Az RNS kölcsönhatásainak kémiai eltolódás feltérképezése a polipirimidin traktushoz kötődő fehérjével

Xuemei Yuan, Natalia Davydova, Maria R. Conte, Stephen Curry, Stephen Matthews, Az RNS-kölcsönhatások kémiai elmozdulásának feltérképezése a polipirimidin traktus-kötő fehérjével, Nucleic Acids Research, 30. évfolyam, 2. szám, 2002. január 15., 456–462. Oldal, https: //doi.org/10.1093/nar/30.2.456

Absztrakt

A polipirimidin traktus-kötő fehérje (PTB), egy homodimer, amely monomerenként négy RRM-típusú RNS-kötő domént tartalmaz, fontos szerepet játszik mind az alternatív splicing szabályozásában, mind a transzláció iniciálásának stimulálásában, bizonyos pikornavírusok belső riboszóma belépési helyei szerint . Kémiai eltolódási térképezési kísérleteket használtunk a PTB-34, a fehérje harmadik és negyedik RRM doménjét tartalmazó rekombináns fragmens és számos rövid pirimidinben gazdag RNS oligonukleotid közötti kölcsönhatások vizsgálatára. Az eredmények megerősítik, hogy az RNS-ek elsősorban a PTB-34 β-lapjának felületével lépnek kölcsönhatásba, ugyanakkor feltárják a fehérje-fragmensen belüli két hosszú rugalmas linker szerepét is, ezt az eredményt mutagenezis kísérletek is alátámasztják. A leképezés az RRM3 és az RRM4 különálló kötési preferenciáit jelzi, az előbbi különösen specifikus interakciót vált ki az UCUUC szekvenciával.

2001. október 5-én kapott; Felülvizsgált és elfogadott 2001. november 16.

BEVEZETÉS

A polipirimidin-traktus-kötő fehérje (PTB) egy RNS-kötő fehérje, amelynek feladata a messenger és a pre-messenger RNS felhasználásának szabályozása számos különböző összefüggésben. Míg a PTB fő fiziológiai szerepe számos gén, például az α-aktinin, α- és β-tropomiozin, c-src, fibroblaszt növekedési faktor receptorok és a a GABAA receptor (1–11), a fehérje a poliadeniláció (12, 13) és az mRNS lokalizációjának (14) szabályozásában is szerepet játszik. Ezenkívül a PTB-t számos pikornavírus veszi fel a transzláció megindulásának stimulátoraként, amelyet belső riboszóma belépési helyek (IRES) vezérelnek (15–20). A legújabb munka azt sugallja, hogy a fehérje szabályozhatja a hepatitis C vírus transzlációját azáltal, hogy kölcsönhatásba lép mind a vírusos RNS 5'-, mind 3'-végével (21, 22), és stimulálhatja az APAF-1 sejtes IRES aktivitását. (23).

A PTB mindezekben a rendszerekben úgy működik, hogy kölcsönhatásba lép az RNS-szel és más kiegészítő fehérjékkel (splicing és transzláció iniciációs faktorok), bár a hatásmechanizmusok továbbra is homályosak. Az intronban lévő PTB-kötőhelyek és az IRES RNS megfigyelhető rövid pirimidin-motívumok (pl. UUCUU, UCUUC, UUCUCU, CUCUCU) ismétlődéseit (1, 3, 8, 11, 24) tartalmazzák, amelyek gyakran, de nem kizárólag, egy pirimidinben gazdag háttér. Ezeket a megfigyeléseket támasztják alá in vitro szelekció (8, 25) és kötési kísérletek (26).

