Az étrendi kapszaicin és az antibiotikumok szinergikusan csökkentik az egerekben a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott alkoholmentes zsírmáj betegségeket

Jingjuan Hu

1 Szervi kudarckutatás állami kulcs laboratóriuma, Guangdongi Tartományi Proteomikai Fő Laboratórium, Kórélettani Tanszék, Southern Medical University, GuangZhou, Kína

Haihua Luo

1 Szervi kudarckutatás állami kulcs laboratóriuma, Guangdongi Tartományi Proteomikai Fő Laboratórium, Kórélettani Tanszék, Southern Medical University, GuangZhou, Kína

Yong Jiang

1 Szervi kudarckutatás állami kulcs laboratóriuma, Guangdongi Tartományi Proteomikai Fő Laboratórium, Kórélettani Tanszék, Southern Medical University, GuangZhou, Kína

Peng Chen

1 Szervi kudarckutatás állami kulcs laboratóriuma, Guangdongi Tartományi Proteomikai Fő Laboratórium, Kórélettani Tanszék, Southern Medical University, GuangZhou, Kína

Absztrakt

Az alkoholmentes zsírmájbetegségek gyakorisága világszerte gyorsan növekszik. A magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott elhízás, zsírmáj és anyagcsere-rendellenesség leküzdésére irányuló hatékony stratégiák azonban még mindig korlátozottak, és az eredmények továbbra is gyengék. Jelen tanulmányban az étrendi kapszaicin és az antibiotikumok együttes hatásait értékeltük egerek HFD által kiváltott fiziológiai rendellenességeivel szemben. A C57BL/6 hím egereket HFD-vel (60% kalória zsírból) tápláltuk 17 hétig, és megvizsgáltuk az ebből eredő patofiziológiai hatásokat. Az antibiotikum-kezelés jelentősen gyengítette a bélgyulladást és a HFD által kiváltott szivárgást, míg a kapszaicin korlátozott hatást mutatott a bélre. Az étrendi kapszaicin azonban szignifikánsan növelte a PPAR-α expresszióját a zsírszövetben, míg az antibiotikumok nem gyakoroltak ilyen hatást. A kapszaicin és az antibiotikumok kombinációjával kezelt állatok testtömeg-növekedése és zsírpárnájának indexe a legkisebb volt, valamint a legkisebb a máj zsírfelhalmozódása. A kombinált kezelés az inzulin tolerancia tesztjeivel is maximálisan javította az inzulin reakciókészségét. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a kapszaicin és az antibiotikumok együttes kezelése, egy új kombinációs stratégia, szinergikusan játszaná a HFD által kiváltott elhízás, zsírmáj és anyagcserezavar csökkentését.

BEVEZETÉS

A hosszú távú zsírterhelés okozta alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) előfordulása világszerte gyorsan növekszik, és súlyos egészségügyi és gazdasági terhet jelentett [1–2]. A betegség megfékezésére szolgáló hagyományos kezelések bonyolult patogenezise miatt nem voltak sikeresek [3]. A HFD által kiváltott NAFLD progressziója többszerves interakciót foglal magában, amelynek két fő célpontja a bél és a fehér zsírszövet [4–5]. A HFD bél rendellenességeket eredményez, mint például gyulladás, dysbiosis és szivárgás. Úgy gondolják, hogy ezek a hatások együttesen további zsírmáj- és zsírszövetkárosodást okoznak, és elősegítik az elhízást és a cukorbetegséget [6–8]. A bél mikrobiota kimerülése a HFD által kiváltott elhízást és cukorbetegséget csillapítja [9–10]. Másrészt a fehér zsírszövet státus szintén fontos szerepet játszik az elhízás előrehaladásában [11]. A kulcsgének, például a PPAR-k fokozott expressziója elősegíti a fehér zsírszövet barnulását és csökkenti a HFD által kiváltott rendellenességeket [12–13].

A kapszaicin, a chili paprika természetes előfordulású aktív összetevője kimutatott elhízásellenes hatást fejt ki. A legújabb jelentések azt mutatják, hogy a kapszaicin csökkentette a HFD által kiváltott testtömeg-növekedést, a máj lipidfelhalmozódását és az inzulinrezisztenciát [14–15]. A zsírszövet lehet a kapszaicin fő célpontja. A fenti megfigyelések alapján úgy döntöttünk, hogy teszteljük, hogy a kapszaicin és az antibiotikumok együttes kezelése jótékony hatással van-e mind a bél-, mind a zsírszövetre a HFD során.

