Az n-3 zsírsavhiányos étrend befolyásolja az egér térbeli tanulását a Barnes körkörös labirintusban

Junji Hoshiba

* Állattenyésztési Tanszék, Fejlett Tudományos Kutatóközpont, Okayama Egyetem, Okayama Japan

Absztrakt

Az n-3 zsírsavak hiányát egy mesterséges nevelési módszer alkalmazásával érték el, amelyben az ICR egérkölyköket kézzel kezelték hiányos étrenddel az élet második napjától kezdve. N-3 zsírsavhiányos étrendben az egerek teljes agy-DHA-aránya 51% -kal csökkent az n-3 zsírsavakban elegendő étrenddel összehasonlítva. Az N-3 zsírsav-megfelelő és hiányos egerek nem különböztek a mozgásszervi aktivitás tekintetében a nyílt terepen végzett tesztben vagy a szorongással kapcsolatos viselkedésben az emelkedett plusz labirintusban. Az n-3 zsírsavhiányos egerek a tanulás zavarait mutatták ki a Barnes-i labirintus referencia-memória változatában, mivel több időt töltöttek és több hibát követtek el egy menekülési alagút keresésében. A Barnes-labirintus idevált és munkamemóriás változatában nem figyeltek meg teljesítménykülönbséget az összes étrendi csoport között. Ez azt jelezte, hogy a motivációs, motoros és szenzoros tényezők nem járultak hozzá a referencia memória károsodásához.

Bevezetés

Mód

Állatok és diétás kezelések

Viselkedésvizsgálat

A viselkedésvizsgálat 7 hetes korban kezdődött. Az egereket mindkét kísérletben nyílt terepi tesztnek vetették alá és a megemelt plusz labirintust. Az első kísérletben a Barnes-labirintus referencia-memória verzióját valósítottuk meg, a második kísérletben pedig a Barnes-labirintus munkamemóriás és cued változatát használtuk.

Nyílt terepi teszt

A spontán mozgásszervi aktivitás értékeléséhez az egereket egy nyílt terű készülék közepére helyeztük (56 × 56 cm; Lafayette Instruments, Lafayette, IN). A nyílt terepi készüléket 32 infravörös fénysugárral látták el a falakon és 9 lyukat a padlón (szintén fénysugarakkal ellátva), amelyek lehetővé tették a különböző ambulációs paraméterek (mozgásszervi aktivitás), a nevelés és a kutatott lyukak automatizált nyilvántartását . Ezeket a paramétereket 60 perc alatt rögzítettük.

Emelt Plus-labirintus

A szorongással kapcsolatos viselkedés mérésére emelt plusz labirintust alkalmaztak (Lafayette Instruments, Lafayette, IN). A plusz labirintust 70 cm-rel a padló fölé emelték, és két nyitott és két zárt, azonos méretű (35 × 5 cm) karból állt; a zárt karokat 15 cm magas falak vették körül. A karokat fekete akrillapokból építették ki, amelyek egy középső emeletről (5 × 5 cm) sugározva pluszjelet képeztek. Az útvesztőt 36 infravörös fénysugárral látták el, amelyek lehetővé tették a nyitott és zárt karokra fordított idő, valamint a nyitott és zárt karokba történő belépés számának mérését. A nyitott karok szélére szerelt gerendák megragadták a témát, aki fejét a szélén lógatta.

Barnes Körlabirintus

Annak érdekében, hogy az egereket megismertessék a labirintussal és a menekülési alagút létezésével, a teszt megkezdése előtt egy szoktatási munkamenetnek vetették alá őket. A szoktatási próbát azzal kezdték, hogy az állatot az útvesztő közepére helyezték egy vödör alatt egy helyiségben, amely erősen meg volt világítva és gazdag, folyamatosan elhelyezett térbeli jelzésekben. 1 perc múlva a vödröt felemelték, és az egeret hagyták felfedezni az útvesztőt. Ha az elkövetkező 3 perc alatt nem sikerült megtalálni a menekülési alagutat, akkor oda vezették. A menekülési alagútba való belépés után az állatot 1 percig hagyták az alagútban maradni.

