Az étrend összetétele eltérően befolyásolja az inzulin útvonalát és a legyeket

1 Fejlődési Neurobiológiai és Neurofiziológiai Osztály, Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, Campus UNAM Juriquilla, Boulevard Juriquilla # 3001, Querétaro, QRO, cp. 76230, Mexikó

Absztrakt

1. Bemutatkozás

Egészségügyi állapottól függően ugyanazok a diéták eltérően befolyásolják a szervezet anyagcsere-teljesítményét, a túlélést és a jólétet [1], és sokat kell tenni az egységes eredmények elérése érdekében [2]. A heterogén kísérleti körülmények és az alanyok eltérései csak általános következtetésekhez vezetnek [3]. Ezenkívül keveset tudunk a különböző összetételű, azonos kalóriatartalmú étrend hosszú távú hatásairól, különösen a diabéteszes állapotokban az inzulinjelző kontrollokkal szemben, az életciklus teljes részében vagy egészében.

A legtöbb vizsgálatban rejlő általános problémák a genetikai háttér homogenizálásának nehézségei, a szigorú étrendi rendszerek hosszú távú betartása és a cukorbetegség homogenitása [4]. A cukorbetegség komplex betegség emberben. A vér megváltozott glükózszintje két fő típusra oszlik: az I. típusú diabetes mellitus az inzulintermelés hiánya miatt és a II. Típusú diabetes mellitus a szervezet inzulinhatásának való ellenállás miatt. Míg az I. típus általában autoimmun betegség, amely megcélozza és elpusztítja a betegek inzulintermelő sejtjeit (a béta-sejtek a hasnyálmirigyben található Langerhans-szigeteken), a II-es típus poligénes, és erősen befolyásolja az étrend és a környezet. Vannak olyan ritka monogén esetek is, amelyeket együttesen MODY-nak (Maturity Onset Diabetes in Young) neveznek, amelyek mindkét típus jellemzőivel megegyeznek, de ezeket általában a hasnyálmirigy-szigetecske sejtjeinek fejlődésében és az inzulin szekréciójában fellépő hibák okozzák, jobban hasonlítanak az I. típusú diabetes mellitushoz, és domináns mutációkkal [5].

Számos tanulmány egyre növekvő számú gént és bizonyos allélt mutat be, amelyek befolyásolják a II. Típusú cukorbetegség kialakulásának hajlamát az emberekben [6], és elhomályosítják az eredményeket különböző genetikai hátterű emberi alanyok felhasználásával, ami megnehezíti a vizsgálatok összehasonlítását. Ugyanez vonatkozik a legtöbb diabéteszes állatmodellre is, ahol a genetikai homogenitás nincs szigorúan érvényesítve [7].

Ezenkívül egy adott étrendi rendszer szigorú betartása hosszú távon lehetetlen olyan kísérleti alanyoknál, mint az emberek. A népszerű állatmodelleket, például a rágcsálókat, általában cukorbetegekké "alakítják" (pl. Sztreptozotocin kezeléssel), és nem "születik" cukorbetegekként, ezért zavaró kérdés a cukorbetegség állapotának különböző fokú és ütemű alakulása, még akkor is, ha ugyanaz az étrendi rendszer végig érvényesül.

A cukorbetegség különböző mértékű befolyásolása vagy súlyossága a hosszú távú vizsgálatok eredményeit is torzíthatja, még akkor is, ha minden mást állandóan tartanak. Itt arra törekedtünk, hogy legyőzzük ezeket a gyakori buktatókat azáltal, hogy homogén, genetikailag meghatározott mutáns hipomorf állapotokat használtunk az inzulin szignál útvonalán a II. Típusú cukorbetegség (inzulinrezisztencia) modellezésére egy kontroll törzzsel együtt [8], ahol az összes állomány genetikailag homogenizált háttérrel rendelkezik.

Az első életképes mutáns kezdeti jellemzése óta a Drosophila több mint húsz évvel ezelőtti inzulinút [9], a gyümölcslégy az inzulinvizsgálatok kedvelt organizmusává vált [7]. A legyek inzulin útja evolúciós szempontból konzervált, és széles körben jellemezték [7, 10].

Három különböző genetikai lókuszban, az inzulin-szignál kaszkád különböző szintjein mutációkat használva modelleztük a diabéteszes affektáció különböző mértékét. A legyeket izokalorikus étrendben tenyésztettük, a fehérjék aránya változó a lipidek/szénhidrátok arányában, és minden esetben két változatban: extra metioninnal vagy anélkül, összesen nyolc különböző étrendi rendszert alkalmazva. Az étrendi metioninszint kimutatták, hogy ellentétes eredménnyel befolyásolja a rágcsálók és a legyek élettartamát [11–16]. Emiatt arra kerestük a választ, hogy a legyek étrendjének metionintartalmában bekövetkező változások jelentősen megváltoztatják-e a kísérleteinkben mért paramétereket, és jelentősen megváltoztatják-e a korábban nem vizsgált diabéteszes állapotot, különösen az élettartamot.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Drosophila készletek

Az inzulinreceptor következő mutáns alléljai (Inr), foszfatidil-inozitol 3 ’kináz katalitikus alegység (Pi3K92E) és az S6 kináz (S6k) géneket használtak ezekben a vizsgálatokban: Inr - E19 (kémiailag indukált mutáció, amely nem található a kódoló szekvencián), és

; Pi3K92E A (a kódoló szekvencia törlése a 3 ’végén), és

(Pi3K92E néven is ismert Dp110, és úgy fogjuk emlegetni Dp110 a lapban);

