A vese és a csont Memo1 gén expresszióját az étrendi ásványi anyag terhelés és a kalciotrop hormonok nem befolyásolják

Matthias B. Moor

1 Orvostudományi Tanszék, Lausanne-i Egyetem, Lausanne, Svájc,

2 Nemzeti Kutatási Kompetencia Központ (NCCR) "Kidney.CH - A homeosztázis veseellenőrzése" Svájc, Zürich, Svájc,

4 Jelenlegi cím: Nefrológiai és Hipertónia Osztály, Bern Egyetemi Kórház, Bern, Svájc,

Olivier Bonny

1 Orvostudományi Tanszék, Lausanne-i Egyetem, Lausanne, Svájc,

2 Nemzeti Kutatási Kompetencia Központ (NCCR) "Kidney.CH - A homeosztázis veseellenőrzése" Svájc, Zürich, Svájc,

3 Nefrológiai szolgálat, Orvosi Osztály, Lausanne Egyetemi Kórház, Lausanne, Svájc,

Társított adatok

Nyers adatok kérésre a szerzőktől állnak rendelkezésre.

Absztrakt

A sejtmotilitás 1 mediátora (MEMO1) a növekedési faktorokra adott sejtválaszok mindenütt expresszált modulátora, beleértve az FGF23 jelátvitelt, és a Memo1-hiányos egereknek vannak fenotípusos tulajdonságai az Fgf23- vagy Klotho-hiányos egérmodellekkel. Itt teszteltük, hogy a Memo1 gén expresszióját kalciotrop hormonok szabályozzák-e, vagy megváltoztatják-e az étrendi ásványi anyag terhelést. Az MLO-Y4 oszteocita-szerű sejteket tenyésztettük és 1,25 (OH) 2-D3-vitaminnal kezeltük. A vad típusú C57BL/6N egereken 1,25 (OH) 2-D3-vitamint, mellékpajzsmirigy-hormont, 17β-ösztradiolt vagy vivőanyagot kezeltek. A C57BL/6N egerek egyéb kohorszait kalcium- vagy foszfáttartalmú étrendekkel etették. A Memo1 és a kontroll gének expresszióját qPCR segítségével értékeltük. Az 1,25 (OH) 2-D3-vitamin akutan csökkentette a Memo1 transzkriptum szintjét in vitro, de nem in vivo. A tesztelt hormonok egyike sem volt hatással a Memo1 transzkriptumokra, míg a vizsgált kontroll gének a várt módon reagáltak. Az étrendi beavatkozások kalciummal és foszfáttal nem befolyásolták a Memo1 átiratát, de megváltoztatták a választott kontroll gének expresszióját. Megfigyeltük, hogy a Memo1-et nem szabályozták kalciotrop hormonok vagy az ásványi anyag terhelésének változása, ami jelentős különbségekre utal Klotho, Fgf23 és Memo1 szabályozása és fiziológiai szerepe között.

Absztrakt

A MEMO1, az ásványi homeosztázis új szabályozója közömbös az étrend kalcium- vagy foszfátterhelésével és a kalciotrop hormonokkal szemben, mint például 1,25 (OH) 2-D3-vitamin, mellékpajzsmirigy-hormon és 17β-ösztradiol.

1. BEMUTATKOZÁS

A Memo1 egy evolúciósan konzervált fehérje az élet minden országában, amely intracelluláris expressziót mutatott a citoplazmában és a sejtmagban (Haenzi et al., 2014; Moor, Haenzi és mtsai, 2018; Schlatter és mtsai, 2012). Feltételes és indukálható knockout egérmodell, a Memo1 gén 2 exonjának postnatalis törlésével az öregedés és az idő előtti halál szindrómáját eredményezte olyan jellemzőkkel, mint az emelkedett kalcémia, az FGF23 és az 1,25 (OH) 2-D3-vitamin, a csontbetegség, tüdő emfizéma, szubkután zsír atrófiája, inzulin túlérzékenység és veseelégtelenség (Haenzi et al., 2014; Moor, Ramakrishnan és mtsai, 2018). Ez a fenotípus szignifikánsan átfedi az egérmodellek fenotípusait, amelyek hiányosak a KLOTHO-ban (Kuro-o és mtsai, 1997) vagy az FGF23-ban (Shimada és mtsai, 2004). a vese és a csont, és kisebb mértékben a belek is (Hu, Shiizaki, Kuro-O, & Moe, 2013; Moor & Bonny, 2016).