Referencia-memória verzió (1. kísérlet)

A megszokást követő napon a tényleges tesztkísérleteket azonos körülmények között hajtották végre, azzal a különbséggel, hogy az egereknek maguknak kellett megtalálniuk a menekülési alagutat. Az állatok napi két vizsgálatot kaptak, a vizsgálatok között 3 perces időközzel. Minden kísérlet akkor ért véget, amikor az egér belépett a célalagútba, vagy 3 perc elteltével. A két vizsgálat között minden állat átlagát naponta átlagoltuk. Minden nyomot minden felület után rutinszerűen szappanos oldattal tisztítottunk, hogy kiküszöböljük az előző állatok esetleges szaglási jeleit. Az egereket 16 egymást követő napon át képezték ki a menekülési alagút felkutatására. Tíz nappal az utolsó edzés után az egereket újra tesztelték, hogy értékeljék a memória megtartását. A cél lyuk helyzete ugyanaz volt, mint az edzés ideje alatt.

A labirintus munkamemória változatában (2. kísérlet) az egereknek napi 4 kísérletet kaptak az alagút helyzetének megismerésére, de a következő napon új helyre cserélték. Minden állat esetében 15 perces intervallum volt. Az egereket 6 napig teszteltük a labirintus ezen változatában, és az eredményeket a tesztnapok közötti minden egyes kísérletre átlagoltuk. Az eredményeket (késleltetés és hibák) az egyes kísérletek kezdeti vizsgálatának százalékában fejeztük ki, majd a kísérleti csoportok átlagát kiszámítottuk.

Cued verzió (2. kísérlet)

A munkamemória-teszt befejezésétől számított egy hét elteltével az egereket teszteltük a labirintus vezérelt változatán (5 napos képzés). Ebben az esetben a labirintust fehér (20 cm magas) plakáttábla vette körül, és a menekülési alagút helyét a táblára rajzolt 3 cm széles fekete függőleges csík jelezte. A táblára más, labirintuson belüli jeleket is rajzoltak - egy kört, egy háromszöget és egy négyzetet, amelyek helyzete a kísérlet során állandó maradt. A csík helye napról napra változott, mivel ez jelezte az alagút új helyzetét. Az összehasonlító memória változatához hasonlóan az egereknek is napi két vizsgálatot végeztek, 3 perces nyomközökkel. Az egyes állatok pontszámait naponta átlagoltuk a két vizsgálat során.

Zsírsav-elemzés

Az egereket a vizsgálat végén (20 hetes korban) lefejeztük; az agyakat gyorsan eltávolítottuk, és teljes lipid-extrakciónak vetettük alá a Folch-módszer módosításával [24]. A teljes lipidkivonatot 14% BF3-metanollal transzmetiláltuk 100 ° C-on 60 percig Morrison és Smith módszerének és a gázkromatográfiával elemzett metil-észterek módosításával, a korábban leírtak szerint [25].

Statisztikai analízis

Az adatokat a Statistica 7 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK) alkalmazásával elemeztük ANOVA ismételt mérésekkel, diétával, mint csoportok közötti faktorral, és a napokkal (blokkok), mint a csoportokon belüli (ismételt) faktorokkal. Tukey tesztjét alkalmazták további post-hoc összehasonlítások elvégzésére a kísérleti csoportok között, ahol jelezték.

Eredmények

Az N-3 Def egerek küllemükben vagy testtömegükben nem különböztek szignifikánsan az n-3 Adq állatoktól. Az összes kísérleti csoport testtömegében azonos volt 13 hét koráig. 13 hetes korától kezdve a gáttal nevelt egerek testtömege alacsonyabb volt, mint a két AR csoporté. Ezt a testtömeg-különbséget a kísérlet végéig figyelték meg, amikor az egereket leölték és szöveteiket zsírsav-analízishez gyűjtötték (20 hét).

Jelentős különbségek voltak az agy összes n-6, összes n-3 és összes egyszeresen telítetlen zsírsavtartalmában a három táplálkozási csoport között, de a teljes telített zsírsavakban nem volt szignifikáns különbség (2. táblázat). A mesterséges nevelési módszer hasznos volt egy alacsony agyi DHA-szinttel rendelkező állat gyors előállításához egerekben, amelyek etették az n-3 Def tejet, valószínűleg a DHA felhalmozódásának csökkenése miatt a fejlődési periódusban. Jelentős különbség volt az agy DHA-jában a három csoport között [F (2, 41) = 202, p *

Diétás Csoport Gáttal nevelt (n = 16) n-3 Adq (n = 14) n-3 Def (n = 14)