(törlés a kódoló szekvencia 5 ’-éből), és S6k 07084 (P elem transzpozon inszerció a promóter régióban; S6k A 07084 néven is ismert S6k P1713; ezt a nevet fogjuk használni a cikkben), amelyeket eredetileg E. Hafentől (Svájc, ETH) szereztek be, és amelyet a FlyBase ír le [17]. Valamennyi mutáns allélt átkereszteztük öt és tíz generáció között egy kontroll érdekében sárga, fehér (y, w, felhívta ebben a cikkben yw) felhasználás előtt, a genetikai háttér homogenizálásához. Ez yw az állományt először magát isogenizálták, mint fent, a mutáns állományok izogenizálására használták, és vad típusú kontroll állományként használták. A harmadik kromoszóma-kiegyensúlyozó kromoszóma, a FlyBase [17] -ben leírt változatát, amely az aktin 5C fokozóból származó zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) expresszáló transzgént hordozza (Bloomington állomány központja 4534), az összes mutáns allélek. Ezt az egyensúlyi kromoszómát is keresztezték a yw mint fent, a genetikai háttér homogenizálásához. A genetikai háttér megosztása lehetővé teszi az összes állomány közvetlen összehasonlítását, és kiküszöböli azoknak a heterozigóta testvéreknek a használatát, akiknek azonos genetikai háttere lehet vagy nem.

2.2. Genetika

A homozigóta mutánsok minden esetben halálosak, ezért az életképes heteroallelikus mutáns kombinációkat használtuk: Inr E19 /, Pi3K92E A /, és / S6kp 1713. Az irányítást is alkalmaztuk yw a mutáns állományok mellett tenyésztett legyek, amelyek a heteroallelikus kombinációs mutánsokkal egyidejűleg kizárultak. Mivel ez a három lokusz az inzulinpályán belül különböző szinteken hat, a II-es típusú cukorbetegség különböző modelljei. A különböző életképes heteroallelikus kombinációk közötti általános fenotípusok általános inzulinpálya-követelményeket mutatnak (ezek a legyek rendelkeznek az inzulinút-kompromittált legyek összes jellemzőjével: lényegesen kisebbek, és kevesebb lárva éri el a bábállapotot; lásd például az 1. kiegészítő táblázatot), a fenotípusok vagy egy közös fenotípus erőssége a kérdéses hipomorfia lokuszához vagy szintjéhez képest.

Kereszteket készítettek heterozigóta legyek között, amelyek ugyanazon gén különböző alléljait hordozták. A frissen kikelt első stádiumú lárvákat összegyűjtöttük, megszámoltuk, száz vagy százötven csoportba osztottuk genotípus szerint (a heteroallelikus mutáns lárvákat elválasztottuk a GFP-expresszáló kiegyensúlyozó kromoszómát hordozó heterozigóta testvérektől), és a különböző diéták. A lárvák a különböző étrendek során fejlődtek ki, és megszámlálták a pupilla esetek számát (1. kiegészítő táblázat). Frissen kizárt felnőtteket használtunk kísérletekhez.

2.3. Fogyókúrák

2.4. Túlélési tanulmányok

A vizsgált különböző genotípusok újonnan kikelt első stádiumú lárváit szelektáltuk, és különböző étkezési rendszerű üvegcsékbe helyeztük, majd hagytuk bábozódni és elhallgatni. A különböző genotípusú egynapos szűz nőstényeket injekciós üvegenként tízes csoportokba helyeztük a különböző étrendekkel. Minden injekciós üveg 5 gr-ot tartalmazott az adott tesztelt étrendből. A túlélést háromnaponta vizsgálták, és a túlélő legyeket a kísérlet ideje alatt hét-tíz naponta friss élelmiszer-fiolákba helyezték. Az ampullákat 25 ° C-on és 40-50% relatív páratartalom mellett, 12: 12-es fény: sötét ciklusban tenyésztettük a kísérlet során.

2.5. Összes szénhidrát-, összes lipid- és tömegmérés

A teljes szénhidrát- és lipidmérést 7-10 egyedi legyben értékelték, Van Handel protokolljainak [19] nyomán, a [9] -ben megvalósítottaknak megfelelően. Szűz nőstény legyeket használtunk az elemzés során egy és öt napos korban, különböző étrendeken tenyésztve. Ugyanazokat a legyeket, mielőtt feldolgoztuk őket az összes szénhidrát- vagy lipidméréshez, egyenként lemértük a 0,1-es Cahn C-31 mikrobalancia segítségével. μg - 25 mg tartomány, amint azt a [20].

2.6. Statisztika

Kétirányú ANOVA-t használtunk Friedman post-hoc tesztjeivel a várható élettartam elemzéséhez. A diéták súlyára, összes szénhidrátjára és lipidjeire, valamint az egy- és ötnapos legyek közötti hatásokra az ANOVA-t használtuk Sidak poszt-hoc tesztjeivel. Valamennyi tesztet a Prisma, a GraphPad alkalmazásában hajtották végre.

3. Eredmények

3.1. A diétarendszerek befolyásolják a felnőtt legyek súlyát (méretét)

Minden kísérlethez felnőtt legyeket gyűjtöttünk össze, amelyeket az első szaporító lárvák kikelésétől kezdve felnőttekig neveltek a különböző étrendekben. Az 1. ábrán mutatunk be egy példát a vizsgálatokban alkalmazott kontroll és heteroallelikus (mutáns) kombinációkra (1. ábra). A méret számszerűsítése érdekében az egyes legyeket azonos életkorban mikroban mérlegeltük. Szinte minden esetben a mutáns genotípusok súlya szignifikánsan kisebb volt, mint a megfelelő kontroll (yw) legyek. Mivel minden legynek azonos a genetikai háttere, közvetlenül összehasonlíthatjuk a különböző genotípusok eredményeit.