Az L-arginin javítja a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott érelmeszesedést az miR-221 csökkentésével

1 Kardiológiai Osztály, Fudani Egyetem Jinshan Kórháza, Sanghaj 201508, Kína

Absztrakt

1. Bemutatkozás

Az ateroszklerózis (AS) a krónikus halál egyik vezető oka világszerte, és az endothel diszfunkció az első lépés a koszorúér-érelmeszesedés felé [1]. Az endothelialis sérülés, a lepedék felhalmozódása és a keskeny artériák végül szívkoszorúér-betegséget és miokardiális infarktust eredményezhetnek [2]. A koleszterinből, zsírból és kalciumból álló vérplakk felelős azért, hogy korlátozza az oxigénben gazdag vér áramlását a fontos szervekre, különösen a szívre és az agyra [3]. A nitrogén-monoxidot (NO) nitrogén-monoxid szintázok (NOS) hozzák létre, amelyek az endoteliális NOS-khoz (eNOS-ok), a neurális NOS-okhoz (nNOS-ok) és az indukálható NOS-okhoz (iNOS-ok) kapcsolódnak [4]. Az alacsony NO-koncentrációt termelő eNOS expressziója szükséges az endothel működéséhez és integritásához [5]. Az endoteliális eredetű NO-ról sok esetben úgy gondolják, hogy védőszer számos betegségben, és feltételezik, hogy védő szerepet játszik az AS ellen az oxidatív stressz, a gyulladás, a proliferáció és a vérlemezke-aggregáció csökkentésével [6–9].

Az L-arginin, egy félig esszenciális aminosav, bázikus az éretlenség, a betegség és az emberi test sérülése szempontjából [10]. Az NO prekurzoraként az L-arginint egy komplex enzimkészlet metabolizálja és szabályozza több jelátviteli útvonalon [11]. Ezen enzimek közül kiderült, hogy a NOS felelős az arginin NO és L-citrullinná történő metabolizálásáért [11]. A fokozott NO-szintézis vagy -hatás értáguláshoz és a sejtek anyagcseréjének javulásához vezet [12]. A bizonyítékok azt mutatják, hogy az étrend kiegészítése L-argininnel és statinnal (atorvasztatinnal) hatékonyabban csökkenti az elváltozás méretét az AS-ben, mint akár az L-argininnel, akár önmagában egy statinnal végzett kezelés [13].

A MiRNS-ek, a rendkívül konzervatív, nem kódoló kis RNS-ek 19-25 bp hosszúságúak, képesek komplementer bázispárosítással degenerálni a cél mRNS-t és elnyomni az mRNS-transzlációt. Megállapították, hogy huszonöt miRNS magasan expresszálódik az emberi endothel sejtekben, amelyek közül a miR-222/221 szabályozhatja az eNOS fehérjék expresszióját [14]. Az eNOS fehérjék ezen miRNS-ekkel történő szabályozása előnyös lehet az AS kezelésében; az azonban továbbra sem tisztázott, hogy az L-arginin képes-e javítani az AS és az alapjául szolgáló molekuláris mechanizmusok fejlődését. Ennek a tanulmánynak a célja a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott AS patkánymodell felhasználásával az L-arginin szerepének feltárása volt az AS kialakulásában és azoknak a mechanizmusoknak a vizsgálata, amelyek révén a miR-221 befolyásolhatja az endothelsejtekben lehetséges jelátviteli utakat az AS alatt.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatmodell

Állatkísérleteket az állatgondozás etikai bizottságának jóváhagyásával hajtottak végre a Jinshan Kórházban, a kínai Fudani Egyetemen, és a Kínai Orvostudományi Akadémia állatkísérletekkel kapcsolatos irányelveivel összhangban.

A Shanghai Jiesijie Laboratories Animal Technology Co., Ltd.-től (Shanghai, Kína) vásárolt nyolc hetes Sprague-Dawley (SD) hím patkányokat véletlenszerűen négy csoportba osztották (n = 10 minden csoportban). A patkányokat egy szokásos, állatminőségű helyiségben helyezték el, mindegyik ketrecben négy állat. A hőmérsékletet 20 ± 2 ° C-on, a relatív páratartalmat 60% -on, a fényciklust 12 óra/nap-on tartottuk.

