Európai tengeri sügér (Dicentrarchus labrax) Az arginin étrend-kiegészítés károsítja az immunállapotot és a betegségekkel szembeni ellenállást

Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental (CIIMAR), Universidade do Porto, Rua dos Bragas 289, 4050-123, Porto, Portugália, Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto (FCUP), 4169-007, Porto, Portugália

Társulási nutrigenomikai és halnövekedési endokrinológiai csoport, Akvakultúra Intézet Torre de la Sal, IATS-CSIC, 12595 Ribera de Cabanes, Castellón, Spanyolország

Társulási hal-patológiai csoport, Akvakultúra Intézet Torre de la Sal, IATS-CSIC, 12595 Ribera de Cabanes, Castellón, Spanyolország

Valencia Egyetem Biológiai Karának Mikrobiológiai és Ökológiai Tanszéke, Dr. Moliner 50, 46100 Burjassot, Valencia, Spanyolország

Társulás Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia Animal i Immunologia, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, Spanyolország

Központ Centro de Ciências do Mar, Universidade do Algarve, Campus de Gambelas, edf. 7, 8005-139, Faro, Portugália

Társulás Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental (CIIMAR), Universidade do Porto, Rua dos Bragas 289, 4050-123, Porto, Portugália

Rita Azeredo,
Jaume Pérez-Sánchez,
Ariadna Sitjà-Bobadilla,
Fouz Belén,
Lluis Tort,
Cláudia Aragão,
Aires Oliva-Teles,
Benjamín Costas

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Azeredo R, Pérez-Sánchez J, Sitjà-Bobadilla A, Fouz B, Tort L, Aragão C és mtsai. (2015) Európai tengeri sügér (Dicentrarchus labrax) immunállapota és betegség-ellenállása károsodik az arginin étrend-kiegészítéssel. PLoS ONE 10 (10): e0139967. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139967

Szerkesztő: Daniel Merrifield, a Plymouthi Egyetem, EGYESÜLT KIRÁLYSÁG

Fogadott: 2015. július 2 .; Elfogadott: 2015. szeptember 18 .; Közzétett: 2015. október 8

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: Ezt a munkát részben az Európai Unió hetedik keretprogramja, az AQUAEXCEL (Akvakultúra-infrastruktúrák az európai halkutatás területén, 262336. számú támogatási megállapodás), AQUAIMPROV (hivatkozási szám: NORTE-07-0124-FEDER-000038), PEst-C/MAR/LA0015 finanszírozta./2013 és UID/Multi/04423/2013. A projektet az Észak-Portugália Regionális Operatív Program (ON.2 - O Novo Norte) társfinanszírozta, a Nemzeti Stratégiai Referenciakeret keretében, az Európai Regionális Fejlesztési Alapon keresztül, valamint a COMPETE - Operatív Versenyképesség Program és nemzeti alapok révén a Fundação para a Ciência e Tecnologia, ill. Az RA-t és a BC-t a Fundação para a Ciência e Tecnologia támogatta (SFRH/BD/89457/2012 és SFRH/BPD/77210/2011 támogatások). További forrásokat nyert a Generalitat Valenciana a REVIDPAQUA (ISIC/2012/003) projekten keresztül.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az európai tengeri sügér (Dicentrarchus labrax) mediterrán akvakultúrájának legnagyobb kihívása az egész évben bekövetkezett súlyos bakteriális járvány [1]. Közülük a vibriózis okozza a legmagasabb halálozási arányt és ennek következtében nagy gazdasági veszteségeket. A Vibrio anguillarum a vibriózis fő etiológiai ágense, amely gyakran septicémiához, valamint vérzéshez és exophthalmiahoz vezet [2]. Vakcinázással történő immunizálást alkalmaztak [3], de az európai tengeri sügér sikeres és költséghatékony előállításához különálló és kiegészítő megközelítéseket javasolnak. A haltápok elkészítésénél az optimális növekedés elősegítése mellett a halak jólétével és egészségével kapcsolatos egyéb kérdésekkel is foglalkozni kell. A halak étrendjének kiegészítése kulcsfontosságú összetevőkkel az akvakultúrában gyakran alkalmazott stratégia egy kiválasztott tulajdonság javítása érdekében. Az ilyen étrendeket (funkcionális étrendeket) a halak védekezésének javítására és ezáltal a vírusos vagy baktériumos behatolási epizód során bekövetkező magas mortalitás elkerülésére is fel lehet használni. Vitaminokat, prebiotikumokat, probiotikumokat és pigmenteket, például xantofillokat és asztaxantinokat használtak kiegészítőként ezekhez az étrendekhez [4–6]. Újabban aminosavakat (AA) alkalmaztak az immunmoduláció vizsgálatában [7–9], de ilyen ismeretek még mindig kevések.

