Az SGLT1 által közvetített transzport növekedése magyarázza a vese glükóz újrafelszívódását az euglykaemia genetikai és farmakológiai SGLT2 gátlása során

Orvostudományi Kar, Kaliforniai Egyetem, San Diego, La Jolla, Kalifornia;

Veteránügyek San Diego Healthcare System, San Diego, Kalifornia;

Orvostudományi Kar, Kaliforniai Egyetem, San Diego, La Jolla, Kalifornia;

Veteránügyek San Diego Healthcare System, San Diego, Kalifornia;

Boehringer Ingelheim, Biberach an der Riss, Németország;

Lexicon Pharmaceuticals, Incorporated, The Woodlands, Texas; és

Orvostudományi Kar, Kaliforniai Egyetem, San Diego, La Jolla, Kalifornia;

Veteránügyek San Diego Healthcare System, San Diego, Kalifornia;

Molekuláris növényfiziológiai és biofizikai tanszék, Julius-von-Sachs-Institute, Würzburgi Egyetem, Würzburg, Németország

Orvostudományi Kar, Kaliforniai Egyetem, San Diego, La Jolla, Kalifornia;

Farmakológiai Tanszék, Kaliforniai Egyetem, San Diego, La Jolla, Kalifornia;

Veteránügyek San Diego Healthcare System, San Diego, Kalifornia;

Az újranyomtatási kérelmek és egyéb levelezések címe: V. Vallon, Div. Nefrológia és magas vérnyomás, Depts. Orvostudományi és Farmakológiai Egyetem, Kaliforniai Egyetem, San Diego, és VA San Diego Egészségügyi Rendszer, 3350 La Jolla Village Dr., San Diego, CA 92161 (e-mail: [e-mail védett]).

Absztrakt

Annak megállapításához, hogy az SGLT1 és az SGLT2 okozza-e a vese teljes glükóz-újrafelszívódását, és hogy az SGLT1-közvetített transzport növekedése teljes mértékben megmagyarázza-e az SGLT2 gátlására adott korlátozott glükózurikus választ euglikémiában, az SGLT2 farmakológiai gátlását alkalmaztuk SGLT1 jelenlétében és hiányában egerek és összehasonlították a vese glükóz reabszorpcióját olyan egerekkel, amelyekből hiányzott mind az SGLT1, mind az SGLT2 (Sglt1/Sglt2 -/-). Ezek a tanulmányok betekintést nyújtottak abba a kérdésbe is, hogy a farmakológiai SGLT2 inhibitorok elég magas koncentrációban érik-e el az SGLT2-t a korai proximális tubulusban ahhoz, hogy teljes mértékben gátolják az SGLT2-t in vivo.

Állatok.

Minden állatkísérletet a Útmutató a laboratóriumi állatok gondozásához és használatához (National Institutes of Health, Bethesda, MD), és a helyi intézményi állatgondozási és felhasználási bizottság jóváhagyta. Sglt1 -/- vagy Sglt1/Sglt2 -/- egereket alkalmaztunk, és összehasonlítottuk az életkor és nem szerinti WT egerekkel (3, 17). Az összes egeret alacsony glükózszintű étrenddel etették (%: 52,5 fehérje, 11,3 zsír, 19,9 rost, 6,2 hamu, 0,9 keményítő, 0,3 cukor, 13,8 MJ ME/kg; ssniff Spezialdiäten, Soest, Németország) a glükóz/galaktóz malabszorpciójának megelőzése érdekében és az ezt követő hasmenés az SGLT1 hiánya miatt. Az egereket ugyanabban az állatszobában helyezték el, 12: 12-órás világos-sötét ciklussal és szabad hozzáféréssel a csapvízhez.

Akut és krónikus glükózurikus válaszok a szelektív SGLT2 gátlásra Sglt1 -/- és WT egerekben.

Az empagliflozin egy szelektív SGLT2 inhibitor, amelynek IC50-értéke 3,1 nM az emberi SGLT2-hez és 1,9 nM az egér SGLT2-hez, nagyon szelektív az SGLT2-hez az SGLT1-hez képest az embereknél (> 2500-szoros) és az egereknél (∼5 800-szoros) (4), és farmakológiai eszközként alkalmazták az SGLT2 gátlására. Az empagliflozint Boehringer Ingelheim (Biberach, Németország) biztosította. A következő három vizsgálatsorozatot végeztük el.