A kontrollcsoport (1. csoport) patkányainak szokásos táplálékot és ivóvizet adtak. A magas zsírtartalmú patkányokat (2. csoport), a prevenciós csoportot (3. csoport) és a statinnal kezelt csoportokat (4. csoport) magas zsírtartalmú étrenddel etették, de a 2. csoport nem részesült kezelésben. A 3. csoportba tartozó patkányoknak 1 g/kg/d L-arginint (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) injektáltunk 12 hét alatt az AS indukció során. A 4. csoportba tartozó patkányoknak 4 mg/kg/nap szimvasztatint adtak 12 hétig, az 1. és 2. csoportba tartozó patkányoknak 2 ml sóoldatot injektáltak.

2.2. Morfológia és szövettan

Az állatokat intraperitoneális injekcióval 40 mg/testtömeg-kg 1% pentobarbitállal altattuk, és 24 hetes korukban felöltük őket. Az aorta hasi szövetet boncoltuk és kivágtuk a szív és a vese artéria között, hideg fiziológiás sóoldattal öblítettük és 10% -os formalinos oldatban rögzítettük 24 órán át. A boncolt szöveteket ezután etanol osztályozott sorozatokon dehidratáltuk, xilollal diafonizáltuk és paraplasztba ágyazottuk (Leica Biosystems, Wetzlar, Németország). A szövettani szöveteket ezután 5 szakaszra vágtuk µm vastag és hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festett. A fennmaradó szövetmintákat folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk, és további vizsgálatok céljából -80 ° C-on tároltuk. Az aorta keresztirányú szakaszait fénymikroszkóp alatt figyeltük meg. Az intima és a tunica tápközeg vastagságát ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) alkalmazásával mértük.

2.3. Elsődleges endoteliális sejtek izolálása és tenyésztése

Az aorta artériákat steril környezetben boncoltuk, és a zsír és a kötőszövetek eltávolítását követően mikroszár segítségével nyitottuk. Az artéria intimát kis mennyiségű I. típusú kollagenázba merítettük és 1 órán át emésztettük. Az endoteliális sejteket elkülönítettük és disszociáció után összegyűjtöttük 0,1% tripszinnel és ismételt centrifugálással 1000 fordulat/perc sebességgel. A leválasztott endoteliális sejteket 20% szérumot tartalmazó teljes tápközegben (Gibco, Thermo Fisher Scientific, CA, USA) tenyésztettük 3-4 napig. A sejteket a 90% -os összefolyás elérése után a következő generációhoz továbbítottuk. Az endoteliális sejtek első három generációját alkalmaztuk további vizsgálatokhoz.

2.4. L-arginin kezelés endothel sejtekben

Az endoteliális sejteket kontroll vak, oxidált kis sűrűségű lipoprotein (OxLDL), 5 mM L-arginin, 25 mM L-arginin és 50 mM L-arginin csoportokra osztottuk. A kontrollcsoportban lévők kivételével az összes csoport sejtjeit 100-tal kezeltük µg/ml OxLDL (Xie Sheng Biotechnology Company, Peking, Kína) magas glükózszintű közegben. Az L-arginint a kontroll és az OxLDL csoport kivételével az összes csoportra 24 órán át alkalmaztuk. Ezután az összes sejtet összegyűjtöttük további vizsgálat céljából.

2.5. Az AntagormiRNS transzfekciója

Az AntagormiR-221-et és a negatív kontroll miRNS-t (miR-NC) a Guangzhou RiboBio Co., Ltd.-től (Guangzhou, Kína) vásároltuk. Röviden: 50 nM antagormiR-221/miR-NC-t endothelsejtekhez 7 μL/mélyedésű lipfectamin 2000 reagens 2 ml szérummentes Opti-MEM táptalajban (Cat #: 31985070, GIBCO, Thermo Fisher Scientific). A sejteket 6 órán át transzfektáltuk, majd a tápközeget kicseréltük és 48 órán át tartottuk.

