Az étrendi aminosav- és vitaminkomplexum megvédi a méheket az általuk okozott immunszuppressziótól Nosema ceranae

Szerepek konceptualizálás, adatgondozás, hivatalos elemzés, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció, írás - eredeti tervezet

Belgrádi Egyetem Állatorvos-tudományi Kar Biológiai Tanszéke, Belgrád, Szerbia

Szerepek Adatmegőrzés, módszertan, szoftver, validálás

Molekuláris biomedicina munkatársa, Molekuláris Genetikai és Géntechnikai Intézet, Belgrádi Egyetem, Belgrád, Szerbia

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, vizsgálat

Belgrádi Egyetem Állatorvos-tudományi Kar Biológiai Tanszéke, Belgrád, Szerbia

Szerepek vizsgálata, módszertan, írás - áttekintés és szerkesztés

Belgrádi Egyetem Állatorvos-tudományi Kar Biológiai Tanszéke, Belgrád, Szerbia

Szerepek konceptualizálás, felügyelet

Tagsági Újvidéki Tudományos Állatorvosi Intézet, Újvidék, Szerbia

Szerepek Szoftver, validálás, vizualizáció

Belgrádi Egyetem Mezőgazdasági Karának Statisztikai Tanszéke, Belgrád, Szerbia

Szerepek konceptualizálás, finanszírozás megszerzése, módszertan, források, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Belgrádi Egyetem Állatorvos-tudományi Kar Biológiai Tanszéke, Belgrád, Szerbia

Uros Glavinic,
Biljana Stankovic,
Vlagyimir Draskovics,
Jevrosima Stevanovic,
Tamás Petrovic,
Nada Lakic,
Zoran Stanimirovic

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Glavinic U, Stankovic B, Draskovic V, Stevanovic J, Petrovic T, Lakic N és mtsai. (2017) Az étrendi aminosav- és vitamin-komplex megvédi a méheket a Nosema ceranae által okozott immunszuppressziótól. PLoS ONE 12 (11): e0187726. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0187726

Szerkesztő: Sanjay B. Jadhao, International Nutrition Inc., AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Fogadott: 2017. február 19 .; Elfogadott: 2017. augusztus 30 .; Közzétett: 2017. november 8

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: Ezt a tanulmányt a Szerb Köztársaság Oktatási, Tudományos és Technológiai Fejlesztési Minisztériuma (III46002. Sz. Támogatás) támogatta Zoran Stanimirovic professzor vezetésével.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Nosema spp. a microsporidia gyakran parazitál a kifejlett méheken [1]. Két fajt írtak le: Nosema apis és N. ceranae. Számos jelentés feltárta, hogy a N. ceranae dominál a N. apis felett, mivel az előbbiek sokkal nagyobb előfordulását és sokkal szélesebb földrajzi eloszlását bizonyították a világ legtöbb részén [1–9]. Az N. ceranae fertőzés mind az egyes mézelő méhekre [4,10–12], mind a telepekre hatással van, és a kolónia összeomlásának rendellenességével - CCD [10,13–16] összefüggésben van, amely befolyásolja a mézelő méhcsalád reprodukcióját és termelékenységét [17,18 ].

A rovarok robusztus immunrendszerrel rendelkeznek, hogy megvédjék magukat a különböző kórokozók támadásától. Ez a rendszer magában foglalja a fizikai akadályokat, mint az első védelmi vonalat, valamint a veleszületett sejtes és humorális immunitást - a második védelmi vonalat [19]. Az apidaecin [20], az abaecin [21], a himenoptaecin [22] és a defenzin [23] antimikrobiális peptidek, amelyek a humorális immunitás összetevői, sokat hozzájárulnak a mikroorganizmusok elleni védekezéshez [24]. A mézelő méh vitellogenin egy nőspecifikus sárgájfehérje, amelyet a mézelő méhek immunitásának és hosszú élettartamának egyik legfontosabb szabályozójaként ismernek el [25, 26]. Az immunrendszerrel összefüggő fehérjéket kódoló gének kifejeződését számos tanulmányban vizsgálták: Antúnez et al. [24] kimutatta, hogy egyes gének expressziója N. ceranae fertőzött méhekben szignifikánsan csökkent, és Chaimanee és mtsai. [27] megerősítette a gazda immunszuppresszióját N. ceranae fertőzéssel. Más kórokozók, például a Varroa destructor [28], a vírusok [29,30] és a Paenibacillus lárvák [31] szintén befolyásolják a méhek immunitását. Ezenkívül egyes eredmények rávilágítottak a táplálkozás pozitív hatására a méhek immunitásának bizonyos aspektusaira [32,33], ideértve a pollen tápanyagok hatását a hosszú élettartamot befolyásoló génekre és egyes antimikrobiális peptidek termelésére [34,35].