Először a WT és az Sglt1 -/- egereket kezeltük szájon át vivőanyaggal vagy empagliflozinnal (0,1–30 mg/kg) és vízterheléssel (30 μl/g testtömeg), hogy megkönnyítsük a későbbi mennyiségi vizeletgyűjtést a metabolikus ketrecekben 3 felett h.

Másodszor, az egereket empagliflozinnal (300 mg/kg diéta) kezeltük 3 hétig, miközben mértük a testtömeg, a vizelet glükóz/kreatinin arányát, a vér glükózszintjét, valamint az étel- és folyadékbevitelt. A táplálék- és folyadékbevitelt meghatároztuk, miközben az egereket szokásos ketreceikben tartottuk. A vizeletet ugyanabban a napszakban kaptuk úgy, hogy felvettük az egereket a reflexes vizelés kiváltására, és tiszta Petri-csészén tartottuk mintavétel céljából. A párosított glükózméréshez a vért farokcsípéssel vettük fel azonnal ébren lévő egerek vizeletgyűjtése után.

Harmadszor, az étrendben a fent leírtak szerint 3 hét empagliflozinnal végzett kezelés után inulin clearance vizsgálatokat végeztek a glomeruláris filtrációs sebesség (GFR), a szűrt glükóz, a vizelet glükóz kiválasztása (UGE) és az FGR meghatározására terminális érzéstelenítésben, a korábban leírtak szerint (13)., 17). Röviden, az egereket tiobutabarbitállal (100 mg/kg ip, 2 μl/g testtömeg; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) és ketaminnal (100 mg/kg im, 2 μl/g testtömeg; Butler, Dublin) altattuk. (OH). A jugularis vénát 2,25% szarvasmarha-szérumalbumin 0,85% NaCl-ban történő folyamatos infúziójához 0,4 ml · h –1 · 30 -1 g testtömeg-sebességgel infúzióval hajtottuk végre. A két vese GFR inulin-clearance általi értékeléséhez [3H] inulint adtunk az infúzióhoz, hogy 5 μCi · h -1,1 30 -1 g testtömeget juttassunk. A glükóz és a [3H] inulin vizelettel történő kiválasztódását kvantitatív vizeletgyűjtéssel értékeltük húgyhólyagkatéteren keresztül, 30 perces periódusokban. Vérmintákat (50 μl) vettek minden periódus közepén egy artériás katéterből, amelyet a vérnyomás és a pulzus monitorozására is használtak. A [3H] inulin koncentrációját a plazmában és a vizeletben folyadék szcintillációs számlálással mértük.

Vese-kiürülési vizsgálatok olyan egereken, amelyek nem rendelkeznek Sglt1/Sglt2-vel.

A vese clearance vizsgálatokat terminális érzéstelenítésben, a fent leírt eljárások szerint végeztük.

Vér- és vizeletelemzés.

Az ébren lévő egerek vércukorszintjét Ascensia Elite XL glükométerrel (Bayer, Mishawaka, IN) határoztuk meg. A clearance vizsgálatok során a plazma glükózt és az összes vizelet glükózt hexokináz/glükóz-6-foszfát dehidrogenáz módszerrel határoztuk meg (Infinity, Thermo Electron, Louisville, CO). Az empagliflozin teljes koncentrációját a plazmában folyadékkromatográfia-tandem tömegspektrometriával határoztuk meg. Megállapítottuk, hogy az empagliflozin átlagos frakcionális fehérje-kötődése az egér plazmájában széles tartományban (legfeljebb> 50 μM) 88,1 ± 0,5% -on állandó. Ez utóbbi információt használtuk a szabad plazmakoncentrációk kiszámításához.

Statisztikai analízis.

Az adatokat átlag ± SE-ként mutatjuk be. ANOVA és párosított vagy párosítatlan diákok t-teszteket végeztünk a párosított adathalmazok és a csoportok közötti statisztikai különbségek elemzésére. P