Bár tisztában van az arginin, mint a növekedés elengedhetetlen alkotóelemének nagy jelentőségével, nagy jelentőségű lenne az arginin immunmodulációs mechanizmusainak teljes meghatározása. Ezért ennek a tanulmánynak a célja annak megfejtése, hogy az étrendi arginin-kiegészítés milyen mértékben módosíthatja az európai tengeri sügér immunválaszát és a betegségekkel szembeni rezisztenciát a Vibrio anguillarum ellen.

Anyag és módszerek

2.1 Diéta megfogalmazás

Három növényi fehérjealapú étrendet csökkentett halliszt és halban oldódó fehérjekoncentrátumok (12,2%) befogadásával készítettek és gyártottak a Sparos Lda. (Olhão, Portugália). Halolaj (6,2%): repceolaj (4,2%): pálmaolaj (4,2%) keverékét használtuk étrendi lipidforrásként. A kontroll étrendet (CTRL) úgy alakítottuk ki, hogy tartalmazzon egy nélkülözhetetlen AA-koncentrációt, amely megfelel az európai tengeri sügér becsült ideális mintázatának [15]. A két másik étrend megegyezett a CTRL-lel, de 1% vagy 2% L-argininnel (Arg1 és Arg2) egészítették ki a búza glutén költségére. A fő összetevőket (250 μm alatt) egy mikrohullámú kalapácsmalomban (SH1; Hosokawa Micron, B.V., Doetinchem, Hollandia) őrölték. Ezután a porösszetevőket és olajokat a célkészítménynek megfelelően keverjük egy lapátkeverőben (RM90; Mainca, S. L., Granollers, Spanyolország). Valamennyi étrendet hőmérséklet-szabályozott extrudálással (pelletméret: 1,5 és 2 mm) állítottak elő kis nyíróerővel rendelkező extruderrel (P55; Italplast, S.r.l., Parma, Olaszország). Extrudálás után az összes adagot konvekciós kemencében (OP 750-UF; LTE Scientifics, Oldham, Egyesült Királyság) szárítottuk 4 órán át 45 ° C-on. A kísérleti étrendek összetételét és közelítő összetételét az 1. táblázat tartalmazza.

A diétákat az összes aminosav-tartalom szempontjából elemeztük. Az étrendmintákat 6 M sósavoldatban 116 ° C-on 2 órán át nitrogénnel átöblített üvegcsékben hidrolizáltuk. A mintákat ezután Waters AccQ Fluor Reagenssel (6-aminokinolil-N-hidroxi-szukcinimidil-karbamát) származtattuk az AccQ Tag módszerrel (Waters, USA). Az elemzéseket ultra-nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (UPLC) végeztük Waters fordított fázisú aminosav-elemző rendszerben, belső standardként norvalint használva. A savas hidrolízis során az aszparagin aszpartáttá és glutaminná alakul át glutamáttá, így ezeknek az aminosavaknak (Asx és Glx) a megadott értékei a megfelelő amin és sav összegét képviselik. A triptofánt nem határozták meg, mivel savhidrolízissel részben elpusztul. A kapott csúcsokat az EMPOWER szoftverrel (Waters, USA) elemeztük. A kísérleti étrend AA profilját a 2. táblázat mutatja be.

A Trp-t nem elemeztük. Az értékek átlag ± SD.