Ezenkívül az adaptív fehérjék ko-lokalizációját és foszforilációs állapotát vizsgáló sejttenyésztési kísérletekből származó bizonyítékok azt sugallják, hogy az 1 sejtmotilitás mediátora (MEMO1) részt vesz és modulálja az FGF23 és az FGFR közötti jelátviteli kaszkádot (Haenzi et al., 2014).

A Klotho és Fgf23-hiányos egerek szérumanalízisei túlzott 1,25 (OH) 2-D3-vitamin-szintet mutattak, ezt a megállapítást a memo1-hiányos egerekben a genetikai háttér függvényében változóan találták (Haenzi et al., 2014; Moor, Ramakrishnan és munkatársai, 2018). Az Fgf23 és a Klotho promóterei egyaránt tartalmaznak D-vitamin-válasz elemeket (VDRE) (Forster et al., 2011; Orfanidou, Malizos, Varitimidis és Tsezou, 2012). Az FGF23 szekrécióját a mellékpajzsmirigy hormon (PTH) (Lavi-Moshayoff, Wasserman, Meir, Silver és Naveh-Many, 2010) és a 17β-ösztradiol fokozza (Carrillo-Lopez et al., 2009). A Memo1 szabályozását illetően a patkány tobozmirigyeinek transzkripptikus elemzése a kontrollokhoz képest megnövekedett Memo1 transzkriptumokat mutatott fel szintetikus ösztrogénkezeléssel (Deffenbacher & Shull, 2006), kiemelve a Memo1 gén transzkripciójának lehetséges endokrin szabályozását. Itt tehát azt a hipotézist teszteltük, hogy a Memo1 expressziója ásványi anyagokkal vagy kalcitrópiás ingerekkel szabályozható.

2. MÓDSZEREK

2.1. Sejtkultúra

Az egér hosszú csontos osteocyta-Y4 sejtvonalát (MLO-Y4) Lynda Bonewald (Kato, Windle, Koop, Mundy és Bonewald, 1997) szívesen biztosította. Az MLO-Y4 sejteket minimális esszenciális táptalajban tartottuk alfa-módosított, alfa-MEM-ben (Gibco by Life Technologies), amely 2,5% hő-inaktivált borjúszérumot (Sigma), 2,5% hő-inaktivált szarvasmarha-magzatot (Sigma) tartalmaz, és 1% penicillin/sztreptomicin (Invitrogen by Life Technologies). A szérum hőinaktiválást 30 percig 56 ° C-os vízfürdőben végeztük. A sejteket patkányfarkú I. típusú kollagénnel tenyésztettük (Invitrogen by Life Technologies). A D-vitamin stimulálásához a sejteket szérummentes tápközegben, 10 nM 1,25 (OH) 2-D3-vitamin (Sigma) vagy etanol hordozóval kiegészítve 24 órán át tartottuk.

2.2. Állatkísérletek

A C57BL/6N egereket Janvier-től szereztük be. Az egereket hagyományos állattartó létesítményben tartották, ketrecenként legfeljebb hat állattal, és standard laboratóriumi chow-val etették őket (Kliba Nafnag TS3242; kalcium 1%, foszfor 0,65%, magnézium 0,23%, D-vitamin 1600 NE/kg, A-vitamin 27 000 NE/kg, E-vitamin 150 mg/kg, fehérje 18,8%, nyers zsír 5,6%, nyersrost 3,5%, lizin 1,1%; KLIBA), hacsak másképp nincs meghatározva, és 12/12 (kísérleti) vagy 14/10 (tenyésztési) napon tartották ) világos – sötét ciklusok. Minden állatkísérleti protokollt a Canton de Vaud, Svájc Állami Állategészségügyi Szolgálata hagyott jóvá. Az összes egérvizsgálat során a mintanagyságokat figyelembe vettük laboratóriumunk korábbi eredményei alapján.