EREDMÉNYEK

A HFD megváltoztatta a TRPV1 expresszióját a perigonadalis visceralis zsírszövetben

Beszámoltak arról, hogy a HFD csökkenti a TRPV1 expresszióját a zsigeri zsírszövetben [16]. Megvizsgáltuk a TRPV1 expresszióját, amely a kapszaicin [17–18] receptoraként szolgál a zsírszövetben, hogy megerősítsék ezek összefüggését. A TRPV1 mRNS (ábra (1A ábra) 1A) és a fehérje (1B ábra) 1B) szintje drámaian csökkent a krónikus HFD után a perigonadalis visceralis zsírszövetben. Adataink megerősítették, hogy a kapszaicinnel társult útvonal befolyásolhatja a HFD által kiváltott rendellenességeket.

A C57BL/6 hím egereket normál chow-étrenddel (n = 6) vagy magas zsírtartalmú diétával (n = 10) etették 17 hétig. A. A Trpv1 mRNS szintjét a perigonadalis visceralis zsírszövetben detektáltuk. B. A TRPV1 immunhisztokémiai festése. Méretarány, 100 μm. Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. * p (2A ábra). (2A. Ábra). A bélben lévő baktériumösszetétel további feltárása érdekében 16S szekvenálást végeztünk a DNS-nek a vakbéltartalom alapján. Amint az a 2B., 2B. Ábrán látható, az alfa diverzitás értékei, amelyeket PD egész fa, Shannon és Megfigyelt fajok képviselnek, mind a HFD után nőttek az NC-hez képest. Ezenkívül az Actinobacteria, Bacteroidia és Verrucomicrobiae százalékos aránya szintén jelentősen megváltozott a HFD egerekben (ábra (2C ábra). 2C). A súlyozatlan és a súlyozott főkomponens-elemzés (PCoA) során kiderült, hogy az NC és a HFD klaszterek teljesen szétválaszthatók (ábra (2D ábra). 2D). Ezek az adatok megerősítették, hogy a HFD megzavarhatja az enterális eubiosist.

A C57BL/6 hím egereket normál chow-diétával (n = 5) vagy magas zsírtartalmú étrenddel (n = 7) etették 17 hétig. A. a baktériumok teljes terhelése a vakbélben; B. a PD teljes fa értéke, a Shannon és a megfigyelt fajok sokfélesége; C. a megjelölt osztály százalékos aránya; D. a PCoA elemzés. Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. * p 3A-3B megerősítette, hogy a kapszaicin hatással lehet a bél mikrobiotájára, amit a HFD és a kapszaicinnel kezelt egerek cecumában a HFD egerekhez viszonyítva csökkent Firmicutes, megnövekedett Bacteroidetes és károsodott Firmicutes/Bacteroidetes arány bizonyít. Annak tesztelésére, hogy a kapszaicin által kiváltott mikrobiota fiziológiás hatást mutat-e, HFD + Cap táplált egerek ürülékét ültettük át HFD-vel táplált egerekbe, és figyeltük a testtömeg változását. A 3C. Ábra mutatja, hogy a HFD + CAP-al táplált egerek ürüléke nem képes csökkenteni a magas zsírtartalmú étrend okozta testtömeg-növekedést. Ez az eredmény arra utalt, hogy bár a kapszaicin a bél mikrobiális összetételének változását okozhatja, az ilyen változás nem mutathat fiziológiai funkciókat.