2.2 Hal

Valamennyi vizsgálatot az Instituto de Acuicultura Torre de la Sal (IATS-CSIC, Castellón, Spanyolország) beltéri kísérleti létesítményeiben hajtották végre. A 0,6 g kezdő testtömegű be nem oltott ujjbegyeket egy kereskedelmi keltetőből (Grupo Tinamenor, Santander, Spanyolország) vásároltuk, és két hónapnál hosszabb ideig akklimatizáltuk az IATS kísérleti létesítményeihez. A halakat ebben az időszakban (2014. március – június) etették CTRL-táplálékkal átfolyó rendszerben, szénsavas tengervízzel, természetes fotoperiódus alatt (12 óra világos/12 óra sötét) és hőmérsékleten (22,95 ° C ± 0,9). IATS-CSIC szélesség (40 ° 5N; 0 ° 10E). A vízparamétereket naponta ellenőriztük, az oxigénszint mindig magasabb volt, mint 85% -os telítettség, és az ionizált ammónia a toxikus szint alatt volt.

2.3 Etetési kísérlet és mintavétel

2.4. Bakteriális oltóanyag előkészítése és a dózis validálása

A megbetegedett európai tengeri sügértől izolált, Vibrio anguillarum O1 szerotípust (Lab 1 törzs) triptikus szója agarban (TSA, Pronadisa, Madrid, Spanyolország) NaCl-tal kiegészítve 1% végkoncentrációban (TSA-1) 24 ° C-on tenyésztettük. 24 órán át.

Nyolc különböző dózist teszteltünk egy provokáció előtti kísérletben annak érdekében, hogy érvényesítsük a bakteriális provokációhoz megfelelő fertőző dózist. A fiatal európai tengeri sügért, amelyet 90 literes tartályokban, 22,3 ° C átlagos hőmérsékleten tartottak, intracoelomikusan (ic) injektáltunk 0,1 ml baktériumszuszpenzióval foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS, pH 7,4) 4,7 × 103 3 és 1 között. × 10 6 telepképző egység (CFU) ml -1 (8-10 hal/adag) [16]. A negatív kontrollhalak 0,1 ml PBS-t kaptak. A mortalitást 8 napig figyeltük, és csak akkor vettük figyelembe a V. anguillarum miatt, ha az oltott baktériumot tiszta tenyészetben nyertük ki a belső szervekből. A halandó halakból gyűjtött vese- és májmintákat közvetlenül a TSA-1 lemezekre csíkoltuk. A kórokozó azonosításához csúszóagglutinációs tesztet alkalmaztunk a megfelelő antiplazmával. A baktériumok okozta kihívásokhoz 40 és 50% (LD40-50) közötti mortalitást okozó dózist választottak.

2.5 Bakteriális kihívás

Az első etetési periódus végén (15 nap) étrendi kezelésenként 40 halat enyhén altattunk szegfűszegolajjal (1: 10 000), majd az előzőleg meghatározott V. anguillarum dózissal fertőztük és három párhuzamos 90 l-es tartályokban (n = 10). Étrendi kezelésenként 10 halból álló csoportba injektáltunk PBS-t a kísérleti kezelés kontrolljaként. A halakat ugyanazon étrenddel etették a fertőzés utáni időszakban. A második baktériumfertőzést 29 nappal az etetési kísérlet megkezdése után hajtottuk végre, ugyanazzal az eljárással, mint az első provokációban. Mindkét kihívásnál a mortalitást naponta (kétóránként) ellenőriztük, amíg legalább két egymást követő napon nem észleltünk újabb mortalitást, ezért a vizsgálatot az expozíció után 8 nappal befejeztük. A betegség jeleit mutató halakat (a víz felszín közelében lévő halakat, a légkő körül lassan úszó vagy a tartály alján mozdulatlanul haladó embereket) emberileg feláldozták az érzéstelenítő túlzott expozíciójával, amint azt korábban említettük. A mortem vizsgálatot a fent leírtak szerint végeztük.

