V2-szerű átiratok. A plazmidokban lévő cisz-elemeket a QuikChange II hely-irányított mutagenezis készlet (Stratagene, La Jolla, Kalifornia) segítségével mutáltuk, amint azt korábban leírtuk (19) (1. kiegészítő táblázat). Az összes mutációs konstrukciót DNS-szekvenálással igazoltuk.

Az eukarióta Ets1 expressziós pEVRF-Ets1 plazmidot és kontroll pEVRFO plazmidot Dr. S. A. Rabbani (McGill University) (95) biztosította. Az emberi CHOP expressziós vektort, a pcDNA3.1-hygro-CHOP-ot Dr. K. Onazaki-tól (Nagoya City University, Nagoya, Japán) szereztük be (96), míg a patkány pCMV-C/EBPβ-vektorát Dr. E. Holthuizen ( Urechti Egyetem, Utrecht, Hollandia) (97, 98). A pCMV2-Hes1 Hes1 expressziós plazmidot és kontroll plazmidját Dr. S. Stifani (McGill University) (99) biztosította.

Sejtkultúra, tranziens transzfekciók, valamint luciferáz és β-galaktozidáz vizsgálatok

A HEK293 (humán embrionális vese), a COS-1 és a CV-1 (afrikai zöld majom vese) sejteket az American Type Culture Collection (Bethesda, MD) sejtekből nyertük, és 10% magzati szarvasmarha-szérummal és antibiotikumokkal kiegészített DMEM-ben tartottuk. A Simpson-Golabi-Behmel-szindrómában (SGBS) szenvedő csecsemő sc-zsírszövetének sztrómasejt-frakciójából származó emberi SGBS-preadipocitákat tenyésztettük és érett adipocitákká differenciáltuk, a korábban leírtak szerint (22). Az összes sejtet 37 ° C-on, 5% CO2-ban levegőben inkubáltuk.

A HEK293, COS-1 és CV-1 sejtvonalak átmeneti transzfekcióit Polyfect transzfekciós reagens (QIAGEN, Mississauga, Ontario, Kanada) felhasználásával hajtottuk végre, a gyártó utasításainak megfelelően. Röviden, a sejteket hat- vagy 12-lyukú szövettenyésztő lemezekre szélesztettük, és teljes táptalajban növesztettük 16–20 órán át, hogy a transzfekció idején elérjük a 60–80% -os összefolyást. A sejteket olyan DNS-keverékkel transzfektáltuk, amely tartalmazta V2 promoter luciferáz riporter konstrukciókat (0,5 μg), β-galaktozidáz kontroll plazmidot (0,04–0,2 μg) és expressziós vektorokat (Ets1, CHOP, C/EBPβ vagy Hes1 esetében) vagy ezek megfelelőjeit. üres vektorok Polyfect reagenssel együtt 1: 3 arányban. A transzfekciókat három példányban hajtottuk végre, és negatív kontrollként az üres pGL3-basic vektort használtuk. Az emberi SGBS preadipocyták esetében a transzfektálást Polyfect módszerrel is elvégeztük, azzal az eltéréssel, hogy a riporter konstrukció mennyiségét 1 μg-ra növeltük a maximális luciferáz aktivitás érdekében.

A transzfekció után 48 órával a sejteket 200 μl 1 × passzív lízispufferben (Promega, Madison, WI) gyűjtöttük be, és a lizátum felülúszót luciferáz és β-galaktozidáz aktivitásokra (Tropix, ABI, Bedford, MA) számszerűsítettük EG&G alkalmazásával. Berthold (Oakville, TN) Microlumat Plus bioluminométer (LB 96V). A luciferáz értékeit a transzfekciós hatékonyság belső kontrolljának β-galaktozidáz értékéhez normalizáltuk, és hajtásként fejeztük ki, az ábrákon és a legendákban leírtak szerint.

EMSA-k

Az Ets1 vagy Hes1 túlexpresszáló HEK293 sejtekből vagy HEK293 sejtekből származó nukleáris fehérjéket az NE-PER nukleáris és citoplazmatikus extrakciós reagenskészlet (Pierce, Rockford, IL) segítségével extraháltuk, amint azt korábban leírtuk (19). A Jurkat sejtmag kivonatot a Santa Cruz Biotechnology-tól (Santa Cruz, Kalifornia) vásároltuk.

Az Ets-kötő szekvenciát vagy a Hes1 1. hely-szekvenciát tartalmazó kiegészítő 20-35 mer oligonukleotidokat szintetizáltuk, lágyítottuk, így kettős szálú DNS-próbákat kaptunk, amelyek végét γ-32P és T4 polinukleotid-kinázzal jelöltük, és megtisztítjuk a G-50 centrifugális oszlopokon való áthaladással (Amersham, Piscataway, NJ). A megjelölt próbákat (50 fmol; ~ 50 000 cpm) 5-10 μg magkivonattal inkubáltuk szobahőmérsékleten 30 percig. A versenyvizsgálatokhoz a jelöletlen próbák 100-200-szoros moláris feleslegét egybeesettük a nukleáris kivonatokkal a jelzett próba hozzáadása előtt. Szupershift kísérletek során 2 μg anti-Ets1 poliklonális antitestet (sc-111; Santa Cruz Biotechnology) adunk a reakcióelegyhez, és 4 ° C-on 1 órán át inkubáljuk, mielőtt a jelzett próbákat hozzáadnánk. A DNS-fehérje komplexeket elektroforézissel analizáltuk nem denaturáló 5% -os poliakrilamid géleken, 100 V állandó értéken, körülbelül 1 órán át, 0,5x Tris-borate-EDTA (TBE) pufferben. A géleket szárítottuk és Kodak Biomax-MR filmnek tettük ki (Kodak, Rochester, NY).

ChIP teszt

Valós idejű kvantitatív RT-PCR

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± se értékben fejezzük ki. A csoportok közötti megfigyelt különbségek jelentőségét egyirányú ANOVA-val határoztuk meg, amelyet Tukey többszörös összehasonlító teszt (P> AF322014) követett, majd 211 bp 5'-upstream promóter régiót és kb. 300 bp V2 exont tartalmazott homológjaival összhangban, beleértve az 1B juhot (> S78252), az 1B szarvasmarhát (> AF046861) és az egér L2-t (> AF120480). A szekvenciaazonosságot csillagok jelzik, míg a kötőjelek az igazítás maximalizálása érdekében bevezetett réseket jelzik. Az 1B juhfélék fő TSS-ét (T, félkövér) a nyíllal +1 jelzi. Ezt használjuk +1 pozícióként az emberi V2 promóter konstrukciónk számozásánál is, mert ez képviseli az eddigi leghosszabb V2-szerű cDNS-t. A transzkripciós faktorok lehetséges kötőhelyeinek motívumait aláhúzza és megnevezi. A rendkívül konzervált CCAAT doboz és két átfedésben lévő Ets kötőhely dobozos. Az emberspecifikus CHOP és Hes1 helyeket szaggatott vonallal, illetve kerek pontokkal jelöltük. A juh- és szarvasmarha-1B vizsgálatokban azonosított Sp-helyeket jelöljük (félkövér és dőlt betűvel). A SREBP (dőlt betűvel) és a ZBP-89 (nyíl) helyek átfedésben vannak az exon Sp helyével.