2.6. Western Blotting

A patkány aorta szöveteket és az endoteliális sejteket összegyűjtöttük és ultrahangos homogenizátor alkalmazásával roncsolásnak vetettük alá RIPA-ban, amely proteázt és foszfatáz inhibitorokat tartalmazott (Jiangsu KeyGEN BioTECH Corp., Ltd. Nanjing, Kína). A fehérjekoncentrációkat a Pierce BCA protein assay kit (Rockford, IL, USA) segítségével detektáltuk. Húsz mikrogramm fehérje a sejtekből (8 μL az állati szövetek esetében) 8% -os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gél elektroforézis géleken elválasztottuk és polivinilidén-difluorid membránokra helyeztük, amelyeket 5% zsírmentes tej alkalmazásával 1 órán át szobahőmérsékleten blokkoltunk. A fehérjemintákat egy éjszakán át inkubáltuk antitestekkel, nyúl β-aktin és nyúl eNOS (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). A másodlagos antitestet, nyúlellenes immunglobulin G-torma-peroxidázt (1: 5000) a Cell Signaling Technology-tól (Danvers, MA, USA) szereztük be. A jeleket a Tanon-4500 gél képalkotó rendszerrel (Tanon Science and Technology Co., Ltd., Sanghaj, Kína) detektáltuk és elemeztük.

2.7. RNS extrakció és kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció

2.8. Sejt apoptózis vizsgálata

Az endoteliális sejtek apoptózisát az Annexin V fluoreszcein-izotiocianát (FITC)/propídium-jodid (PI) apoptózis detektálási módszerével (Thermo Fisher Scientific) használtuk. A sejteket EDTA-mentes tripszinnel emésztettük, kétszer hideg foszfáttal pufferolt sóoldattal mostuk, centrifugáltuk, majd 100 ° C-on újra szuszpendáltuk. µL kötő puffer. Ezután 5 µL Annexin V-FITC és 5 µL PI festőoldatot adtunk a 100-hoz µL sejt szuszpenziót és inkubáljuk 37 ° C-on 15 percig. Az elegyeket 400 ml-re hígítottuk µL kötő puffert és 1 órán belül elemeztük a fluoreszcenciával társított sejtrendező szkenneléssel (FACScan, Becton Dickinson, San Jose, Kalifornia, USA).

2.9. Statisztikai elemzések

A normális eloszlásnak megfelelő mérési adatokat az átlag (M) ± standard hiba (SD) írja le, egyébként a medián írja le. A normál eloszlásnak engedelmeskedő és a variancia homogenitásával rendelkező több csoportot egyirányú varianciaanalízissel határoztuk meg. Két csoport összehasonlításához, a normális eloszlásnak való megfelelés és a variancia homogenitása érdekében Bonferroni-korrekciót alkalmaztunk, különben Kruskal-Wallis tesztet alkalmaztunk. Az adatokat a Stata 12.0 (https://www.statalist.org) és a

statisztikailag szignifikánsnak tekintették.

2.10. A betegek és a nyilvánosság bevonása

Ebben a vizsgálatban nem vettek részt betegeket.

3. Eredmények

3.1. A patkány aorta szövetének morfológiája

Amint az 1. ábrán látható, a vak csoportba tartozó patkányok aortájának tunica intimae sima volt, és kis számú kollagén- és simaizomrostot, valamint egyenletesen elosztott rugalmas szálakat tartalmazott. A magas zsírtartalmú étrendbe tartozó állatok patkányai beavatkozás nélkül a látható habsejtek számának növekedését és az artériás fal meszesedését mutatták.

Az L-arginin prevencióban és a szimvasztatinnal kezelt csoportok patkányai az artéria falán is különböző mértékű AS elváltozásokat mutattak; a meszesedési elváltozások száma azonban szignifikánsan alacsonyabb volt és a meszesedés mértéke lényegesen kisebb volt, mint a magas zsírtartalmú csoport beavatkozás nélküli csoportjában. Az 1. táblázat azt mutatta, hogy a magas zsírtartalmú, beavatkozás nélküli csoport patkányainak volt a legvastagabb a tunica intimae az összes vizsgált csoport közül, ami az AS patkány modell sikeres létrehozását jelezte.