Zsírsavak
Teljes telítettség	40,8 ± 0,2	41,9 ± 0,56	41,8 ± 0,25
Összes egyszeres telítetlen zsírsav	25,8 ± 0,4 a	23,4 ± 0,74 b	23,4 ± 0,40 b
18: 2n6	0,5 ± 0,01 a	0,5 ± 0,02 a	0,4 ± 0,02 b
20: 4n6	7,1 ± 0,12 a	7,9 ± 0,16 b	9,0 ± 0,14 c
22: 4n6	2,2 ± 0,05 a	2,4 ± 0,04 b	3,7 ± 0,04 c
22: 5n6	0,2 ± 0,01 a	0,3 ± 0,01 a	6,5 ± 0,19 b
Összesen n-6 PUFA	10,7 ± 0,14 a	11,7 ± 0,17 b	19,9 ± 0,26 c
18: 3n3	0,1 ± 0,003 a	0,1 ± 0,004 a	0,04 ± 0,003 b
20: 5n3	0,1 ± 0,004 a	0,1 ± 0,01 b	ND c
22: 5n3	0,3 ± 0,01 a	0,2 ± 0,01 a	0,1 ± 0,02 b
22: 6n3	14,6 ± 0,32 a	15,7 ± 0,35 b	7,7 ± 0,20 c
Összesen n-3 PUFA	15,0 ± 0,32 a	16,1 ± 0,36 b	7,9 ± 0,20 c
22: 5n6/22: 6n3	0,01 ± 0,001 a	0,02 ± 0,001 a	0,8 ± 0,03 b
n-6/n-3	0,7 ± 0,01 a	0,7 ± 0,01 a	2,5 ± 0,07 b
Összes zsírsav (μg/mg)	41,3 ± 0,46	39,2 ± 0,49	41,0 ± 0,44

2A. Ábra Menekülési késés (átlag az összes edzésnapon) a Barnes-labirintus munkamemória-verziójában. Az értékeket átlagként + SEM adjuk meg, ahol az egyes értékeket az átlagos 1-es próba százalékában fejezzük ki. Ismételt mérések Az ANOVA a próba szignifikáns hatását mutatta (F (3,20) = 6,90, p 0,05), és nem szignifikáns diéta x Trial interakciót (F (6,40) = 0,33, p> 0,05).

2B. Ábra Hibaarányok (átlag az összes edzésnapon) a Barnes labirintus munkamemória verziójában. Az értékeket átlagként + SEM adjuk meg, ahol az egyes értékeket az átlagos 1-es próba százalékában fejezzük ki. Az ANOVA ismételt mérései a vizsgálat szignifikáns hatását mutatták ki (F (3,20) = 8,33, p 0,05), és nem mutattak ki szignifikáns diéta x kísérleti interakciót (F (6,40) = 0,62, p> 0,05).

Vita

Az N-3 Adq és n-3 Def egerek nem különböztek sem testtömeg, sem mozgásszervi paraméterek tekintetében, míg a gáttal nevelt egerek alacsonyabb testtömeget és megnövekedett mozgást mutattak, mint mindkét mesterségesen nevelt csoport. A gáttal nevelt csoport testtömeg-különbségei az AR-csoportokhoz kapcsolódhatnak a gáttal nevelt csoport magasabb mozgásszervi aktivitásával vagy az AR-csoportokban az anyai nélkülözés miatti fejlődési stresszel. Egy másik lehetséges magyarázat a zsír és a sovány testtömeg különbözõ szétválasztása.

Eredményeink azt mutatták, hogy az n-3 zsírsavhiány befolyásolja a térbeli tanulást a Barnes-labirintusban. Emellett figyelemre méltó volt, hogy a Diet X Days jelentős interakciója is volt, ami azt jelzi, hogy a hiányos egerekben csökkent a tanulás sebessége. A Barnes-labirintus annyiban hasonlít a Morris-vízi labirintushoz, hogy hippocampus-függő kognitív feladatról van szó, amelyhez térbeli referencia-memória szükséges [19, 20]. Ezek az eredmények megerősítik és kiterjesztik a korábbi megfigyeléseket, miszerint az agy DHA kimerülése gyenge teljesítményhez vezet a Morris vízi útvesztőben [15, 16, 17, 18]. Érdekes módon pozitív összefüggést találtak az agy DHA-tartalma és a teljesítmény között a Morris vízi labirintusban [16].