2.3. Diétás beavatkozások

Az ásványi anyagcsere tanulmányozásához speciálisan tervezett étrendeket és hormonokat használtak. Kalcium-diétás kísérleteket feltételenként öt hím C57BL/6N egérrel végeztünk háziketrecükben, mindegyik 12 hetes volt. Az egereket véletlenszerűen kiosztottuk úgy, hogy 7 nap alatt 0,17% (alacsony kalciumtartalmú étrend), 0,82% (normál kalciumtartalmú étrend) vagy 1,69% (magas kalciumtartalmú étrend) vagy 1,69% (magas kalciumtartalmú étrend) vagy 1,69% (magas kalciumtartalmú étrend) (KLIBA, 2222) tápanyagát etessük 7 nap alatt. Az összes kalcium-étrend 0,8% foszfort, 4000 NE/kg A-vitamint, 1000 NE/kg D-vitamint, 100 mg/kg E-vitamint, 18% fehérjét és 7% nyerszsírt, 14 g/kg lizint tartalmazott (Kliba, 2222). A foszfát-diétás kihíváshoz három, öt hím C57BL/6N egérből álló csoportot tartottak 13–14 hetes anyagcsere-ketrecekben, és véletlenszerűen kiosztották őket alacsony (0,2%), köztes (0,8%) vagy magas (1,5) diéták táplálására. %) foszfáttartalom 7 nap alatt. A foszfát diéták a KLIBA 2222 diéta módosításai voltak (kalcium 1,2%, A-vitamin 4000 NE/kg, D-vitamin 1000 NE/kg, E-vitamin 100 mg/kg, fehérje 18%, nyers zsír 7% és lizin 14 g/kg ).

2.4. Hormoninjekciók

Valamennyi hormoninjekciót az egerek otthoni ketrecében hajtottuk végre, az egyedi füljelölt egerek véletlenszerű kezelése után. 1,25 (OH) 2-D3-vitaminkezeléshez a 13–15 hetes hím C57BL/6N egereket szubkután 2 μg/testtömeg-kg 1,25 (OH) 2-D3-vitaminnal (Sigma D1530) injektálták etanolban 1 % NaCl-ban 0,9%. Az adag és az alkalmazás módja megegyezett a laboratóriumunkban korábban alkalmazott módszerrel. A kontroll egereket 1% (v/v) etanollal injektáltuk 0,9% NaCl-ban. Az egereket 6 órával az injekció beadása után feláldoztuk.

A PTH kezeléshez a 12–13 hetes hím C57BL/6N egereket szubkután 80 μg/testtömeg-kg 1–34-es humán PTH-fragmentummal (hPTH1–34) (Sigma P3796) injektáltuk 0,9% -os NaCl-ban vagy 0,9% -os NaCl-ban. és 2 órával az injekció után feláldoztunk. Az alkalmazott dózist és alkalmazási módot az irodalom határozza meg (Kramer, Loots, Studer, Keller és Kneissel, 2010).

Az ösztradiol-kezeléshez a 16 hetes hím C57BL/6N egerek naponta egy szubkután injekciót kaptak 15 μg 17β ‐ ösztradiolból (Sigma E8875) 0,1% (v/v) 0,1% -os etanolban 0,9% -os NaCl-ban öt egymást követő napon át, és 4 órával később feláldoztuk az utolsó injekció. A testtömegenkénti dózist és a gyógyszer alkalmazási módját az irodalomból származtatták, amint azt Van Abel és mtsai. (2002) Trpv5 expressziójának indukálására. A kontroll egereket szubkután injektáltuk 0,1% etanollal 0,9% NaCl-ban 5 napig.

2.5. Egér boncolása

Az eutanázia érdekében az egereket intraperitoneálisan 0,1 mg/gBW ketaminnal (Ketanarkon 100 Vet., Streuli) és 0,02 mg/gBW xilazinnal (Rompun, Bayer) injektálták, majd végső exangmentációt végeztek orbitális szúrással teljes érzéstelenítésben és/vagy nyaki nyakon. elmozdulás. A szerveket összegyűjtöttük, a veséket kettévágtuk, és a szerveket azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd további felhasználásig -80 ° C-on tároltuk.

2.6. RNS extrakció

Az RNS-t TRI reagenssel (Applied Biosystems by Life Technologies) extraháltuk a gyártó utasításai szerint. Az RNS-pelleteket szárítottuk és RNáz-mentes H2O-ban oldottuk. Az RNS-koncentrációt fotometrikusan mértük NanoDrop (NanoDrop 2000, Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával. Megvizsgáltuk az RNS A260/A280 arányát, és mindegyik RNS mintát 1% -os agaróz gélen tettük láthatóvá.

