A vese és a csont Memo1 gén expresszióját az étrendi ásványi anyag terhelés és a kalciotrop hormonok nem befolyásolják

Absztrakt

A sejtmotilitás mediátora 1 (MEMO1) a növekedési faktorokra adott sejtválaszok mindenütt expresszált modulátora, beleértve az FGF23 jelátvitelt, és a Memo1-hiányos egereknek vannak fenotípusos tulajdonságai az Fgf23- vagy Klotho-hiányos egérmodellekkel. Itt teszteltük, hogy a Memo1 gén expresszióját kalciotrop hormonok szabályozzák-e, vagy megváltoztatják-e az étrendi ásványi anyag terhelést.

Az MLO-Y4 oszteocita-szerű sejteket tenyésztettük és 1,25 (OH) 2-D3-vitaminnal kezeltük. A C57BL/6N vad típusú egereken 1,25 (OH) 2-D3-vitamint, mellékpajzsmirigy-hormont (PTH), 17β-ösztradiolt vagy vivőanyagot kezeltek. A C57BL/6N egerek egyéb kohorszait kalcium- vagy foszfáttartalmú étrendekkel etették. A Memo1 és a kontroll gének expresszióját qPCR segítségével értékeltük.

Az 1,25 (OH) 2-D3-vitamin akutan csökkentette a Memo1 transzkriptum szintjét in vitro, de nem in vivo. A tesztelt hormonok egyike sem volt hatással a Memo1 transzkriptumokra, míg a vizsgált kontroll gének a várt módon reagáltak. A kalciummal és foszfáttal végzett diétás beavatkozások nem befolyásolták a Memo1 transzkriptumokat, de megváltoztatták a választott kontroll gének expresszióját.

Megfigyeltük, hogy a Memo1-et nem szabályozták kalciotrop hormonok vagy az ásványi anyag terhelésének változása, ami jelentős különbségekre utal Klotho, Fgf23 és Memo1 szabályozása és fiziológiai szerepe között.

Bevezetés

A Memo1 egy evolúciósan konzervált fehérje az élet minden országában, amely intracelluláris expressziót mutatott a citoplazmában és a magban (Schlatter és mtsai, 2012, Haenzi és mtsai, 2014, Moor MB, 2018). Feltételes és indukálható knockout egérmodell, a Memo1 gén 2 exonjának postnatalis deléciójával korai öregedési szindrómát eredményezett, emelkedett kalcémiával, megemelkedett FGF23-mal, inzulin túlérzékenységgel és csontbetegséggel (Haenzi et al., 2014, Moor, 2018). Ezek a tulajdonságok részleges átfedésben vannak a KLOTHO-ban (Kuro-o és mtsai., 1997) vagy az FGF23-ban (Shimada és mtsai., 2004) hiányos egérmodellekkel, amelyek két olyan fehérjét mutatnak be, amelyek óriási mértékben átalakították a kalcium- és foszfát-anyagcsere szabályozásával kapcsolatos megértésünket. a belek, a vese és a csont (Hu és mtsai., 2013, Moor és Bonny, 2016).

Ezenkívül az adaptív fehérjék ko-lokalizációját és foszforilációs állapotát vizsgáló sejttenyésztési kísérletekből származó bizonyítékok arra utalnak, hogy a MEMO1 fehérje részt vesz és modulálja az FGF23 és az FGFR bevonatú jelátviteli kaszkádot (Haenzi és mtsai, 2014).

A Klotho és Fgf23-hiányos egerek szérumanalízisei túlzott 1,25 (OH) 2-D3-vitamin-szintet mutattak, ezt a megállapítást a memo1-hiányos egerekben a genetikai háttér függvényében változóan találták (Haenzi et al., 2014, Moor, 2018). Az Fgf23 és a Klotho promóterei egyaránt tartalmaznak D-vitamin-válasz elemeket (Forster et al., 2011, Orfanidou et al., 2012). Az FGF23 szekrécióját a mellékpajzsmirigy hormon (PTH) (Lavi-Moshayoff et al., 2010) és a 17β-ösztradiol (Carrillo-Lopez et al., 2009) növeli. A Memo1 szabályozását illetően a patkány tobozmirigyeinek transzkripptikus elemzése a kontrollokhoz képest megnövekedett Memo1 transzkriptumokat mutatott fel szintetikus ösztrogénkezeléssel (Deffenbacher, 2006), kiemelve a Memo1 gén transzkripciójának lehetséges endokrin szabályozását. Itt tehát azt a hipotézist teszteltük, hogy a Memo1 expressziója ásványi anyagokkal vagy kalcitrópiás ingerekkel szabályozható.