A C57BL/6 hím egereket normál chow-diétával (n = 5) vagy magas zsírtartalmú étrenddel (n = 5-9) etették. A. a Firmicutes, Bacteroidetes és B. Firmicutes/Bacteroidetes arány a vakbélben; C. Testtömeg-növekedés 12 hetes HFD-etetés után. Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. * p (3A. ábra). Ábra). A kulcsfontosságú citokinek/kemokinek, például a Tnfa, az Ifng és a Ccl4 expressziójával jellemzett bélgyulladás drámai mértékben csökkent mind a HFD + ABX, mind a HFD + Cap + ABX csoportokban, míg a kapszaicin nem befolyásolta ezen gyulladásos tényezők expresszióját ( Ábra: 4A). Megmértük továbbá a gyulladásos válaszban részt vevő kulcsmolekulák, a Tlrs (Tlr2, Tlr4), a MAPK (p-38) és a CD-k (Cd2 és Cd68) szintjét. A Tlr4 szignifikánsan csökkent azokban a HFD-vel etetett állatokban, amelyeket Cap + ABX-vel kezeltek, de nem azoknál az állatoknál, amelyeket csak antibiotikumokkal vagy kapsaicinnel kezeltek. A Tlr2 és a Cd68 csökkenő tendenciát mutatott mind a HFD + ABX, mind a HFD + Cap + ABX csoportokban, de a HFD + Cap egerekben nem. Az antibiotikumok vagy a kapszaicin önmagában csökkentette a Cd2 és p-p38 expresszióját, míg az együttes kezelés tovább csökkentette ezen molekulák expresszióját (4B-4D. Ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az antibiotikumok jelentősen csökkentették a bélgyulladást, míg a kapszaicin előnyei korlátozottak voltak.

A C57BL/6 hím egereket 5 csoportra osztottuk: NC (n = 6); HFD (n = 10); HFD + ABX (n = 10); HFD + sapka (n = 6); HFD + ABX + sapka (n = 6). A. Széklet albumin tartalma; B. Claudin2 fehérje szintje az ileumban. Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. * p A 6A, 6A, Ppara, Pparg, Ppargc1a és Ppard ábrák mind növekvő tendenciát mutatnak a HFD + Cap csoportban a HFD egerekhez képest. Azonban csak a PPARα mRNS szintjének növekedése érte el a statisztikai szignifikanciát. Az immunhisztokémiai adatok megerősítették a génexpresszió eredményét (ábra (6B ábra). 6B). A két PPARα célgén, a Cpt2 és az Acadl szignifikánsan magasabb expressziót mutatott mind a HFD + Cap, mind a HFD + Cap + ABX csoportokban, mint a kezeletlen HFD egerekben, míg az ABX egyszeri beadása egyik gén expresszióját sem változtatta meg jelentősen (ábra (6C ábra) 6C). Eredményeink arra utalnak, hogy a kapszaicin, de nem az antibiotikumok, drámai módon indukálta a PPARα-t és a kapcsolódó célgén expressziót.

A C57BL/6 hím egereket 5 csoportra osztottuk: NC (n = 6); HFD (n = 10); HFD + ABX (n = 10); HFD + sapka (n = 6); HFD + ABX + sapka (n = 6). A. Pparg, Pparα, Ppargc1a és Ppard mRNS szintje a fehér zsírszövetben; B. PPARα immunhisztokémiai festés; C. Cpt2 és Acadl mRNS szint. Méretarány, 50 μm. Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. * p (7A. ábra). 7A). Megjegyezték, hogy az antibiotikumos kezelés előtt a HFD és a HFD + ABX egerek között nem volt különbség a testtömeg-növekedésben. A különbség az antibiotikumok beadására adott válaszként jelentkezett. Ezenkívül a HFD + Cap + ABX egerek mutatták a legkisebb testtömeg-növekedést az összes csoport közül. Az epididymális, a szubkután, a mesenterialis és a barna zsírszövet indexe jelentősen csökkent a HFD + ABX, HFD + Cap és HFD + Cap + ABX esetében a kezeletlen HFD egerekhez képest (ábra (7B ábra). 7B). Különösen a HFD + Cap + ABX mutatta a legalacsonyabb epididymális és szubkután zsír indexet; az epididymális zsírindex szignifikánsan alacsonyabb volt a HFD + Cap + ABX-nél, mint a HFD + ABX egereknél. Az epididymális zsírszövetre vonatkozó hematoxilin és eozin (HE) festés megerősítette a fenti eredményeket (ábra (7C ábra). 7C). Adataink egyértelműen bizonyítják, hogy a kapszaicin és az antibiotikumok szinergikusan csökkentik a HFD által kiváltott elhízást.