2.6 A keringő leukociták légzési kitörése

A légzési kitörést a keringő leukocitákban értékeltük minden egyes táplálási periódus végén, Nikoskelainen és mtsai. [17]. Röviden: 4 μl friss vért adtunk 96 μl HBSS-hez (Hanks's Balanced Salt Solution, pH 7,4) fehér lapos fenékű, 96 mélyedésű lemezen, és 100 μl frissen készített luminol-szuszpenzióval (2 mM luminol 0,2 M borátpuffer (pH 9,0, 2 μg ml -1 PMA-val) 1 órán át 24-25 ° C-on. Mindegyik mintát két példányban futtattuk, és egy olyan vakpróba ellenében olvastuk, amelybe vért nem adtunk. A kinetikus görbék előállításához 3 percenként mértük a luminnollal amplifikált kemilumineszcenciát lemezes lumineszcencia-leolvasóval (TECAN). Minden mintát két példányban futtattunk, és kiszámítottuk az integrált lumineszcenciát relatív fényegységekben (RLU).

2.7 Veleszületett humorális paraméterek

A plazma baktericid aktivitást Graham és munkatársai szerint mértük. [18] néhány módosítással [19]. A Photobacterium damselae subsp. piscicidát (20 μl, 1 × 106 CFU ml -1) adtunk 20 μl plazmához egy U alakú, 96 üregű lemez duplikált üregében. HBSS-t adtunk plazma helyett, hogy pozitív kontrollként szolgáljon. 2,5 órás inkubációs periódus után 25 ° C-on 25 μl 3- (4,5-dimetil-2-il) -2,5-difenil-tetrazólium-bromidot (1 mg ml -1, Sigma) adunk az egyes mélyedésekhez, és a lemezeket további 10 percig inkubáltuk 25 ° C-on. Ezután 200 μl dimetil-szulfoxidot (Sigma) adunk hozzá, miután 2000 × g-vel 10 percig centrifugáljuk. A képződött, újraszuszpendált formazán abszorbanciáját 560 nm-nél leolvastuk egy Synergy HT (Biotek) mikrolemez-olvasóval. Az összes baktericid aktivitást az elpusztított baktériumok százalékában fejezzük ki, a minták és a pozitív kontroll közötti különbségből számítva (100% élő baktérium).

A teljes plazma nitrit- és nitráttartalmat Nitrate/Nitrite kolorimetrikus készlet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Németország) segítségével mértük egy 96 üreges lemezhez igazítva és a gyártó utasításainak betartásával. Mivel mindkét vegyület az endogén módon előállított NO származékai, ezek a plazma NO-mennyiségét jelzik. Röviden: 100 μl plazmát adtunk két példányban 50 μl redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfáthoz (NADPH), majd 4 μl nitrát-reduktázt adtunk hozzá. A vakot plazma helyett desztillált víz hozzáadásával állítottuk elő. Az 540 nm-en mért abszorpciót 30 percen át 25 ° C-on végzett inkubálás után leolvassuk. Ezután 50 µl szulfanilamidot és azonos térfogatú N- (1-naftil) -etiléndiamin-dihidrokloridot adunk mindegyik üreghez. Az elegyet 15 percig 25 ° C-on állni hagytuk, és az abszorbanciát 540 nm-nél leolvastuk. A teljes nitritszintet egy korábban elkészített nátrium-nitrit-standard görbéből számítottuk.

2.8 Gén expressziós elemzés

A PCR-amplifikációhoz használt program tartalmazott egy kezdeti denaturálási lépést 95 ° C-on 3 percig, majd 40 denaturációs ciklust követett 15 másodpercig 95 ° C-on, és 60 percig hőkezeléssel/meghosszabbítással 60 ° C-on. A PCR-reakciók hatékonysága mindig meghaladta a 90% -ot, és negatív kontrollokat mintaszablonok nélkül rutinszerűen végeztünk minden primerkészlethez. A reakciók specifikusságát olvadási görbék elemzésével (ramping sebessége 0,5 ° C/10 s 55–95 ° C hőmérsékleti tartományban) és az RT reakciók soros hígításainak linearitásával igazoltuk. A PCR kiterjesztési fázis során nyert fluoreszcencia adatokat a delta – delta Ct módszerrel normalizáltuk (Livak és Schmittgen, 2001). A Β-Actin gén expressziós stabilitását GeNorm szoftver segítségével teszteltük (M pontszám = 0,21), és háztartási génként használtuk a normalizálási eljárásban. A hajtáscsökkenés-számításokat az Arg1 vagy Arg2 és a CTRL halak expressziós arányára vonatkoztatva végezzük (az> 1 értékek az Arg1 vagy Arg2 halakban szabályozott géneket jeleznek; értékek 4. táblázat. Adatok a 15. vagy 29. mintában vett európai tengeri sügér teljesítményéről nap után három különböző étrendet etettek.