Bár a Barnes-labirintus némileg hasonlít a Morris vízi labirintushoz, a Barnes-labirintus előnye, hogy kevésbé megterhelő és fizikailag kevésbé megterhelő, mint a Morris-vízlabirintus. A táplálkozási csoportok tanulmányozására egy kevésbé stresszes tesztet választottak, mivel bizonyos bizonyítékok vannak arra, hogy a DHA részt vesz a stressz válaszokban [26, 27]. Korábban kimutattuk, hogy az n-3 Def egerek jobban ki vannak téve a stressznek, mivel normális körülmények között hasonlóan viselkednek, mint az n-3 megfelelő egerek, de stresszes körülmények között szignifikánsan szorongóbbak a megemelt plusz labirintusban [27]. Ha a megemelkedett szorongási szint és az érzelmi reaktivitás valójában legalábbis részben felelős a gyenge tanulásért a Morris-vízlabirintusban, akkor ezt a hatást enyhíteni kell egy kevésbé stresszes tesztben, például a Barnes-körkörös labirintusban. Az a megfigyelés, hogy a térbeli feladatok teljesítménye továbbra is hiányos ebben a kevésbé stresszes intézkedésben, arra utal, hogy az agy DHA vesztesége megváltoztatja a megismerést.

Amikor az egereket 10 nappal az utolsó edzés után újból tesztelték a Barnes-labirintusban, minden kísérleti csoport egyformán jól teljesített, jelezve, hogy az n-3 zsírsav státus nem változtatta meg a térbeli memória megőrzését.

Annak megvizsgálására, hogy az n-3 Def egereknél megfigyelt teljesítményhiány összefüggésben lehet-e az állatok érzékszervi, motoros vagy motivációs jellemzőivel, az egereket a Barnes-labirintus kottaverziójában teszteltük. Ebben a feladatban az n-3 Adq és az n-3 Def egereknek ugyanannyi időre volt szükségük a menekülési alagút megtalálásához, míg a gáttal nevelt egerek gyorsabbak voltak, mint mindkét mesterségesen nevelt csoport. A gát által nevelt csoport rövidebb menekülési latenciái összefüggésben lehetnek nagyobb mozgásszervi aktivitásukkal, és ezért nem jelenthetnek valódi javulást a tanulásban. Ez az értelmezés összhangban áll a hibaarányok közötti különbségek hiányával. Az n-3 Adq és Def csoportok hasonlósága a Barnes-labirintus cued verziójában lehetővé teszi, hogy kizárjuk az érzékszervi, mozgásszervi vagy motivációs komponenseket az n-3 Def egerekben megfigyelt térbeli tanulási hiány elszámolásának lehetséges okaiból.

Adataink nem mutattak különbséget az n-3 Adq, az n-3 Def és a gáttal nevelt egerek között a Barnes-labirintus munkamemóriás változatában, annak ellenére, hogy az agy DHA státusában jelentős különbségek vannak. Ez a megállapítás összhangban áll egy korábbi jelentéssel, amely a mesterségesen tenyésztett patkányok Morris-vízlabirintus-teljesítményéről szólt a feladat munkamemóriás változatában, ahol a kutatók nem találták a viselkedés összefüggését az előagy DHA- és arachidonsavszintjeinek széles skálájával [23]. ]. Némileg elgondolkodtató volt azonban, hogy a Morris-vízi labirintus munkamemória feladatának teljesítménybeli hiányát figyelték meg az n-3 zsírsavtartalmú étrendi korlátozás két generációja után [28]. Ezek a feladatok csak azt jelzik, hogy nincs érdemi zavar a munkamemóriában, de érzékenyebb módszertanra lehet szükség a munkamemória teljesebb értékeléséhez.

Összegzésképpen: ez a tanulmány először mutatta ki az n-3 zsírsavhiányos egerek térbeli tanulásának hiányosságát a Barnes-féle kör alakú labirintus referencia-memória változatának felhasználásával. Nem figyelték meg az n-3 zsírsavkorlátozás hatását a Barnes-labirintus kiabált változatára, ami arra utal, hogy a motivációs, érzékszervi és motoros tényezők nem voltak kritikusak a referencia memóriára gyakorolt hatások gyógyításában.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Nemzeti Egészségügyi Intézetek (NIAAA) intramurális kutatási programja támogatta.

Lábjegyzetek

Kiadói nyilatkozat: Ez egy szerkesztetlen kézirat PDF-fájlja, amelyet kiadásra elfogadtak. Ügyfeleink számára nyújtott szolgáltatásként a kéziratnak ezt a korai változatát biztosítjuk. A kézirat átmásolásán, szedésén és a kapott bizonyíték felülvizsgálatán átesik, mielőtt a végső hivatkozható formában közzétennék. Felhívjuk figyelmét, hogy a gyártási folyamat során olyan hibákat fedezhetnek fel, amelyek befolyásolhatják a tartalmat, és a naplóra vonatkozó minden jogi felelősségvállalás vonatkozik.