A táplálékkiegészítés a méhészeti gyakorlatban gyakori természetes takarmányhiány esetén. Sajnos az elmúlt évtizedekben a természetes élőhelyek jelentős mértékű elvesztését tapasztalták, ami óhatatlanul a virágbőség és a sokféleség csökkenéséhez vezetett [36]. Ennek következtében a természetes méhtakarmány (pollen és nektár) hiánya sok régióban jelentkezik, és megfelelő kiegészítő étrendek szükségességét váltja ki [37,38], amelyek csökkenthetik a telepveszteséget a fehérje stressz enyhítésével [39]. A mézelő méhek leggyakoribb kiegészítői aminosavakon és vitaminokon alapulnak, ezek egyike a "BEEWELL AminoPlus". 2010-től széles körben használják a balkáni országokban, de a méhekre gyakorolt hatásának tudományos vizsgálatát még nem kellett elvégezni.

Nincs következetesség azon vizsgálatok eredményei között sem, amelyekben a fehérje étrend hatékonyságának markerként a ketrecben tartott mézelő méhek hemolimfájában lévő fehérjetiteret használták: De Jong et al. [49] a FeedBee ® és a BeePro ® fehérje-kiegészítőket hatékonyabbnak találta, mint a természetes pollent; Morais és mtsai. [50] nem észlelt különbséget a mesterséges, saját készítésű fehérjében gazdag étrend és a méhkenyér között; DeGrandi-Hoffman és mtsai. [43] nem számoltak be különbségről a BeePro ®, a MegaBee ® és a Brassica rapa pollen hatása között; és Basualdo és mtsai. [45] szignifikánsan magasabb hemolimfafehérje-titerről számolt be, de a méhkenyérrel etetett méheknél is jobb a túlélés, mint a szubsztitúcióval.

Következetlen eredményekről számoltak be, figyelembe véve a fehérje-étrend kórokozószintre gyakorolt hatását is. Basualdo és munkatársai munkájában. [45] magasabb N. ceranae mennyiséget (de túlélést is) regisztráltak a méhkenyérrel etetett méheknél, összehasonlítva azokéval, akik étrendjét pótlóval egészítették ki (mesterséges fehérjetartalmú étrend Virgen ®); fordítva, DeGrandi-Hoffman et al. [43] magasabb kórokozó (Nosema és vírus) szintről, valamint súlyosabb királynő és telep veszteségről számolt be azokban a csoportokban, amelyeket táplálékkiegészítőkkel tápláltak, különös tekintettel a BeePro ® -ra. .

Az N. ceranae immunszuppresszív hatásainak korábbi megállapításaiból kiindulva [24,27] és a megfelelő fehérjetáplálás jótékony hatásaiból a mézelő méhcsalád egészségére és fejlődésére, az immunválaszra, a parazita toleranciára és a túlélésre [32–34,39,43 –45,51] feltételeztük, hogy a „BEEWELL AminoPlus” (nagyon aminosavakban és vitaminokban gazdag étrend-kiegészítő) befolyásolhatja a méhek immunitását. Így ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy felmérje ennek a kiegészítésnek a N. ceranae fertőzés által veszélyeztetett mézelő méhek védelmének lehetőségét.

Anyagok és metódusok

Tesztelt kiegészítő

Vitaminok, ásványi anyagok és aminosavak keverékét (1. táblázat) tesztelték, amelyet „BEEWELL AminoPlus” (Provet, Ankara, Törökország) márkanév alatt értékesítenek. Az etetőoldatot a gyártó utasításai szerint készítettük (1 ml BEEWELL AminoPlus/1 l cukorszirup).

Kísérleti terv

Inokulum előkészítése és kísérleti fertőzés

A spóraoldatot N. ceranae-fertőzött méhek felhasználásával készítettük, hasukat desztillált vízben összetörve. A N. ceranae jelenlétét és a N. apis hiányát PCR-rel igazolták Martín-Hernández és mtsai. [11]. A spórákat Cantwell szerint számoltuk [54]. A legalább 99% -os életképességű oltóanyagot (4% tripánkékkel értékelve) frissen állítottuk elő spórák 50% -os szacharóz-oldattal való összekeverésével, így 1 x 106 spóra/ml végkoncentrációt kaptunk. Az NI kivételével az összes csoport N. ceranae inokulummal fertõzõdött a megjelenés után a 3. napon Fries és mtsai. [55]. Annak biztosítása érdekében, hogy minden méh a teljes dózist elnyelje, egyedi oltást végeztünk a Williams és mtsai által részletesen leírt protokoll alkalmazásával. [53].