1. ábra.A nátrium-glükóz kotranszporter SGLT2 gátlóra adott maximális akut glükózurikus válasz kétszeresére fokozódik az Sglt1 -/- és a vad típusú (WT) egerekben metabolikus ketrec vizsgálatokban. A: a vizelettel történő glükóz kiválasztódás (UGE) nagyobb volt az Sglt1 -/- -ben a WT egerekhez képest, a hordozó alkalmazását követően. B: az empagliflozin dózisa függően növelte az UGE-t WT-ben. Kérjük, vegye figyelembe a különböző skálákat y-tengely vs. A. A WT-vel összehasonlítva az empagliflozin által kiváltott UGE balra tolódott, és a maximális válasz megduplázódott az Sglt1 -/- egerekben. A dózis-válasz görbék közötti különbség, amely tükrözi az SGLT1 által közvetített glükóz reabszorpciót WT egerekben, a maximumot ~ 0,4 mg/kg dózisnál érte el (ezt a bal 10 mg/kg-ig terjedő nagyobb dózisok esetén, ami azt jelzi, hogy az SGLT2 inhibitor az SGLT1-hez képest magas szelektivitást mutat ebben a dózistartományban. Ne feledje, hogy az empagliflozin elkezdte növelni a glükóz kiválasztását a WT-ben, amikor az SGLT1-n keresztüli újrafelszívódás elérte a maximumát; n = 4–8/dózis és genotípus. *P

Az SGLT2 inhibitor krónikus glükózurikus hatása 1,5–2-szeresére fokozódik az Sglt1 -/- WT egerekben, ami az élelmiszer- és folyadékbevitel nagyobb növekedésével jár.

Az empagliflozinnal (300 mg/kg diéta) történő kezelés a vizelet glükóz/kreatinin arányának gyors (az első napon belüli) 1,5–2-szeresére emelkedését idézte elő az Sglt1 -/- WT egerekben, ami a a kezelés időtartama (3 hét) (2. ábraA). Az ezzel járó vércukorszint-csökkenés 24 óra elteltével fokozódott az Sglt1 -/- vs. WT egerekben (−33 ± 5 vs −11 ± 5%; P

2. ábra.Az SGLT2 inhibitorra adott krónikus glükózurikus válasz az Sglt1 -/- WT egerekben 1,5–2-szeresére fokozódik, ami az élelmiszer- és folyadékbevitel nagyobb növekedésével jár. Az ábrán az empagliflozin alkalmazásának (300 mg/kg diéta) hatása 3 hétig a vizelet glükóz/kreatinin arányára (A), a vércukorszint abszolút szintje és változásai (B) és az élelmiszer-bevitel változásai (C), folyadék bevitel (D) és a testtömeg (E). Spontán vizeletgyűjtéseket készítettek, és a vért ébren lévő egerekben farokcsípéssel gyűjtötték; az étel- és folyadékbevitelt rendszeres ketrecekben mérték; n = 9–11/csoport. *P

Az SGLT2 inhibitor 44% -ra csökkenti a vese FGR-jét WT-ben, és teljes mértékben kiküszöböli a glükóz visszaszívódását az Sglt1 -/- egerekben.

Az étrendben 3 hét empagliflozinnal végzett kezelést követően (lásd fent) a késői reggel terminális érzéstelenítésben tanulmányozták a vese glükóz kezelését. A szűrt glükózt kiszámítottuk a plazma glükóz és [3H] inulin-clearance termékeként, és összehasonlítottuk a glükóz kiválasztódásával. A 3. ábra a szűrt glükóz és az abszolút renális glükóz kiválasztás közötti kapcsolatot ábrázolja (3. ábraA), abszolút renális glükóz-reabszorpció (3. ábraB) és az FGR (3. ábraC) mindkét genotípusban. Az étrendben az SGLT2 inhibitor empagliflozinnal végzett krónikus kezelés az FGR értékét 64 ± 2% -ban WT-ben és 17 ± 2% -ban határozta meg Sglt1 -/- egerekben (P

Az Sglt1 és az Sglt2 együttes génkiütése teljesen megakadályozta a vese glükóz újrafelszívódását.

Spontán vizelet- és vérgyűjtésekből kiderült, hogy az abszolút vizeletben történő glükózkoncentráció és a vizelet glükóz/kreatinin aránya nőtt, míg a vércukorszint csökkent az Sglt1/2 -/- WT egerekben (1. táblázat). A vizelet glükóz- és kalóriavesztése az Sglt1/2 -/- egerekben alacsonyabb testtömeggel, nagyobb táplálék- és folyadékfogyasztással társult a WT egerekhez képest. A táplálékbevitel növekedése és a korábban jelentett alacsonyabb szérum inzulinszint (12) hozzájárulhat a testtömeg és a vércukorszint egyetlen szerény csökkenéséhez az Sglt1/2 -/- egerekben. A hematokrit, a nátrium és az aldoszteron plazmakoncentrációinak, valamint a vizelet vazopresszin/kreatinin arányának magasabb értékei közvetett bizonyítékot szolgáltattak a hemokoncentrációra az Sglt1/2 -/- -ban a WT egerekhez képest (1. táblázat).

