Az FTO rs9939609 és az MC4R rs17782313 polimorfizmusainak értékelése mint az elhízás prognosztikai biomarkerei: populációalapú keresztmetszeti vizsgálat

Mina Mozafarizadeh

1 Sejt- és molekuláris biológiai tanszék, Nour Danesh Felsőoktatási Intézet, Iszfahán, Irán

Mohsen Mohammadi

2 Hepatitis Kutatóközpont és Gyógyszerészeti Biotechnológiai Tanszék, Gyógyszerésztudományi Kar, Lorestan Orvostudományi Egyetem, Khorramabad, Irán

Soha Sadeghi

1 Nour Danesh Felsőoktatási Intézet Sejt- és Molekuláris Biológiai Tanszék, Iszfahán, Irán

Morteza Hadizadeh

3 Élettani Kutatóközpont, Alap- és Klinikai Élettani Intézet, Kermani Orvostudományi Egyetem, Kerman, Irán

Tayebe Talebzade

4 Mikrobiológiai Tanszék, Varamin-Pishva fiók, Iszlám Azad Egyetem, Varamin, Irán

Massoud Houshmand

5 Orvosi Genetika Tanszék, Országos Géntechnikai és Biotechnológiai Intézet, Teherán, Irán

Absztrakt

Célkitűzések

Az elhízás számos krónikus betegség, köztük a cukorbetegség, a szív- és érrendszeri betegségek és a rák jelentős kockázati tényezője. Az elhízás általában okok és járulékos tényezők kombinációjából ered, beleértve a genetikát és az életmódbeli döntéseket. Számos tanulmány kimutatta az egy nukleotid polimorfizmus (SNP) összefüggését a zsírtömegben és az elhízáshoz társuló (FTO), valamint a melanokortin-4 receptor (MC4R) gének testtömeg-indexével (BMI). Ezért a fő gének és releváns genetikai változataik felismerése elősegíti az elhízás kockázatának előrejelzését. Vizsgálatunk célja az rs9939609 és rs17782313 polimorfizmusok gyakoriságának vizsgálata volt FTO és MC4R génekben iráni populációban.

Mód

130 elhízott beteget és 83 egészséges testsúlykontrollt vontunk be, és kiszámítottuk BMI-jüket. Genomikus DNS-t extraháltunk perifériás vérből, és meghatároztuk az rs9939609 és rs17782313 polimorfizmusainak gyakoriságát az FTO és MC4R génekben a tetra-primer amplifikációval refrakter mutációs rendszer-polimeráz láncreakció (ARMS-PCR) alkalmazásával.

Eredmények

Jelentős összefüggéseket találtak az FTO rs3939609 és a BMI között. Ahol a homozigóta kockázatú allélhordozóknak (A-A) szignifikánsan magasabb az elhízás esélye (OR), mint a normál BMI-vel rendelkező egyéneknek (OR = 6,927, p Kulcsszavak: Genetikai polimorfizmus, elhízás, FTO fehérje, emberi, melanokortin-4 receptor

Bevezetés

Vizsgálatunk célja az FTO (rs9939609) és az MC4R (rs17782313) polimorfizmusok, mint lehetséges genetikai tényezők közötti összefüggés vizsgálata volt az egyéni elhízásra való hajlamban.

Mód

Összesen 213 iráni önkéntest vontak be a vizsgálatba, köztük 130 elhízott és 83 egészséges egyént. A vizsgálati csoportokat nemtől, fizikai aktivitási szinttől és az elhízás családi kórtörténetétől függetlenül választották ki. Minden eset 20 évnél idősebb volt. A vizsgálati csoportokat a BMI alapján három csoportba soroltuk: normál/egészséges testsúly (18,5-30).

Minden páciens megalapozott beleegyezését adta, és az összes eljárást az etáni bizottság jóváhagyta a Nour Danesh Felsőoktatási Intézetben, Iszfahánban, Irán. Röviden, 3 ml perifériás vért gyűjtöttünk és steril sólyomcsőben vittünk át a laboratóriumba.

Az alkalmazott polimeráz láncreakció (PCR) primereket az Oligo 7 Software segítségével terveztük meg, a rendelkezésre álló GenBank szekvenciák összehangolása után. Az alkalmazott primereket az 1. táblázat tartalmazza. A teljes genomi DNS-t a perifériás vérből a GeNet Bio extrakciós készlet (GeNet Bio, Makrozhen, Korea) segítségével extraháltuk a gyártó utasításai szerint. Meghatároztuk az egyes mintákból kivont DNS koncentrációját és tisztaságát, majd OD 260/280 spektrofotometriát (NanoDrop, DeNovix Inc., Wilmington, DE, USA), valamint 1,5% agaróz gélen végzett kvalitatív DNS-értékelést.