Méhek mintavétele

Öt méhből vettünk mintát az RNS kivonására a következő ütemezés szerint: a fertőzés utáni 3. napon (p.i.) az I-BW1, az I-BW3 (az adott napig kiegészítéssel etettük) és az I. csoportból; fertőzés után 6. és 12. napon minden csoportból, kivéve az I-BW9-et, amelyből a méheket a 12. napon gyűjtöttük össze (2. táblázat). Ugyanezen a mintavételi napon (2. táblázat) minden csoportból további öt méhből vettünk mintát, és hasukat egyenként homogenizáltuk 1 ml desztillált vízben, és méhenként N. ceranae spóraszámot becsültünk haemocitométerrel [54].

Az RNS és a cDNS szintézisének kivonása

Minden egyes mézelő méhet egy steril, 1,5 ml-es polipropilén mikrotubulusba helyeztünk 200 μl vízzel (PCR-fokozat), és steril eldobható mikrotuboros mozsárral (VWR, San Francisco, Kalifornia) homogenizáltuk. A teljes RNS-t minden egyes mézelő méhből elkülönítettük a Quick-RNA MiniPrep Kit (Zymo Research, USA) gyártói utasításoknak megfelelően. Az extrakciós folyamat során a mintákat „oszlopon belüli DNáz-kezelésen” (DNase I Reaction Mix kezelés) alkalmazták, hogy eltávolítsák a szennyező DNS-t. A teljes kivont RNS-t azonnal felhasználták az első szálú cDNS-ek előállításához a RevertAid ™ First Strand cDNS szintézis készlet segítségével (Fermentas, EU), a gyártó utasításainak megfelelően.

Valós idejű kvantitatív PCR

A reverz transzkripció-kvantitatív PCR (RT-qPCR) amplifikációt SYBR zöld módszerrel, 20 μl reakcióelegyben hajtottuk végre a „KAPA SYBR ® FAST Master Mix (2X) Universal” (KAPA Biosystems, USA) gyártói utasításokkal összhangban. . Az RT-qPCR reakcióhoz 0,2 μM-t használtunk minden specifikus primerből. Az amplifikációhoz használt primereket a 3. táblázat mutatja.

Az RT-qPCR reakciókat 36 lyukú rotorban hajtottuk végre, Rotor-Gene Q 5plex (Qiagen, Valencia, CA) alkalmazásával. Az amplifikációt a következő protokoll szerint hajtottuk végre: 95 ° C 2 percig, majd 40 ciklus 95 ° C 20 másodpercig, 60 ° C 30 másodpercig és 72 ° C 80 másodpercig. A génexpressziós szintek számszerűsítését 2 -ΔΔC T módszerrel végeztük [58]. Az egyes génexpressziók normalizálásához a b-aktint használtuk belső kontroll génként, az NI csoport medián értékét pedig kalibrátorként.

Statisztikai analízis

Az adatok homogenitása (cv> 30%) miatt meghatároztuk a mediánokat és nem-parametrikus teszteket alkalmaztunk. A Nosema spórák számának és a génátírási szintek közötti különbségeket a csoportok között és a mintavételi napok között Kruskal-Wallis és Mann-Whitney U teszttel értékeltük. A méhek mortalitásának összehasonlítása a csoportok között Kruskal-Wallis tesztet végzett. Az összes statisztikai elemzést a Statistica ® szoftvercsomaggal (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA) végeztük. A 0,05 alatti P-értékeket szignifikánsnak tekintettük.

Eredmények

N. ceranae spórák jelenléte

Kontrollminták és a 3. napon gyűjtött minták p.i. a kísérleti időszakban negatív maradt a N. ceranae spórákra nézve. A Kruskal-Wallis teszt eredményei szignifikáns különbségeket mutattak a N. ceranae spórák száma között a csoportokban a 6. napon (H = 23,629; df = 4; p 2. ábra. Nosema spóraterhelések a kontrollcsoportban, valamint az aminosavval és vitaminkomplexummal kezelt csoportok „BEEWELL AminoPlus ”a N. ceranae fertőzés utáni 6. és 12. napon.