Az RNS-t reverz átírással cDNS-be írtuk át a PrimeScript RT reakciókészlet (Takara Bio Inc) segítségével. Mintánként az RNS bemeneti mennyisége 1-2 μg csont esetében, 500 ng vese esetén vagy 1 μg MLO ‐ Y4 RNS volt. A kapott cDNS-keveréket a szövet típusától függően 2–12x hígítottuk.

2.7. qPCR

A kvantitatív génátirat expressziós elemzéshez 2 μl cDNS-t használtunk a SYBR Green qPCR-hez (Applied Biosystems by Life Technologies) egy 7500 Fast gépen (Applied Biosystems). A mintákat három példányban futtattuk 20 μL össztérfogatban minden gén esetében, és normalizáláshoz aktint vagy GAPDH-t használtunk. Minden menethez olvadási görbéket kaptunk. A program beállításai: 95 ° C 20 másodperc alatt, 40 ciklus (95 ° C 3 s, 60 ° C 30 s), és az olvadási görbe szakaszában: 95 ° C 15 s, 60 ° C 1 perc, emelkedés 1% -os rámpánál sebessége 95 ° C-ra (15 s) és 60 ° C-ra 15 s. Az adatokat delta-delta CT módszerrel elemeztük. A primereket a Microsynth-től (Svájc) rendeltük, és a szekvenciákat az 1. táblázat mutatja. Az összes amplifikált terméket agaróz géleken tettük láthatóvá.

Asztal 1

A qPCR-hez használt alapozók

Oligonukleotid5'-szekvencia-3 '

Memo1 tovább	GCTGCCCATGCTTACAAACAA
Memo1 fordítva	AGAGTGCACATCGAGACAGG
Rankl előre	GTCTGTAGGTACGCTTCCCG
Rankl fordítva	CATTTGCACACCTCACCATCAAT
Bglap előre	CCGCCTACAAACGCATCTATG
Bglap hátra	GCTGCTGTGACATCCATACTTG
Phex előre	GTGCATCTACCAACCAGATACG
Phex fordított	TCTGTTCCCCAAAAGAAAGG
Slc34a3 előre	CCTACCCCCTCTTCTTGGGT
Slc34a3 hátramenet	AGAGCAACCTGAACTGCGAA
F3 előre	ACCTGGGCCTATGAAGCAAA
F3 hátra	GTTGGTCTCCGTCTCCATGAA
Cyp27b1 előre	ATGTTTGCCTTTGCCCAGA
Cyp27b1 fordított	GACGGCATATCCTCCTCAGG,
Cyp24a1 előre	GAAGATGTGAGGAATATGCCCTATTT
Cyp24a1 fordított	CCGAGTTGTGAATGGCACACT
béta-aktin előre	GTCCACCTTCCAGCAGATGT
béta-aktin fordított	AGTCCGCCTAGAAGCACTTGC

2.8. Adatelemzés

A humán Memo1 promóter szekvenciákat in silico elemeztük az UCSC Genome Browser és a Serial Cloner 2.6.1 alkalmazásával.

Két független csoporttal végzett kísérletek adatait t teszttel vagy Mann – Whitney U teszttel elemeztük. Három csoport összehasonlításához Kruskal – Wallis tesztet alkalmaztunk Bonferroni Multiple Comparison utótesztjével. Az összes statisztikai elemzést a GraphPad PRISM 5.03 alkalmazásával végeztük. Kétoldalas p 1). Először ismert D-vitamin-függő átiratokat értékeltek. A D-vitamint inaktiváló hidroxilázt kódoló Cyp24a1 (1a. Ábra) és a Rankl oszteoklaszt-szabályozó (1c. Ábra) átiratait 1,25 (OH) 2-D3-vitamin kezeléssel növelték, míg az FGF23 Phex szabályozó és a csontból származó hormon expressziója az osteocalcin/csont gamma-karboxi-glutamát (Bglap) mennyisége csökkent (1. b, d ábra). A Memo1 átiratok 20% -kal csökkentek 1,25 (OH) 2-D3-vitamin kezeléssel (1e. Ábra).