Asztal 1

GenesForward primer (5’ – 3 ’) Reverse primer (5’ – 3’)

FT0 rs9939609 belső	CCTTGCGACTGCTGTGAATATA	CAGAGACTATCCAAGTGCATCTCA
FT0 rs9939609 külső	GCTGCTATGGTTCTACAGTTCCA	TGTTCAAGTCACACTCAGCCTC
MC4R rs17782313 belső	GAAGTTTAAAGCAGGAGAGATTGTATACC	GCTTTTCTTGTCATTTCCAGCA
MC4R rs17782313 külső	TCCACATGCTATTGGTTTAAGACAA	TGCTGAGACAGGTTCATAAAAAGAG

FTO: a zsírtömeg és az elhízáshoz kapcsolódó; MC4R: melanokortin-4 receptor.

A tetra-primer amplifikációs refrakter mutációs rendszer (ARMS) -PCR-t a Biometra GmbH System (Biometra GmbH, Kat # 846-X070-141, Makrozhen, Korea) alkalmazásával hajtottuk végre. Az amplifikációt 25 µl reakcióelegyben hajtottuk végre, amely 1 µl DNS-t, 0,7 µl minden külső FTO primert, 1 µl minden belső FTO primert, 3 µl minden belső MC4R primert, 1 µl minden belső MC4R-t, 0,5 µL dNTP-k, 2,5 µl puffer (10x), 1 µl MgCl2 (1 Mm) és 0,2 µl Taq polimeráz. Mindkét PCR vizsgálatot optimalizált körülmények között futtattuk [2. táblázat].

2. táblázat

Gének Kezdeti denaturációs ciklus (32 ciklus) Végső meghosszabbításEgy ciklusDenaturationAnnealingExtensionOne ciklus

FTO	95 o C - 5 perc	95 o C - 30 mp	58 o C - 30 mp	72 o C - 30 mp	72 o C - 5 perc
MC4R	95 o C - 5 perc	95 o C-30 mp	59 o C - 30 mp	72 o C - 30 mp	72 o C - 5 perc

FTO: a zsírtömeg és az elhízáshoz kapcsolódó; MC4R: melanokortin-4 receptor.

A PCR termékeket elektroforézissel értékeltük 1,5% -os agaróz gélen, amelyet SYBR® Safe DNS gél festéssel (Invitrogen) festettünk. A PCR-termékek szekvenálását egy ABI PRISM® 3100 genetikai elemző gépen (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific és Waltham, MA, USA) is elvégeztük. A variánsok elemzését a Finch TV Software (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA) segítségével értékeltük.

A statisztikai elemzéseket az SPSS (SPSS Inc., Released 2007. SPSS for Windows, 16.0. Chicago, SPSS Inc.) alkalmazásával végeztük. A leíró elemzéseket átlag ± szórásként fejeztük ki. A csoportok arányainak összehasonlításához a khi-négyzet teszteket és az esélyhányadosokat (OR) használtuk. Az összehasonlításokat statisztikailag szignifikánsnak tekintettük, ha p 3. táblázat] vagy elhízott (OR = 6,927, p 4. táblázat], mint az egészséges testsúlyú/kontroll csoport egyedei. Ezenkívül nem figyeltünk meg szignifikáns összefüggést az MC4R rs17782313 és az elhízás között, összehasonlítva az egészséges BMI-vel rendelkező egyénekkel. Az egészséges testsúlyú betegekkel összehasonlítva az MC4R kockázati allél (CC) betegeknél nagyobb az elhízás esélye, mint a T allélekkel (TT és TC) (OR = 1,889, p = 0,077, 95% CI: 0,92–3,84) [3. táblázat A Tetra ARMS-PCR termékek elemzése agarózgélen 296 bp és 211 bp sávot mutatott az rs9939609 és az rs17782313 esetében [1. ábra]. A szekvenálással kapott eredmények megerősítették a fenti eredményeket. Az FTO és MC4R mutációinak kimutatása gének, az intronok szekvenálása és elemzése Az FTO gén 1. intronjának szekvenálási eredménye két SNP-t mutatott ki a 207 (G-A) és 231 (T-A) pozíciókban. SNP-t találtak a 135-ös (T-C ) az MC4R génből [2. ábra].

3. táblázat

Vita

Korábban már vizsgálták az FTO rs9939609 és az MC4R rs17782313 polimorfizmusainak az elhízásra gyakorolt hatását. A tanulmány szerzői szignifikáns kapcsolatot találtak az FTO kockázati genotípusok (AA + AT) és a BMI között (p = 0,03), és az MC4R kockázati genotípusok (CC + CT) nagyobb BMI-vel (p = 0,03) voltak összefüggésben. 33

Vizsgálatunkkal egyetértésben egy másik tanulmány szerzői kimutatták, hogy az FTO rs9939609 A-A genotípus szignifikánsan magasabb volt az elhízott populációban a normál testsúlyú alanyokhoz képest. 34 Továbbá a szerzők nem figyeltek meg szignifikáns kapcsolatot az MC4R polimorfizmusok és a BMI között.