1. táblázat: Plazma- és vizeletparaméterek mind az SGLT2, mind az SGLT1 esetében hiányos egerekben

Az értékek átlag ± SE; n = 9/csoport. WT, vad típusú; SGLT, nátrium-glükóz kotranszporter. A zárójelben szerepel a koncentráció.

# P

4. ábra.Az Sglt1 és az Sglt2 együttes génkiütése teljesen megakadályozta a vese glükóz újrafelszívódását. Az inulin-clearance vizsgálatokat terminális érzéstelenítésben végezték. Az ábrázolt összefüggés a szűrt glükóz és az abszolút renális glükóz kiválasztás között (A), abszolút renális glükóz-reabszorpció (B), és a frakcionált vese glükóz reabszorpciója (C) hím és nőstény Sglt1/Sglt2 kettős kieséses egerekben. Minden pont 1 kiürítési kísérleti periódust jelent. Ban ben A és B, az identitás vonala szaggatott vonalként szerepel az értelmezés megkönnyítése érdekében. Az SGLT2 és az SGLT1 megmagyarázza a vese glükóz visszaszívódását. A WT-vel nem kezelt egerek várható értékeit összehasonlítás céljából ábrázoljuk.

A jelenlegi vizsgálat fő megállapításai az, hogy az SGLT2 és az SGLT1 együttesen képes elszámolni az euglikémiás egerek veséinek összes glükóz-újrafelszívódását. Következetes bizonyítékokat szolgáltatnak farmakológiai és génkiütési vizsgálatok. Figyelembe véve a bemutatott adatokat, valamint az Sglt1 -/- és az Sglt2 -/- egerek közzétett eredményeit (3, 17), azt javasoljuk, hogy kezeletlen, nem cukorbeteg egerek veséjében a szűrt glükóz 97, illetve 3% -a újból felszívódjon az SGLT2, illetve az SGLT1 segítségével . Az SGLT2 gátlás során fokozódik a proximális tubulus SGLT1-expresszáló S2/S3 szegmenseinek glükózterhelése és az SGLT1 által közvetített transzport kompenzatív növekedése következik be. Ez megmagyarázza, hogy az FGR 40-50% -on marad-e az SGLT2 inhibitorra adott válaszként euglikémiás körülmények között.

Összefoglalva, először mutatjuk be, hogy az SGLT2 és az SGLT1 együttesen képes elszámolni a vese glükóz újrafelszívódását az euglikémiás egerekben. Figyelembe véve a bemutatott adatokat, valamint az Sglt1 -/- és Sglt2 -/- egerek közzétett eredményeit (3, 17), arra a következtetésre jutunk, hogy kezeletlen euglikémiás egerek veséjében a szűrt glükóz 97, illetve 3% -a újból felszívódik az SGLT2, illetve az SGLT1 útján . Az SGLT2 genetikai vagy farmakológiai gátlása során az SGLT1 által közvetített transzport kompenzációs növekedése következik be, ami megmagyarázza, miért tartják fenn a vese FGR-értékét 40-50% -on. A tanulmányok bizonyítékot szolgáltattak arra is, hogy az SGLT2 inhibitor empagliflozin el tudja érni és gátolhatja a vesében az összes SGLT2-t, amely hozzájárul a glükóz visszaszívódásához.

A szerzőket a National Institutes of Health Grants R01DK56248, R01HL94728, az UAB/UCSD O'Brien akut vesebetegségek központja NIH-P30DK079337 (V. Vallonnak és S. C. Thomsonnak nyújtotta, beleértve egy kísérleti és megvalósíthatósági támogatást T. Rieg számára); az American Heart Association (Scientific Development Grant 10SDG2610034 T. Riegnek); az amerikai Nefrológiai Társaság Carl W. Gottschalk kutatási ösztöndíja T. Rieg számára; a Manpei Suzuki Diabetes Alapítvány ösztöndíja T. Masudának; a Veteránügyi Minisztérium; és Boehringer Ingelheim (V. Vallonhoz).

V. Vallon az elmúlt 12 hónapban kutatási támogatást kapott az alaptudományi tanulmányokhoz Boehringer Ingelheim és Amylin részéről. E. Mayoux a Boehringer Ingelheim alkalmazásában áll. K. Platt és D. R. Powell a Lexicon alkalmazásában áll.