Az értékek átlagok ± SEM (n = 10)

3.2 Bakteriális kihívás

A halálozás két nappal a bakteriális fertőzés után kezdődött, függetlenül az étrendi kezeléstől vagy az etetési időtől (1a. És 1b. Ábra). PBS-sel injektált halakban nem tapasztaltak mortalitást (az adatokat nem mutatjuk be). Az első provokációt (az etetési kísérlet 15. napját) illetően a fertőzés előtti dózis, amely a provokáció előtti vizsgálaton alapult, körülbelül 1,5 × 104 CFU ml -1 volt. A legmagasabb halálozási arány az Arg1 és az Arg2 étrendi csoportokban fordult elő, a halálozás 86,7% -kal, illetve 93,3% -kal (1a. Ábra). A magas mortalitást, bár alacsonyabb volt, a CTRL csoportban regisztrálták (76,7%). Mivel a mortalitás a CTRL csoportban a vártnál magasabb volt (valószínűleg az átlagos vízhőmérséklet emelkedése miatt - a kezdeti hőmérsékletről 22,3 ° C-ról a végső hőmérsékletre 23,6 ° C-ra), alacsonyabb dózist alkalmaztunk a második bakteriális fertőzéshez (az etetés 29. napja) ). A halakba 3 × 103 CFU ml -1 injekciót adtunk, és a mortalitás alacsonyabb volt, mint az első kísérletben (1b. Ábra). Az Arg1 és Arg2 táplálékkal táplált halak érzékenyebbek voltak a fertőzésre, mint a CTRL étrendet fogyasztók, 67,5% -os, 77,5% -os és 52,5% -os mortalitással.

Az értékek három párhuzamos tartály átlagát jelentik (n = 30). A SEM és az ál-injektált halak nem kerültek bemutatásra a grafikonok érthetősége érdekében.

3.3 A keringő leukociták légzési kitörése

Az étrendi arginin szignifikánsan csökkentette a keringő leukociták légzési kitörését, függetlenül a kiegészítési szinttől, ha a halakat 29 napig etették (2. ábra). Ezenkívül az Arg2 étrenddel táplált halak válasza is alacsonyabb volt, ha csak 15 napig etették őket. Az idő és az étrendi kezelés közötti kölcsönhatást észlelték az Arg1 és Arg2 étrendet tápláló halakban is, összehasonlítva a CTRL diétával táplált egyénekkel a 29. napon.

Az értékek a relatív fényegységek ± SEM átlagát jelentik (n = 6). A különböző nagybetűk statisztikailag szignifikáns különbségeket jelentenek az étrendek között az etetési időtől függetlenül. Különböző kisbetűk statisztikailag szignifikáns különbségeket jelentenek az étrendek között ugyanazon etetési időn belül (kétirányú ANOVA; P 3. ábra. Baktericid aktivitás (a) és nitrogén-monoxid-tartalom (b) az európai tengeri sügér plazmájában különböző étrendekkel etetett 15 ( fekete oszlop) vagy 29 (szürke oszlop) nap.

Az értékek ± SEM átlagot jelentenek (n = 6). A csillagok az egyes étrendeken belül az etetési időnek tulajdonított különbségeket jelölik. A különböző nagybetűk statisztikailag szignifikáns különbségeket jelentenek az étrendek között az etetési időtől függetlenül (Kétirányú ANOVA; P 4. ábra. Az immunrendszerrel összefüggő gének mennyiségi expressziója az európai tenger lépében (a), elülső (b) és hátsó (c) béljében basszus 29 napon keresztül táplálkozott különböző étrendekkel.