Mód

Sejtkultúra

Az egér hosszú csontos oszteocita-Y4 sejtvonalát (MLO-Y4) Lynda Bonewald (Kato és mtsai, 1997) biztosította. Az MLO-Y4 sejteket minimális esszenciális táptalajban, alfa-módosított, alfa-MEM-ben (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) tartottuk fenn, amely 2,5% hő-inaktivált borjúszérumot (Sigma), 2,5% hő-inaktivált magzatot tartalmaz szarvasmarha szérum (Sigma) és 1% penicillin/sztreptomicin (Invitrogen by Life Technologies). A szérum hőinaktiválást 30 percig 56 ° C-os vízfürdőben végeztük. A sejteket patkányfarkú I. típusú kollagénnel tenyésztettük (Invitrogen by Life Technologies). A D-vitamin stimulálásához a sejteket szérummentes tápközegben tartottuk, amelyet 10 nM 1,25 (OH) 2-D3-vitaminnal (Sigma) vagy etanol hordozóval egészítettünk ki 24 órán át.

Állatkísérletek

A C57BL/6N egereket Janvier-től (Le Genest-Saint-Isle, Franciaország) szereztük be. Az egereket hagyományos állattartó létesítményben tartották, ketrecenként legfeljebb 6 állattal, és standard laboratóriumi chow-val etették őket (Kliba Nafnag TS3242; kalcium 1%, foszfor 0,65%, magnézium 0,23%, D-vitamin 1600 NE/kg, A-vitamin 27000 NE/kg, E-vitamin 150 mg/kg, fehérje 18,8%, nyers zsír 5,6%, nyersrost 3,5%, lizin 1,1%; KLIBA Kaiseraugst, Svájc), hacsak másképp nincs meghatározva, és 12/12 (kísérleti) vagy 14/10 (tenyész) világos-sötét ciklus. Minden állatkísérleti protokollt a Canton de Vaud, Svájc Állami Állategészségügyi Szolgálata hagyott jóvá. Az összes egérvizsgálat során a mintanagyságokat figyelembe vettük laboratóriumunk korábbi eredményei alapján.

Diétás beavatkozások

Az ásványi anyagcsere tanulmányozásához speciálisan tervezett étrendeket és hormonokat használtak. Kalcium-diétás kísérleteket állapotonként 5 hím C57BL/6N egérrel végeztünk háziketrecükben, mind 12 hetesek. Az egereket véletlenszerűen kiosztottuk úgy, hogy 7 nap alatt 0,17% (alacsony kalciumtartalmú étrend), 0,82% (normál kalciumtartalmú étrend) vagy 1,69% (magas kalciumtartalmú étrend) vagy 1,69% (magas kalciumtartalmú étrend) vagy 1,69% (magas kalciumtartalmú étrend) (KLIBA, 2222) tápanyagát etessük 7 nap alatt. Valamennyi kalcium-étrend 0,8% foszfort, A-vitamint 4000 NE/kg, D-vitamint 1000 NE/kg, E-vitamint 100 mg/kg, fehérjét 18%, nyerszsírt 7%, lizint 14g/kg tartalmazott (Kliba, 2222). A foszfát diétás kihíváshoz 3, 5, 13-14 hetes hím C57BL/6N egérből álló csoportot tartottak metabolikus ketrecekben, és véletlenszerűen kiosztották őket alacsony (0,2%), köztes (0,8%) vagy magas (1,5) diétákkal való tápláláshoz. %) foszfáttartalom 7 nap alatt. A foszfát diéták a KLIBA 2222 diéta módosításai voltak (kalcium 1,2%, A-vitamin 4000 NE/kg, D-vitamin 1000 NE/kg, E-vitamin 100 mg/kg, fehérje 18%, nyers zsír 7%, lizin 14g/kg).