Ezekkel az adatokkal ellentétben arról is beszámoltak, hogy az MC4R rs17782313 SNP-vel rendelkező alanyok pozitív összefüggést mutattak a BMI-vel (p = 0,018). 2 Számos tanulmány számolt be arról, hogy az MC4R variánsok összefüggenek az elhízás előfordulásával. 35-37

Az FTO gén magas szinten expresszálódik az agyban és a hipotalamuszban, amely régió ismert felelős az étvágyszabályozásért. Biokémiai vizsgálatok kimutatták, hogy az FTO gén mint elhízásra hajlamos gén mutációja az elhízás fokozott kockázatához vezethet. 14,15,27,28,30,39 Egy nemrégiben készült jelentés azt sugallta, hogy az FTO régióban az elhízáshoz kapcsolódó elemek kölcsönhatásba lépnek egy iroquois osztályú homeodomain protein 3 (IRX3) gén promoterrel, és szabályozhatják az IRX3 expresszióját, ezért lehetséges, hogy az IRX3 gén az elhízással is összefügg. 40 Ezen túlmenően az FTO gén elhízással kapcsolatos FTO intronjainak mutációi számos krónikus betegség, köztük a II. Típusú cukorbetegség és a szív- és érrendszeri betegségek fokozott kockázatával járnak. 26,39,41 Az IRX3 promoter, egy több százezer bázispárral távolabb eső gén, kölcsönhatásba lép az elhízással kapcsolatos FTO intronokkal, valamint számos más elemmel, ezért ezek az intronok az IRX3 expresszió szabályozó elemeként működnek, bár a bizonyítékok azt mutatják, hogy maga az FTO gén nem játszik szerepet ebben a kölcsönhatásban. 40 A szabályozási elemeken belüli mutációk, amelyek a kromoszóma-rendellenességektől terjednek, magukban foglalják az SNP-re történő transzlokációkat, deléciókat, duplikációkat, inverziókat és aneuploidiákat, amelyek különböző emberi betegségeket okoznak. 42

Az MC4R fontos elhízási jelölt gén. Ezt a 322 aminosavból álló receptort egyetlen exon kódolja, amely a 18q22 kromoszómán található, és az agy legmagasabb szintjén expresszálódik. Az MC4R gén mutációi hozzájárulnak az energia homeosztázisának megzavarásához, a súlygyarapodáshoz és az elhízás kialakulásához. 44 Ezenkívül a központi idegrendszer MC4R-je kulcsszerepet játszik a glükóz homeosztázis szabályozásában. Így a humán MC4R gén mutációi befolyásolhatják az inzulin szekréció szintjét, és hiperinsulinémiához vezethetnek. Az MC4R gén polimorfizmusának átfogó vizsgálata azt mutatta, hogy számos változat közül az rs17782313 genotípus szignifikánsan gyakoribb és összefügg az elhízással. 20,31,45-47 Az rs17782313 BMI-vel való polimorfizmusának társulási mechanizmusa még nem tisztázott, és további tanulmányokat igényel. Ennek ellenére különféle tanulmányok azt sugallják, hogy az MC4R rs17782313 variáns és a magas energiafogyasztás közötti összefüggés szignifikáns. 24,44,46

Következtetések

Az elhízásnak többtényezõs eredete van, és elõfordulása drámaian megnövekedett, így a gének genetikai polimorfizmusának meghatározása fontos megközelítés lehet az elhízás genetikai hajlamának jelölõjeként az összes populációs csoport számára. Adataink megerősítik a korábbi megfigyeléseket, miszerint az A-A genotípus hordozók nagyobb kockázatot jelentenek az elhízásra, mint az A-T és T-T genotípus hordozók. Ez a tudás fontos következményekkel járhat a személyre szabott életmód-menedzsment stratégiákban, hogy megakadályozza a genetikailag fogékony egyének elhízását. Végül ezek az eredmények azt sugallják, hogy az FTO és MC4R genetikai polimorfizmusok értékelése prognosztikai eszköznek tekinthető az elhízás kialakulásának nagyobb kockázatú emberek azonosítására.

Közzététel

Minden szerző nem jelentett összeférhetetlenséget. A tanulmány nem kapott támogatást.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők köszönetet mondanak az Iráni Nemzeti Tudományos Alapítványnak és az Országos Géntechnikai és Biotechnológiai Intézetnek, Teheránban, Iránban. A szerzők köszönetüket fejezik ki valamennyi résztvevőnek a vérminták adományozásáért.