A PTB homodimer (26) és négy RRM-típusú RNS-kötő domént tartalmaz monomerenként (27). A deléciós mutagenezis vizsgálatok feltérképezték az elsődleges RNS-kötő aktivitást az egyes monomerek harmadik és negyedik RRM doménjére, bár az RRM1 és az RRM2 hozzájárulása szintén jelentős lehet (17, 26, 28–30). Úgy tűnik, hogy az RRM2 fontos szerepet játszik a PTB dimerizálásában (26, 28). A PTB harmadik és negyedik RRM doménjét tartalmazó monomer fragmens, a PTB-34 oldatszerkezete feltárta, hogy az RRM3 atipikus szerkezettel rendelkezik az ilyen típusú modulokhoz, mivel az RNS-kötő funkcióként működő négyszálú β-lap a felületet egy szál (29) meghosszabbította. A PTB-34 szerkezetét két kiterjesztett és rugalmas linker polipeptid is uralja, az egyik (17 aminosav) összeköti az RRM3 4. és 5. β-szálát, a másik pedig (25 aminosav) összeköti a két RRM domént, jelezve, hogy a fehérje nagyfokú konformációs variabilitása van, legalábbis az RNS-sel való kölcsönhatása előtt.

A PTB és RNS célpontok közötti kölcsönhatások szerkezeti vizsgálataink kiterjesztése érdekében kémiai eltolódási térképezési kísérleteket végeztünk a PTB-34 és számos rövid, szintetikus, pirimidinben gazdag RNS molekula közötti komplexeken. Ez a kísérleti megközelítés feltárja azokat az aminosavakat, amelyek érintkezésben vannak az RNS ligandummal. A különböző RNS-oligonukleotidokkal megfigyelt aminosav-érintkezések különböző eloszlásainak összehasonlítása új meglátásokat tár fel a PTB szekvencia-specifitásával kapcsolatban.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

NMR spektroszkópia

15 N-jelölt PTB-34-et, amely az emberi PTB-1 335–531-es maradékát tartalmazza, Escherichia coli-ban expresszáltuk és a korábban leírt módon tisztítottuk (29). Szintetikus RNS-oligonukleotidokat készítettünk és géltisztítottunk a Dharmacon Research, Inc.-vel. Az NMR-térképezési kísérletekhez az RNS-oligonukleotidokat 0,5 mM 15 N-jelzett PTB-34-et tartalmazó oldatokban titráltuk 20 mM nátrium-acetátban, pH 5,4. 15 N-1 H HSQC spektrumot (31) RNS: PTB-34 mólarányban 0,5: 1, 1: 1 és 2: 1 arányban rögzítettünk, hogy megkönnyítsük a fehérjéhez való RNS-hez való kötődés által zavart rezonanciák követését és hozzárendelését. Az összes NMR-spektrumot 302 K hőmérsékleten, z-árnyékolt gradienssel és hármas rezonancia szondával felszerelt négycsatornás Bruker DRX500 alkalmazásával nyertük. Az NMR-adatokat NMRPipe/NMRDraw (32) alkalmazásával dolgoztuk fel, és NMRView (33) alkalmazásával elemeztük.

Mutagenezis és RNS-kötési kísérletek

A hisPTB-34a mutánsait (a humán PTB-1 324–531-es maradékai) átfedő PCR-rel állítottuk elő kidolgozott protokollok felhasználásával és expresszáltuk E. coliban (29). Az összes mutációt cDNS-szekvenálással igazoltuk. A PTB – RNS megkötési kísérleteket az EMCV IRES (17) 1. doménjének α-32 P-jelölt RNS-transzkriptumainak felhasználásával végeztük nitrocellulóz-szűrő kötési vizsgálatokban (29). Röviden: PTB – RNS-kötési reakciókat (75 µl) készítettünk és 24 ° C-on inkubáltunk legalább 15 percig 10 mM HEPES-ben (pH 7,25), 100 mM KCl-ban, 3 mM MgCl2-ban, 5% glicerinben, 1 mM DTT-ben, 50 µg/ml élesztő-tRNS (Boehringer Mannheim), 50 µg/ml humán szérumalbumin (Delta Biotechnology). Az RNS-koncentrációt tipikusan 4 nM-nál rögzítettük. A vizsgálatokat proteinkötő Protran BA-85 nitrocellulóz membrán (Schleicher és Schuell) felhasználásával végeztük. A membránt alaposan mossuk 10 mM HEPES-ben (pH 7,25), 3 mM MgCl2-ban, 5% glicerinben, 1 mM DTT-ben, és egy 96 lyukú dot-blotterre (Bio-Rad) rögzítjük. 65 µl kötési reakció felvitele előtt és után a membránt 180 µl mosópufferrel mostuk. A kísérletet követően a membránt megszárítottuk, és a megkötött PTB – RNS komplex mennyiségét Cerenkov-sugárzás szcintillációs számlálásával határoztuk meg. Eltérő rendelkezés hiányában az összes reagenst a Sigma-Aldrich cégtől szereztük be.