A C57BL/6 hím egereket 5 csoportra osztottuk: NC (n = 6); HFD (n = 10); HFD + ABX (n = 10); HFD + sapka (n = 6); HFD + ABX + sapka (n = 6). A. Testtömeg-növekedés; B. Az epididymális (Epi), a szubkután (Sub), a mesenterialis (Mes) fehér zsíros és a barna zsírszövet indexe (BAT); C. Az epididymális fehér zsírszövet HE festése. Méretarány, 100 μm. Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. * p # p $ p & p (8A. ábra). (8A. Ábra). Az antibiotikumok, valamint a kapszaicin azonban jelentősen csökkentette a triglicerid felhalmozódását a májban. A koleszterinszintet sem az antibiotikumok, sem a kapszaicin önmagában nem változtatta meg drámai módon. Érdekes, hogy a HFD + Cap + ABX májából minden csoportban a legalacsonyabb a triglicerid és koleszterinszint (ábra (8B ábra). 8B). Olajvörös O festés a májban megerősítette a máj triglicerid adatait (ábra (8C. Ábra). 8C). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a kapszaicin és az antibiotikumok együttes kezelése maximálisan javíthatja a HFD által okozott zsírmájat.

A C57BL/6 hím egereket 5 csoportra osztottuk: NC (n = 6); HFD (n = 10); HFD + ABX (n = 10); HFD + sapka (n = 6); HFD + ABX + sapka (n = 6). A. Plazma triglicerid és koleszterin szint; B. Máj triglicerid és koleszterin szint; C. Olajpiros májfestés. Méretarány, 100 μm. Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. * p (9A. ábra). (9A. Ábra). Ennek megfelelően a kezeletlen HFD egerek az összes csoport esetében a legrosszabb reakciót mutatták az inzulinra (ábra (9B ábra). 9B). Különösen az antibiotikumokkal és a kapszaicinnel kezelt egerek mutatták ki a legnagyobb reakcióképességet az inzulinra az összes csoport között. Az inzulinrezisztenciát az jellemzi, hogy az inzulin nem képes elnyomni a glükoneogén gének expresszióját, amelyet főleg az Akt jelátviteli út közvetített [26]. A p-Akt/Akt arány a perigonadalis visceralis zsírszövetben magasabb volt a HFD + Cap + ABX egerekben, mint a HFD egerekben (ábra (9C. ábra). 9C). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az antibiotikumok és a kapszaicin együttes alkalmazása a HFD által kiváltott inzulinrezisztencia legjobb javulását eredményezi.

A C57BL/6 hím egereket 5 csoportra osztottuk: NC (n = 6); HFD (n = 10); HFD + ABX (n = 10); HFD + sapka (n = 6); HFD + ABX + sapka (n = 6). A. GTT (intraperitoneális) és az egyes csoportok görbe alatti területe (AUC); B. Az egyes csoportok ITT (intraperitoneális) és görbe alatti területe (AUC). C. p-Akt, Akt fehérje szintek a perigonadalis zsigeri zsírszövetben. Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. * p # p $ p # p + p első hét. A GTT-t és az ITT-t 2-3 héttel az áldozat előtt elvégeztük. A GTT kísérlethez az egereket 16 órán keresztül éheztettük, és 1 g/kg glükózt adtunk i.p. A vércukor-koncentrációt 0 perc, 30 perc, 60 perc, 90 perc és 120 perc alatt mértük. Az ITT-kísérlethez az egereket 6 órán át éheztettük, és 0,35 U/kg inzulint adtunk i.p. A vércukor-koncentrációt 0 perc, 30 perc, 60 perc, 90 perc és 120 perc alatt mértük. Valamennyi egér szabadon hozzáférhetett az élelemhez és a vízhez, és egy hőmérséklet-szabályozott telephelyen tartottuk 12: 12 órás világos/sötét ciklus alatt. Minden kísérleti eljárás összhangban volt az Országos Egészségügyi Intézet irányelveivel, és a Déli Orvostudományi Egyetem helyi állatgondozási és felhasználási bizottsága jóváhagyta.