Hormoninjekciók

Minden hormoninjekciót az egerek otthoni ketrecében hajtottunk végre, az egyedi füljelölt egerek véletlenszerű kezelése után. 1,25 (OH) 2-D3-vitamin kezeléshez 13-15 hetes hím C57BL/6N egereket szubkután 2 μg/testtömeg-kg 1,25 (OH) 2-D3-vitamint (Sigma D1530) injektáltunk etanolban 1 % NaCl-ban 0,9%. Az adag és az alkalmazás módja megegyezett a laboratóriumunkban korábban alkalmazott módszerrel. A kontroll egereket 1% (v/v) etanollal injektáltuk 0,9% NaCl-ban. Az egereket az injekció beadása után 6 órával feláldoztuk.

A mellékpajzsmirigy hormon kezelésére a 12-13 hetes hím C57BL/6N egereket szubkután 80 μg/testtömeg-kg humán PTH 1-34 fragmentummal (hPTH1-34) (Sigma P3796) injektálták 0,9% -os NaCl-ban vagy 0,9% -os NaCl-ban. vivőanyagot és az injekció beadása után 2 órával feláldoztuk. Az alkalmazott dózist és alkalmazási módot az irodalom határozta meg (Kramer et al., 2010).

Ösztradiolkezeléshez a 16 hetes hím C57BL/6N egerek naponta 1 szubkután injekciót kaptak 15 μg 17β-ösztradiolt (Sigma E8875) 0,1% -os (v/v) etanolban 0,9% -os NaCl-ban 5 egymást követő napon keresztül, és az utolsó 4 órával leölték őket. injekció. A testtömegenkénti dózist és a gyógyszer alkalmazási módját az irodalomból származtatták, amint azt Abel és mtsai. a Trpv5 expressziójának kiváltására (Van Abel et al., 2002). A kontroll egereket szubkután injektáltuk 0,1% etanollal 0,9% NaCl-ban 5 napig.

Egér boncolása

Az eutanázia érdekében az egereket intraperitoneálisan 0,1 mg/gBW ketaminnal (Ketanarkon 100 Vet., Streuli) és 0,02 mg/gBW xilazinnal (Rompun, Bayer) injektálták, majd végső exangmentációt végeztek orbitális szúrással teljes érzéstelenítésben és/vagy nyaki nyakon. elmozdulás. A szerveket összegyűjtöttük, a veséket kettévágtuk, és a szerveket azonnal folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd további felhasználásig -80 ° C-on tároltuk.

RNS extrakció

Az RNS-t TRI reagenssel (Applied Biosystems by Life Technologies) extraháltuk a gyártó utasításai szerint. Az RNS-pelleteket szárítottuk és RNáz-mentes vízben oldottuk. Az RNS-koncentrációt fotometrikusan mértük Nanodrop (Nanodrop 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) alkalmazásával. Megvizsgáltuk az RNS A260/A280 arányát, és mindegyik RNS mintát 1% -os agaróz gélen tettük láthatóvá. Az RNS-t reverz átírással cDNS-be írtuk át a PrimeScript RT reakciókészlettel (Takara Bio Inc, Otsu, Japán). Mintánként az RNS bemeneti mennyisége 1-2 μg volt a csontnál, 500 ng a vese vagy 1 μg MLO-Y4 RNS esetében. A kapott cDNS-keveréket a szövet típusától függően 2-12x hígítottuk.

A kvantitatív génátirat expressziós elemzéshez 2 ui cDNS-t használtunk a SYBR Green qPCR-hez (Applied Biosystems by Life Technologies) egy 7500 Fast gépen (Applied Biosystems). A mintákat triplikátokban futtattuk minden egyes gén 20 ul teljes térfogatában, és normalizáláshoz aktint vagy GAPDH-t használtunk. Minden menethez olvadási görbéket kaptunk. A program beállításai a következők voltak: 95 ° C 20 másodperc alatt, 40 ciklus (95 ° C 3 sec, 60 ° C 30 sec), és az olvadási görbe szakaszában: 95 ° C 15 másodperc, 60 ° C 1 perc, 1% -os rámpás sebességgel emelkedve 95 ° C (15 mp), 60 ° C 15 mp. Az adatokat delta-delta CT módszerrel elemeztük. A primereket a Microsynth-től (Svájc) rendeltük, és a szekvenciákat az 1. táblázat mutatja. Valamennyi amplifikált terméket agaróz géleken vizualizáltuk.