EREDMÉNYEK

Az RNS oligonukleotidok kiválasztása

A természetesen előforduló PTB-kötőhelyek rövid pirimidin-szekvenciák többszöri ismétléséből állnak, amelyek intron vagy IRES RNS szakaszába vannak ágyazva, amely általában> 100 nt hosszú. Az ilyen nagy célpontok nem alkalmasak az NMR elemzésére, ezért tanulmányaink a rövid motívumok megkötésére összpontosítottak. A kiválasztott szekvenciák hossza 4-10 nt között volt, és a korábban PTB-kötőhelyeken azonosított motívumokat vagy ezek enyhe variációit tartalmazta (1. táblázat).

Az RNS-kötőhely feltérképezése a PTB-34-en

Az 1. ábra az egyenletesen 15 N-jelzett PTB-34 HSQC spektrumainak átfedéseit mutatja a 3–8. Oligonukleotidok egyenlő moláris mennyiségű ligandum RNS-jével és anélkül. Meg kell jegyezni, hogy az RRM3 4. és 5. β-szálát összekötő, nagyon rugalmas hurokhoz tartozó hosszú rezonanciák vagy a hosszú, rugalmas tartományok közötti linker nem volt hozzárendelhető az apo-fehérjében, mivel a spektrum közepén súlyos átfedés volt (29 ). Ezek közül sok kémiai eltolódási változást mutat az RNS-hez való kötődéskor, de a komplexek háromdimenziós NMR-adatait nem sikerült rögzíteni (a szekvencia-specifikus hozzárendelés megkönnyítése érdekében), mert az RNS-oligonukleotidok 8 órán belül előidézték a fehérjeminta lebomlását.

Amellett, hogy demonstrálják, hogy a PTB szokatlan tulajdonságai (β5, a β4 – β5 hurok és a hosszú interdomén linker) mind részt vesznek az RNS-kötésben, az adatok azt mutatják, hogy hidrofób, poláros és pozitív töltésű aminosavak gyűjteménye vesz részt az RNS felismerésében (3. ábra). A PTB figyelemre méltó az aromás maradékok hiányának hiányában, amely megtalálható a legtöbb más RRM fehérjében, és fontos egymásra épülő kölcsönhatásokat hoz létre az RNS bázisokkal. Azonban a hidrofób maradékok közül, amelyek a PTB-ben foglalják el ezeket az általában konzervált aromás pozíciókat (Leu 340 és Leu 378 az RRM3-ban, a Met 493 az RRM4-ben), jelentős kémiai eltolódásváltozás tapasztalható, jelezve, hogy fenntartják szerepüket az RNS-kötésben. Ezek az alifás oldalláncok a PTB-ben hasonló kölcsönhatásba léphetnek a nemi letalitás és a HuD kristályszerkezeteiben megfigyelt hidrofób Ile-bázis kontaktusokkal (35, 36). Bár a PTB-ben maradt három „aromás” pozíció (Asn 376 az RRM3-ban, His 457 és Leu 495 az RRM4-ben) csak kismértékű vagy elhanyagolható kémiai eltolódási változásokat mutat RNS jelenlétében, ez nem zárja ki az RNS-kölcsönhatásokban való részvételüket. Valójában megfigyelték, hogy az His 457 mutációja csökkenti az RNS kötődését (29).