A csoportok a megjelenést követő 3. napon N. ceranae spórákkal fertőződtek, és az 1. (I-BW1), a 3. (I-BW3), a 6. (I-BW6) és a 9. (I -BW9) nappal a megjelenés után, míg a kontroll (I) fertőzött volt, de nem kezeltük. A különböző betűk jelentős különbségeket jelölnek a csoportok között.

A spórák száma szignifikánsan magasabb volt az I. csoportban, mint bármelyik másikban mind a 6., mind a 12. napon. A Mann-Whitney U teszt eredményei azt mutatták, hogy a méhek spóraszáma a 6. napon gyűlt össze. szignifikánsan magasabbak voltak a kontrollban (I), mint az I-BW1-ben (z = 3,787; a p. sp. sp. száma szignifikánsan alacsonyabb volt az I-BW1 csoportban, mint az I-BW6 csoportban (z = -2,919; p = 0,004), I-BW9 (z = -3,785; p 3. ábra. Az abaecin gén expressziós szintje a N. ceranae fertőzés utáni 3. napon aminosavval kezelt csoportokban - „BEEWELL AminoPlus” vitaminkomplexum.

A csoportok a megjelenést követően a 3. napon N. ceranae spórákkal voltak megfertőzve, és az 1. naptól (I-BW1) és a 3. naptól (I-BW3) "BEEWELL AminoPlus" -val kezeltek, míg a kontroll csoport (I) fertőzött volt, de nem kezelték . A különböző betűk jelentős különbségeket jelölnek a csoportok között.

Hat nappal az N. ceranae fertőzés után az I., I-BW1, I-BW3 és I-BW6 csoportból gyűjtött méhek között nem volt szignifikáns különbség a megfigyelt gének expressziójában.

Kruskal Wallis teszt eredményei szerint a 12. napon p.i. az mRNS szintje szignifikánsan különbözött abaecin (H = 13,07; df = 4; p = 0,011), defenzin (H = 12,66; df = 4; p = 0,013), apidaecin (H = 13,09; df = 4; p = 0,11), himenoptaecin (H = 13,83; df = 4; p = 0,008) és vitellogenin (H = 13,75; df = 4 p = 0,008) (4. ábra). Az abaecin gén expressziója szignifikánsan alacsonyabb volt az első naptól kezelt méhekben (I-BW1), összehasonlítva az I-BW3 és I-BW6, és a 9. naptól kezelt csoportban (I-BW9), mint az összes többi csoport méhében . A himenoptecin és az apidaecin mRNS szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a kontrollban (I), mint más csoportokban. A defenzin és a vitellogenin génjei az I és az I-BW1 csoportokban alacsonyan voltak szabályozva az I-BW6 és I-BW9 csoportokhoz képest.

A csoportok a megjelenésük utáni 3. napon N. ceranae spórákkal fertõzõdtek, és „BEEWELL AminoPlus” -val kezeltük az 1. (I-BW1), a 3. (I-BW3), a 6. (I-BW6) és a 9. (I -BW9) napon, míg az (I) kontrollcsoport N. ceranae-val volt fertőzve, de nem kezelték. A különböző betűk jelentős különbségeket jelölnek a csoportok között.

A génexpresszió az azonos csoporton belüli idő alatt

A Kruskal-Wallis teszt eredményei szerint az összes csoportban a génexpresszió szintje különbözött a mintavételi napok között (3., 6. és 12. pi nap), ahol a különbségek a szignifikancia szempontjából nagyon közel voltak a kritikus szinthez, de csak néhány (ábra 5) szignifikánsak voltak (p. Pi pi, mint a 3. napon (z = 2,611; p = 0,009) és a 12. napon pi (z = 2,611; p = 0,009), és szignifikánsan alacsonyabbak voltak a 3. napon, mint a 12. napon pi nap (z = -2,402; p = 0,016) (Mann-Whitney U-teszt). Az I-BW1 és I-BW3 csoportban az Apidaecin-génexpressziós szintek szignifikánsan különböztek (H = 7,58; df = 2; p = 0,023 és H = 6,86; df = 2; p = 0,032 ill.), És magasabbak voltak a pi. 12. napon, mint más mintavételi napokon. Az I-BW1 csoport vitellogenin szintje szignifikánsan különbözött (H = 10,14; df = 2; p = 0,006), szignifikánsan alacsonyabb volt a 3. napon, mint a 6. és 12. napon a pi Mann-Whitney U teszt szignifikáns különbségeket mutatott ki a defenzin, vitellogenin, apidaecin és a himenoptaecin gének expressziójában a 3. és 12. napon összegyűjtött méhek között az I-BW3 csoportban a 12. javára (6. ábra).