Mikrobanalízis

A vakbéltartalmat újraszuszpendálták 0,5% Tween 20-ot tartalmazó PBS-ben, majd háromszor -80 ° C/60 ° C ciklusnak vetették alá a membrán elpusztítása érdekében. A DNS-extrakciót és a vakbél baktériumok teljes terhelését tovább elemeztük a leírtak szerint [45]. Kvantitatív valós idejű PCR-t végeztünk 16s rRNS primerek alkalmazásával: 5′-GTGSTGCAYGGYTGTCGTCA-3 ’; 5′- ACGTCRTCCMCACCTTCCTC-3 ’; Firmicutes primerek: 5′-GGAGYATGTGGTTTAATTCGA -3 ′; 5'-AGCTGACGACAACCATGCAC-3 '; Bacteroidetes primerek: 5'-GGCGACCGGCGCACGGG -3 '; 5′-GRCCTTCCTCTCAGAACCC-3 ′. Mikrobiális diverzitás elemzést végeztek [46]. Röviden: először a 16S rRNS gén V4 régióját amplifikáltuk PCR-rel és az Ion Torrent szekvenálási platform segítségével a további szekvenáláshoz. A nyers szekvenciákat minőség-ellenőrzéssel QIIME (1.9.1) alkalmazásával kontrolláltuk. Ezután a szekvenciákat demultiplexeltük és fajszintű (97% -os hasonlóság) operatív taxonómiai egységekbe (OTU-k) csoportosítottuk. Végül a törzsösszetétel-elemzést, az alfa-diverzitás-elemzést és a béta-diverzitás-elemzést a QIIME is elvégezte. A diszkriminatív taxonok meghatározásához a LEfSe-t (LDA effektusméret, http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/) használtuk.

Valós idejű PCR

A teljes RNS-t Trizol alkalmazásával extraháltuk a gyártó utasításai szerint. A reverz transzkripciós reakciót reverz transzkriptázzal (TOYOBO) hajtjuk végre a gyártó utasításainak megfelelően. A valós idejű PCR-reakciót ABI 7500 valós idejű PCR-rendszeren hajtottuk végre, 1x SYBR Green PCR master mixet (TOYOBO) tartalmazó cDNS-mintával, az NIH qPrimerDepot-tól kapott primer szekvenciákat használva. A 18s rRNS-hez viszonyított relatív expressziót összehasonlító CT módszerrel számoltuk.

Szövettani elemzés

A szöveteket összegyűjtöttük és 10% pufferolt formalinban rögzítettük. A mintát ezután paraffinba ágyazva 5 μm vastag szakaszokra szeleteltük. Hematoxilin és eozin (HE) festést végeztünk és mikroszkóppal elemeztünk. Az immunhisztokémiát a PPARα és a TRPV1 primer antitestjeivel (Proteintech) végeztük. Fagyasztott szakaszokat (8μm) használtunk az olajvörös O festéshez.

Fehérje elemzés és biokémiai elemzés

A szövetfehérjét kereskedelmi lízispufferrel (KeyGene) extraháltuk. Western-blotot végeztünk a Claudin-2 (Invitrogen), p-p38 (Bioworld technológia), p-AKT, AKT (ABcolonal), β-Actin (Proteintech) elsődleges antitestjeivel. A széklet albumint ELISA-val (Bethyl Labs) határoztuk meg. A triglicerideket és a koleszterin koncentrációkat az automatikus biomedicinális analizátorral (Roche) mértük kereskedelmi készlet segítségével.

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. Kétirányú ANOVA-analízist, majd post-hoc-ot és kétfarkú t-tesztet alkalmaztunk a kapszaicin és az antibiotikumok adatainak elemzésére. Az NC egerek és a HFD egerek közötti változó különbség elemzéséhez kétfarkú, nem párosított Student t tesztet alkalmaztunk. A 0,05-nél kisebb p-értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Lábjegyzetek

ÖSSZEFÉRHETETLENSÉG

A szerzők nem jelentenek összeférhetetlenséget.

PÉNZÜGYI TÁMOGATÁS

Ezt a tanulmányt részben a Déli Orvostudományi Egyetem Startup Alapítványa, a Kínai Nemzeti Tudományos Alapítvány (31500952 támogatás) és a Guangdongi tartomány kiemelkedő fiatal tudósának Természettudományi Alapjai (2016A030306043) támogatták PC-re.