A különböző RNS oligonukleotidokkal összefüggő kémiai eltolódások mintázatának összehasonlítása számos érdekes különbséget tár fel. Az UCUUC szekvencia kémiai elmozdulásokat indukál, amelyek szinte kizárólag az RRM3 kötőfelületére csoportosulnak, jelezve, hogy ez az oligonukleotid specifikusan megköthető az RRM3-hoz (4. ábra). Ezt az értelmezést alátámasztja az a megfigyelés, hogy az RNS dekamer (UCUUCUCUUC, oligonukleotid 9), amely az UCUUC szekvencia két másolatát tartalmazza, jelentős vonal szélesedést eredményez az egész spektrumban (az adatokat nem mutatjuk be), ami jelzi a magas molekulatömeg kialakulását. súlykomplexum, valószínűleg 1: 1-nél nagyobb RNS-sztöchiometriával. Ennek egyszerű magyarázata az lenne, hogy a PTB-34 két molekulája elsősorban az RRM3 moduljaikon keresztül kötődik az oligonukleotidhoz. Az UCUUCUCU oligonukleotid, amely csak annyiban különbözik a 9 oligonukleotidtól, hogy a 3 'végén nincs 2 nt, nem okoz azonos dimerizációt, megerősítve azt a következtetést, hogy az UCUUC két példányára van szükség egynél több PTB-34 molekula megkötéséhez. az oligonukleotid.

Az UCUUC szekvencia kisebb módosításai az UCUUU és az UCUCU előállításához drámai módon megváltoztatják a kémiai eltolódások eloszlását, nagyobb perturbációs felületet eredményezve, amely kiterjed az RRM4 β-lemezfelületének nagy részére (4. ábra). A poli (A) -val kötődő fehérje (PABP) N-terminális RRM doménpárjának kristályszerkezete a poli (A) -val komplexálva feltárta, hogy az RNS erősen kiterjesztett konfigurációban kötődik, így 6 nt elegendő az RRM pár átfedésére (37) Az UCUUU és az UCUCU pentamerek hasonló kiterjesztett konfigurációkat fogadhatnak el, amikor a PTB-34-hez kötődnek, ezt az értelmezést alátámasztja az a megfigyelés, hogy a kémiai eltolódás változásai 1: 1 RNS: PTB-34 mólaránynál közel voltak a maximálishoz. Mindazonáltal lehetséges, hogy ennek a két oligonukleotidnak az eloszlásának eloszlása a ligandumok áthelyezésének tudható be a két RRM doménen belül a β-lemez felületeken, így a megfigyelt perturbációs felület a különböző kötődési konformációk átlagát jelenti. Az RRM3-on és az RRM4-en átnyúló elmozdulások mintázatát a hexamer (CUCUCU) esetében is megfigyelték, amely nagyon hasonló perturbációs felületet mutat, mint az UCUCU (lásd 1. és 4. ábra). Úgy tűnik, hogy az 5'-végén lévő extra pirimidin (citozin) nem befolyásolta a kötési specifitást.

A két oktamer, az UCCUCUUC és az UCUUCUCU mindegyike tartalmazza az UCUUC motívumot, de az 5'- és a 3'-végén további három pirimidinmaradék található. A kémiai eltolódási zavarok nagysága az UCCUCUUC esetében lényegesen kisebb, mint az UCUUC esetében (2. ábra), ami azt jelenti, hogy az UCCUCUUC kisebb konformációs változásokat vált ki a fehérjében, vagy további kémiai eltolódásokat okoz több konformáció esetén. Tehát úgy tűnik, hogy az UCUUC szekvencia RRM3 kötési specifitása sérült az UCCUCUUC-ban. A másik oktamer UCUUCUCU esetében az RRM3 konformációs zavarának nagysága hasonló az UCUUC-hoz; de emellett az RRM4-ben is jelentős változásokat okoz, amelyek hasonló nagyságrendűek és specifikusak, mint az UCUCU pentameré (4. ábra), amely megegyezik az UCUUCUCU 3'-végén lévő öt maradékkal.

VITA

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönetet mondunk Philip Sharpnak (MIT, USA), Richard Jacksonnak és Ann Kaminskinek (Cambridge-i Egyetem, Egyesült Királyság), Graham Belshamnek (IAH, Pirbright, Egyesült Királyság) és Doug Black-nek (UCLA, USA) a reagensekért és a megbeszélésekért. Ezt a munkát a Wellcome Trust és a biotechnológiai és biológiai tudományok kutatási tanácsának támogatása finanszírozza.