Az IBW-1 csoportot N. ceranae spórákkal fertőztük meg a 3. napon, és a megjelenéstől számított 1. naptól kezdve „BEEWELL AminoPlus” -val kezeltük, míg az (I) kontroll N. ceranae-val fertőzött, de nem kezeltük. A méhekből az N. ceranae fertőzés utáni 3., 6. és 12. napon vettek mintát elemzés céljából. A különböző betűk jelentős különbségeket jelölnek a csoportok között.

Az IBW-3 csoportot N. ceranae spórákkal fertőztük meg 3. napon, majd a megjelenésétől számított 3. naptól „BEEWELL AminoPlus” -val kezeltük. A méhekből mintákat vettünk az elemzésre a fertőzés utáni 3., 6. és 12. napon. A különböző betűk jelentős eltéréseket jeleznek a gyűjtési idők között.

Ezenkívül a különböző mézelő méh stresszorok befolyásolhatják a DNS metilációját és következésképpen a génexpressziót [70]. Közismert, hogy bármelyik mikroelem (folsav, B12-vitamin, B6-vitamin, niacin, C-vitamin, E-vitamin, vas vagy cink) hiánya DNS-károsodást okoz egy- és kettős szálú törések, oxidatív elváltozások, vagy mindkettő [71]. Ezenkívül a metil-donorokban gazdag táplálkozás befolyásolhatja a méhek társadalmi szerveződésében [72], esetleg humorális, sejtes és társadalmi immunitásban szerepet játszó DNS-metilációt. A metildonorokat (pl. Metionin és B-vitamin komplexet) tartalmazó „BEEWELL AminoPlus” kiegészítéssel történő etetés megakadályozhatja a DNS hipometilezését. Ezenkívül a „BEEWELL AminoPlus” C-vitamin (antioxidánsként) hozzájárulhat a DNS-oxidatív elváltozások megelőzéséhez, amelyeket valószínűleg a Nosema parazita okozhat. Figyelembe véve a Nosema fertőzés intenzitásának és az immungének expressziós szintjének különbségét, amelyet tanulmányunk bizonyított a „BEEWELL AminoPlus” kiegészített és kontroll méhek között, feltételezzük, hogy a DNS hipometilezése és az oxidatív stressz hozzájárulhat az immunszuppresszióhoz. Ennek a hipotézisnek az alátámasztására további vizsgálatok szükségesek, mind laboratóriumi, mind kaptárban (oxidatív stressz-kutatásokhoz) és terepen (gén-expresszió-értékeléshez).

Néhány korábbi eredmény feltárta a táplálkozás jótékony hatását a méhek egészségére, különös tekintettel a fehérjetápláltság és az immunitás, a hosszú élettartam, a méhek túlélése és a kórokozókkal szembeni védekezés közötti összefüggésre [32–34,45,51]. Eredményeink azt mutatják, hogy a „BEEWELL AminoPlus” hasonló hatást gyakorol a méhek egészségére. A Nosema-fertőzött telepek immunvédő kiegészítőjeként történő alkalmazása abszolút ajánlott, mert a fumagillinnel végzett kezelések, bár hatékonyak, problémát okozhatnak a méhek egészsége, a kaptártermékek minősége és a fogyasztók egészsége szempontjából [73–75].

Ez a tanulmány kimutatta az N. ceranae negatív hatását a méhek egészségére, amint arról korábban beszámoltunk [4,10,13–16,18,76,77]. Eredményeink azt mutatják, hogy a tesztelt „BEEWELL AminoPlus” kiegészítés képes módosítani az immunrendszerrel összefüggő gének expresszióját a N. ceranae fertőzés által veszélyeztetett mézelő méhekben. A kiegészítés akkor mutatta a legjobb hatékonyságot, ha a Nosema fertőzéssel egyidejűleg alkalmazták (I-BW3 csoport), ami a kora tavaszt javasolja a legkényelmesebb időszaknak, mivel a Nosema spóraterhelése a kaptárban a legnagyobb ebben az időszakban [76,78–80]. Ennek ellenére a hipotézis megerősítéséhez további vizsgálatok szükségesek a kaptári kísérletekben.